Abstract
For å samtidig analysere mutasjoner og uttrykk nivåer av flere gener på en oppdagelse plattform, foreslo vi en metode kalt «multiplex ligation avhengig sonde forsterkning-digital forsterkning kombinert med hydrogel perle-array» (MLPA- DABA) og har brukt den til å diagnostisere tykktarmskreft (CRC). CRC-celler og vev ble tatt prøver for å ekstrahere nukleinsyre, utføre MLPA med sekvens-merkede prober, utføre digital emulsjon polymerase kjedereaksjon (PCR), og produserer en hydrogel perle-matrise for å immobilisere kulene og danne en enkelt perle lag på matrisen. Etter hybridisering med fluorescerende prober, antallet fargede perler, som gjenspeiler den overflod av uttrykte gener og mutasjonshastigheten, ble tellet for diagnose. Bare røde eller grønne kuler oppstod på flisen i den blandede prøvene, noe som indikerer suksess av enkeltmolekyl PCR. Når en en-kilde prøve ble analysert ved hjelp av blandede MLPA sonder, perler av bare en farge oppsto, noe som antyder den høye spesifisitet av fremgangsmåten i å analysere CRC mutasjon og genekspresjon. I genekspresjon analyse av en CRC-vev fra en pasient CRC mutanten prosenten var 3,1%, og uttrykket nivåer av CRC-relaterte gener som var mye høyere enn for normalt vev. Den svært følsomme MLPA-DABA lykkes i den relative kvantifisering av mutasjoner og genekspresjon av ekspandert celler i avføringsprøver av CRC pasienter på samme brikke plattform. MLPA-DABA kombinert med hydrogel perle-matrise er en lovende metode i den ikke-invasiv diagnostisering av CRC
Citation. Huang H, Li S, Sun L, Zhou G (2015) Digital Påvisning av flere Minoritets Mutants og uttrykk nivåer av flere Colorectal Cancer-relaterte gener ved hjelp av Digital-PCR Sammen med Bead-Array. PLoS ONE 10 (4): e0123420. doi: 10,1371 /journal.pone.0123420
Academic Redaktør: Ken Mills, Queens University Belfast, Storbritannia
mottatt: 17 desember 2014; Godkjent: 23 februar 2015; Publisert: 16 april 2015
Copyright: © 2015 Huang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. The National Science Foundation of China (Grant nr 21305069 og 21275161) gitt støtte for beslutningen om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet. Trenings prosjekt av Unge talenter i Jiangsu-provinsen Maternal and Child Health Hospital (FRC201302) gitt støtte til datainnsamling og analyse. Jiangsu-provinsen Clinical Science Teknologi Special Project (SBL2012061) gitt støtte til studiedesign
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste kreftformen hos menn og den nest vanligste kreftformen hos kvinner over hele verden [1]. I Kina er CRC en av de mest vanlige ondartede kreftformer, og har en høy dødelighet. Tradisjonelt bruker CRC diagnose Dukes klassifiseringssystemet, som kategoriserer kreften inn i etapper A, B, C eller D. De relaterte data viser at 5-års-overlevelse av postoperative CRC pasienter er 81-85% i trinn A, 64- 78% i trinn B, 27-33% i trinn C, og 5-14% i trinn D; derfor kan tidlig diagnostisering av CRC og påfølgende behandling effektivt øke overlevelse. Tidlig screening tester er nøkkelen til tidlig diagnostisering av CRC og forbedring av overlevelse [2]. CRC screening testene inkluderer prosedyrer som for eksempel en koloskopi, fekal okkult blod test, og fibersigmoidoscopy [3]. Selv om disse metodene har gode kliniske resultater, har de også ulemper. For eksempel kan de invasive teknikker lett føre til blødninger og perforasjon, og sensitivitet og spesifisitet av noen metoder er utilstrekkelig; Derfor er nødvendig for tidlig diagnostisering av CRC utvikling av en enkel, ikke-invasiv metode med høy sensitivitet og spesifisitet.
De siste raske fremskritt innen molekylær biologi gjør det mulig å utføre begynnelsen av ikke-invasiv diagnose av CRC ved følsomt å analysere ekspandert cellