Abstract
Bakgrunn
Markører som kan diskriminere mellom lat og aggressive prostatakreft står behov for. Vi studerte genet metylering i ikke-neoplastisk vev ved siden av prostata svulst (NTAT) i forbindelse med prostatakreft dødelighet.
Metoder
Fra to årskull av påfølgende prostatakreftpasienter diagnostisert på en patologi avdeling i Torino, Italia, valgte vi 157 pasienter med tilgjengelige NTAT og fulgte dem opp i mer enn 14 år. Vi har innhentet DNA fra NTAT i parafininnstøpte prostata tumorvev og brukte probe real-time PCR for å analysere metylering av glutation S-transferase (GSTP1) og adenomatøs polypose coli (APC) genet arrangører.
Resultater
Utbredelse av APC og GSTP1 metylering i NTAT var mellom 40 og 45%. Den ble forbundet med en metylering i prostatatumorvevet for de samme to genene, så vel som med en høy Gleason poengsum. Hazard ratio (HR) for prostatakreft dødelighet var 2,38 (95% konfidensintervall: 1,23 til 4,61) for APC metylering, og 2,92 (1,49 til 5,74) for GSTP1 metylering i NTAT. Det endret til 1,91 (1,03 til 3,56) og 1,60 (0,80 til 3,19) etter justering for Gleason score og metylering i prostata svulstvev. Sammenligning av 2 vs. 0 metylert gener i NTAT avslørte en HR på 4,30 (2,00 til 9,22), som ble redusert til 2,40 (01.15 til 05.01) etter justering. Resultatene var sterkere i de første 5 årene av oppfølging (justert HR: 3,29, 95% KI: 1,27 til 8,52).
Konklusjoner
Endringer i genet metylering er en tidlig hendelse i prostata karsinogenese og kan spille en rolle i progresjon av kreft. Gene metylering i NTAT er en mulig prognostisk markør for å bli vurdert i kliniske studier
Citation. Richiardi L, Fiano V, Grasso C, Zugna D, Delsedime L, Gillio-Tos A, et al. (2013) metylering av APC og GSTP1 i ikke-neoplastisk vev tilknytning til prostata Tumor og dødelighet av prostatakreft. PLoS ONE 8 (7): e68162. doi: 10,1371 /journal.pone.0068162
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: 26 november 2012; Godkjent: 29 mai 2013; Publisert: 09.07.2013
Copyright: © 2013 Richiardi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble delvis støttet av den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC), og Piedmont-regionen. Finansiører hadde ingen rolle i studien design, innsamling, analyse og tolkning av data, i skriving av manus, og i beslutningen om å sende inn manuskript for publisering
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Prostatakreft er den vanligste svulsten hos menn i mange bestander, med en grov forekomst av 120-130 per 10
5 i Europa og USA [1]. Mer enn 65% av prostata kreft er diagnostisert etter 70 år, og de fleste av disse pasientene vil dø av konkurrerende arrangementer. Forekomsten av prostatakreft har økt dramatisk siden innføringen av prostataspesifikt antigen (PSA) testing på slutten av 1980-tallet [1]. Opportunistisk PSA-basert screening for prostatakreft er utbredt, selv om dens evne til å redusere dødeligheten fortsatt blir debattert. Konklusjonene fra en fersk gjennomgang av US Preventive Services Task Force støttet ikke PSA-basert screening som fordelene ikke ble dømt til å oppveie de skadene [2].
Den høye forekomsten av lat prostatakreft og bruk opportunistiske PSA-basert screening for prostatakreft kan føre til over-behandling. Det er i dag ingen enighet om hvorvidt radikal prostatektomi eller aktiv overvåking bør tilbys som behandling av valg, spesielt når det kommer til pasienter med lav risiko prostatakreft [3], [4]. Det er derfor nødvendig for å bedre forstå de faktorer som bestemmer prostatakreft progresjon, og å identifisere prognostiske markører for aggressiv prostatakreft som kan oppdages ved en første diagnostisk biopsi. En rekke grupper, inkludert våre, har undersøkt epigenetiske forandringer i prostata svulstvev i et forsøk på å identifisere mulige prognostiske markører [5] – [8]. Spesielt har flere studier evaluert tilstedeværelsen av CpG island (klynger av dinukleotider av en cytosin og guanosin) metylering i formidler av noen spesifikke gener i forbindelse med biokjemiske gjentakelse eller dødelighet av prostatakreft. I vår forrige undersøkelse fant vi at APC (adenomatøs polypose coli) metylering i prostata svulstvev var assosiert med en 50% økt risiko for dødelighet av prostatakreft. Noen få studier støtter dette funn [9] – [12], og andre funnet en prognostisk rolle for metylering i andre gener [13], [14]. Metylering av GSTP1 (glutation S-transferase) promoter er den mest omfattende undersøkt epigenetisk endring i prostatakreft. Det kan finnes i mer enn 80% av prostatakreft, med en lavere prevalens i godartet vev [15]; det er sterkt assosiert med Gleason score, men dens prognostisk rolle uavhengig av Gleason score er uklart [5].
I denne artikkelen vi undersøkt om metylering endringer i den ikke-neoplastisk vev i tilknytning til prostata svulst (NTAT) er forbundet med prostatakreft prognose. Prostata tumorer er ofte multifokal, og en rekke studier observerte felt cancerisation (dvs. endringer i normalt vev tilstøtende til tumor) i prostata kreft. Studier som sammenlignet NTAT med benign prostatavevet og /eller cancer vev identifisert endringer i genekspresjon [16] – [20], telomere DNA-innhold [21], mitokondrisk DNA [22], og utbredelsen av metylering i noen gener, inkludert APC [23 ], GSTP1 [24], [25] og RARβ2 [23], [24]. Mekanismene som ligger til grunn for disse endringer er ikke klart forstått (enten utvidet virkninger av kreftfremkallende, sideveis utvidelse av tumor, eller påvirkning av tumoren på tilstøtende vev), men felt cancerisation sannsynlig har klinisk relevans. Men noen av de tidligere studier på dette problemet inkluderer oppfølging for dødelighet, og dermed hindre den evalueringen av den prognostiske betydningen av endringer i NTAT. Denne studien fokuserer på metylering av GSTP1 og APC i den ikke-neoplastisk vev. Den tar sikte på å vurdere om disse molekylære endringene er potensielle kandidater som prognostiske markører ved å evaluere deres tilknytning til dødelighet av prostatakreft.
Pasienter og metoder
Studiepopulasjon
Studiet er nestet i to kohorter av totalt 459 sammenhengende prostatakreftpasienter som gjennomgikk biopsi, radikal prostatektomi eller transuretral reseksjon av prostata (TURP) mellom 1982 og 1988, eller mellom 1993 og 1996, i patologi avdeling av San Giovanni Battista Hospital, Torino , Italia. Detaljer om disse to kohorter har vært publisert tidligere [5]. Vi har innhentet DNA fra lagrede parafininnstøpte prostata tumorvev for alle 459 pasienter. DNA ble så analysert med hensyn til APC, GSTP1 og RUNX3 (Rundt relaterte transkripsjonsfaktor 3) -genet ved hjelp av metylering bisulfitt modifikasjon og metylering-spesifikk PCR [5]. Informasjon om alder, kilde av prostata tumorvev, bolig og tumor grad var tilgjengelig fra patologirapporter. Alle originale diagnostiske lysbilder som svarer til kjæledyrene som brukes for de molekylære analyser ble sporet og re-evaluert av en enkelt uropathologist (LD) for å tildele en uniform Gleason scorer i henhold til gjeldende retningslinjer. Vi har ikke informasjon om PSA-nivåer eller andre kliniske kjennetegn. I første omgang ble de to kohortene fulgt opp frem til 2007 [5], men for denne studien, vi utvidet oppfølging til 8. august 2010. Vi brukte informasjon fra dødsattester å klassifisere dødsårsaken som enten prostatakreft, eller andre årsaker.
Diagnostiske lysbilder fra pasienter i de to kohortene ble analysert for å identifisere NTAT. Vi ekskluderte
a-priori
pasienter fra 1980-tallet som diagnostisk lysbilder inkludert hovedsakelig neoplastisk vev og ble forbundet med betydelige tekniske problemer i å isolere NTAT uten forurensning fra prostata svulstvev. Alle andre vev kilder, nemlig Turps (n = 11) og radikale prostatectomies (n = 23) fra 1980-tallet, og biopsier (n = 164), Turps (n = 45) og radikale prostatectomies (n = 34) fra 1990-tallet, ble inkludert i den foreliggende evalueringen. Den uropathologist identifisert og fremhevet ett område av NTAT på hver diagnose lysbilde. Områder i prostata intraepitelial neoplasi ble ekskludert. Hvis mer enn ett område av NTAT var til stede, patologen valgte lengst fra svulsten. Hvis det var mer enn ett område som møtte dette kriteriet, ble det største området valgt. De valgte partier av NTAT hadde minst 1,5 mm avstand fra tumorceller, i samsvar med tidligere studier på epigenetisk felteffekt i prostatakreft [23]. Dette minimal avstand ble opprettholdt også når vevet materiale var relativt dårlig (dvs. i biopsier); ellers pasienten ble ekskludert fra studien. For objektglass, inkludert fysisk adskilte vevfragmenter (97 pasienter), som begge NTAT og tumorvev, in vivo avstanden mellom fragmentene var ukjent, selv om det mest sannsynlig var større enn 1,5 mm. For noen pasienter, noen av lysbildene inkludert NTAT bare; disse lysbildene ble inkludert i studien.
På slutten av denne prosessen ble NTAT identifisert i 157 pasienter, som alle ble inkludert i studien. Utvelgelsesprosessen fra de opprinnelige 459 pasienter handlet annerledes, avhengig av kilden til svulstvev og på kullet (1980 eller 1990 kohorter). Spesielt valgte vi 91% av den opprinnelige pasienter som gjennomgikk en TURP eller en radikal prostatektomi i en av de to kohortene, 33% av de som gjennomgikk en biopsi i 1990-kullet, og konsekvent med våre a priori kriterier, ingen av dem som gjennomgikk en biopsi i 1980-kullet. Dette utvalget, som i utgangspunktet (dvs. før forekomsten av utfallet), er usannsynlig å ha introdusert skjevheter i associational estimater ([26]).
Fire-fem (10 mikrometer tykk) sekvensielle seksjoner ble kuttet fra parafin-embedded vev av de 157 utvalgte diagnostiske lysbilder. Sektorene overlappet nøyaktig med lysbildene der uropathologist uthevet valgt NTAT området. De ble manuelt dissekert, fjerne den delen av NTAT med en engangs tynt blad, som ble endret mellom hvert fag. DNA ble deretter pakket ut for alle forsøkspersonene
Studiet ble godkjent av etisk komité i San Giovanni Battista sykehus -. CTO /CRF /Maria Adelaide Hospital of Turin (Prot N. 0.021.727, 19 mars 2007. ). Anonymiserte data om genet metylering kan fås ved henvendelse til kvalifiserte forskere med sikte på akademisk, ikke-kommersiell forskning.
Molekylære analyser
Den kommersielle QIAamp ® DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ble brukt for ekstraksjon og rensing av genomisk DNA. Tilstrekkeligheten av DNA ble kontrollert ved hjelp av PCR forsterkning av β-globin husholdningsgenet [27].
De genomiske DNA-prøver, inkludert positive kontroller for metylert og unmethylated status, gjennomgikk sulfitt modifikasjon hjelp Epitect Bisulfite Kit (Qiagen , Hilden, Tyskland).
Etter bisulfitt modifikasjon, en PCR-analyse med spesifikke prober for å bestemme status metylering av APC og GSTP1 aktivatorer ble anvendt. Denne analysen tillater påvisning av metylert cytosin med høy følsomhet (1 metylert cytosin av 10.000 unmethylated cytosines [28]). Hver PCR-reaksjon inneholdt: 1 x PCR-buffer, 5,5 mM MgCl2, 200 uM dNTP, 600 nM av begge primerne, 200 nM og 80 nM av spesifikk probe for metylering av APC og GSTP1 promotere, respektivt, 5 U av Taq 2 ul av modifisert DNA med natriumbisulfitt og destillert H
2O for å oppnå et sluttvolum på 25 pl. Reaksjonen ble utført i et termo (iCycler, BioRad, CA, USA) med følgende PCR-betingelsene: 1,30 minutter ved 95 ° C, 15 sekunder ved 95 ° C, 1 minutt ved et primer-spesifikk glødetemperatur (60 ° C ) for 50 sykluser, og 10 minutter ved 72 ° C. Den universelle metylert DNA CpGenome (Intergen Co., Oxford, UK) ble anvendt som en positiv kontroll. Negative kontroller ble inkludert i alle reaksjoner.
Primere og prober ble valgt basert på publiserte sekvenser (Tabell 1) [29], [30]. Sonder målrettet fire CpG øyer i hvert gen.
Informasjon om APC, GSTP1 og RUNX3 metylering i prostata tumorvev var allerede tilgjengelig fra vår forrige undersøkelse [5]. Men i forrige analyserer vi brukte metylering spesifikk PCR istedenfor probe real-time PCR. Siden sistnevnte metoden har en høyere følsomhet, retestet vi alle prostata svulst vevsprøver som APC eller GSTP1 var unmethylated, for å gjøre resultater fra prostata svulstvev og NTAT mer sammenlignbare. Metylering i RUNX3 ble ikke revurderes fordi analysene i NTAT involvert eneste APC og GSTP1 og potensialet ytterligere forvirrende effekt av RUNX3 metylering i svulstvev var ventet å være begrenset. Konsekvent har svulstvev metylering i RUNX3 ikke blitt vurdert nærmere i denne artikkelen.
Statistiske analyser
Ved hjelp av multivariabel logistisk regresjon, estimert vi prevalens odds ratio av APC eller GSTP1 metylering i NTAT for den valgte egenskaper (Gleason score, metylering i prostata svulst vev).
effekten av NTAT metylering i hver av de to gener på kumulativ dødelighet av prostatakreft ble undersøkt tar hensyn konkurrerende risikoer, og forskjeller i dødelighet ble evaluert med Gray test [31]. Vi brukte Cox proporsjonal fare regresjonsmodeller å anslå hazard ratio (HR) i dødelighet av prostatakreft i forbindelse med metylering i NTAT. Oppfølging varighet ble anvendt som tidsskala og alder ved diagnose ble innført som en kontinuerlig variabel. Både grafiske kontroller og formelle tester, basert på Schoenfeld rester (p 0,14), indikerte at den proporsjonale hazard antakelsen ble oppfylt. APC og GSTP1 metylering i NTAT ble analysert i atskilte modeller, så vel som i en modell undersøke antall metylerte gener, fra 0 til 2. Alle modellene ble utført både ikke justering, og justering for Gleason ballen og tilstedeværelsen av GSTP1 eller APC . metylering i prostata svulstvev
Siden prognostiske markører er nødvendig hovedsakelig for lav- og middels risiko svulster, og ved diagnosetidspunktet før de bestemmer om prostatektomi, gjennomførte vi to subgruppeanalyser begrenset til: i) forsøkspersonene med en Gleason score på 7 eller mindre, eller ii) personer som gjennomgikk biopsi. Vi vurderte også foreningen av metylering i NTAT med kortsiktig dødelighet ved å gjennomføre egne analyser er begrenset til de første 5 årene av oppfølgingen.
Resultater
Utvalgte kjennetegn ved de 157 forsøkspersonene er rapportert i tabell 2. de fleste pasienter ble diagnostisert i 1990, med en median overlevelse på 6,79 år. Av de 128 pasientene som døde under oppfølging, 43 menn døde av prostatakreft. Kilden til vevet ble likt fordelt mellom biopsi, TURP og radikal prostatektomi. Det var en høy forekomst av både APC metylering (82,2%) og GSTP1 metylering (84,1%) i prostata svulstvev.
Utbredelsen metylering i NTAT var 43,9% for APC og 42% for GSTP1. Som oppsummert i tabell 3, er mønsteret av metylering i NTAT korrelert med det i prostatatumorvevet: metylering på en av to gener i prostatatumorvevet var forbundet med metylering av det samme genet i NTAT. Gleason minutter ble også en viktig bestemmende faktor for både APC og GSTP1 metylering i NTAT.
Som vist i figur 1 NTAT metylering både i APC (fig. 1a) og GSTP1 (Fig. 1b) ble forbundet med økt risiko for langsiktig dødelighet av prostatakreft. Hazard ratio for tilstedeværelsen av metylering ble økt med om lag tre-folder (Tabell 4). Disse ble svekket etter justering for metylering i prostata tumorvev, og etter justering for Gleason score (HR = 1,91, 95% KI: 1,03 til 3,56 for APC og HR = 1,60, 95% KI: 0,80 til 3,19 for GSTP1). Analyse av antall denaturert gener i NTAT avdekket en positiv sammenheng med dødelighet av prostatakreft (p-verdi for trend = 0,001): råoljen HR av dødelighet av prostatakreft for 2 vs 0 metylert gener var 4,30 (95% KI: 2,00 -9,22) som falt til 2,40 (95% CI: 01.15 til 05.01) etter justering for både gen metylering i prostata svulstvev og Gleason score (tabell 5). Lignende foreninger ble funnet når analysene ble begrenset til å studere fag med Gleason score på 7 eller mindre. Vi fant ikke bevis for effekt modifisering introdusert av kilden til svulstvev (p-verdi = 0,37). Resultater begrenset til personer som gjennomgikk biopsi er rapportert i tabell 5. Tabell 5 viser også resultatene for analysene begrenset til de første 5 årene av oppfølging. Sammenligningen av 2 vs. 0 denaturert gener ga en rå HR på 5,71 (95% KI: 2,23 til 14,6), og 3,29 (95% KI: 1,27 til 8,52) etter justering for genet metylering i prostata svulstvev og Gleason score
Diskusjoner
Vi har funnet en sterk sammenheng mellom tilstedeværelsen av APC og GSTP1 metylering i NTAT og langsiktig dødelighet og 5-års mortalitet av prostatakreft. Foreningen igjen etter justering for Gleason score og i analyser begrenset til å studere fag med en Gleason score på syv eller mindre, og hos pasienter som gjennomgikk biopsi.
Disse resultatene støtter hypotesen om at DNA hypermethylation er en tidlig hendelse i kreftutvikling som kan oppdages før svulsten blir morfologisk tydelig; de støtter også tanken om feltet cancerisation i prostatakreft og dens rolle i prostata kreft progresjon. Det faktum at mønsteret av metylering er lik i NTAT og i prostatatumorvevet antyder at endringer som finnes i disse vevene er konsekvensen av lignende mekanismer, inkludert en sideveis utvidelse eller påvirkning av svulsten eller diffuse virkninger av de samme kreftfremkallende.
Vi studerte metylering i GSTP1 og APC grunn av deres engasjement i viktige sentrale cellekontrollveier. GSTP1 er en «vaktmester» gen, hindre skader genomisk mediert av kreftfremkallende eller oksidanter. Defekter i «vaktmester» gener (dvs. hypermethylation) kan favorisere mottakelighet for kreftutvikling. Videre GSTP1 kan forstyrre vekst eller overlevelse signalveier ved å opptre som en tumor suppressor gen [32]. Analogt APC er et godt karakterisert tumor suppressor genet, først identifisert i tykktarmskreft, som spiller en viktig rolle i Wnt-signalveien og i inter heft. Den kommuniserer med beta-catenin, et protein som er involvert i cellulære heft og motilitet. Regulering av beta-catenin hindrer gener som stimulerer celledeling og cellevekst [33].
I vår studie, brukte vi dødelighet av prostatakreft som utfallet (i motsetning til biokjemisk tilbakefall), og vi hadde en veldig lang oppfølgingstiden. Vi inkluderte både forsøkspersonene med en lav risiko for prostatakreft, og de med mer aggressiv prostatakreft. Kilden til prostata svulstvev inkludert biopsier, Turps og radikale prostatectomies.
Forekomsten av metylering i NTAT at vi har funnet er lik eller høyere for å at påvist i tidligere studier, som imidlertid vise betydelig inter-studie variasjon [23] – [25], [34], [35]. Alle disse anslagene er ikke direkte sammenlignbare, da studiene brukt ulike protokoller for vev prøvetaking og ulike molekylære teknikker. Våre molekylærbiologiske metoder forsøkte å maksimere følsomheten og vi fulgte en enkel protokoll for å oppnå skiver av NTAT med redusert risiko for forurensning fra prostatatumorvevet. Selv om vi ikke kan utelukke
a-priori Hotell som forurensning skjedde i enkelte prøver, sin frekvens var på det meste, begrenset, noe som er demonstrert ved at sammenhengen mellom metylering i NTAT og prostatakreft dødelighet forble praktisk talt uendret etter justering for metylering i prostata svulstvev. Hadde tilstedeværelsen av metylering i NTAT vært på grunn av forurensning fra metylering i prostata tumorvev, sammenhengen mellom metylering i NTAT og dødelighet av prostatakreft ville blitt sterkt redusert etter justering.
Den største begrensningen med vår studie er mangel på klinisk og patologisk informasjon enn Gleason score. I tillegg studerte vi en befolkning med i gjennomsnitt en høyere dødelighet av prostatakreft enn typisk moderne pasienten serien. Disse begrensningene hemme muligheten for å vurdere den faktiske ekstra prognostiske verdi av metylering i NTAT sammenlignet med for tiden anvendes nomogrammer. Vår studie er dermed i stand til å foreslå en mulig rolle methytlation i NTAT i prostata kreft progresjon, selv om muligheten for kliniske betydningen av disse funnene krever videre undersøkelser i et bedre definert klinisk setting. Vi manglet også informasjon om behandling ved innmelding, noe som tyder på at vår kohort omfatter en heterogen gruppe pasienter, noe som ytterligere vanskeliggjør direkte kliniske betydningen av våre funn. Imidlertid er det faktum at kilden for tumorvev (biopsi, radikal prostatektomi, TURP) var ikke en virkning modifiseringsmiddel tyder på at våre funn ved metylering i NTAT ikke forklares ved forvirrer fra pasientenes heterogeniteter og /eller innledende behandling.
størrelsen på sammenhengen mellom metylering i NTAT og dødelighet av prostatakreft som vi har funnet er sterkere enn det som vanligvis finnes for metylering i prostata svulstvev [5], [8] – [14]. Selv om de to gener som vi har studert ble valgt
a priori
på grunnlag av betydelige bevis på deres potensielle rolle i prostata karsinogenese, er det sannsynlig at ytterligere prognostisk informasjon kunne oppnås ved studiet av et større antall gener .
i konklusjonen, våre funn av hyppig APC og GSTP1 metylering i NTAT og deres tilknytning til dødelighet av prostatakreft støtter forestillingen om at endringer i genet metylering er en tidlig hendelse i prostata kreftutvikling og spiller en rolle i kreft progresjon . Styrken i forbindelse med dødelighet av prostatakreft og det faktum at foreningen fortsatt hos pasienter med en Gleason score under 8 tyder på at metylering mønster i NTAT kan være en mulig prognostisk markør for prostatakreft som skal testes i fremtidige kliniske studier.
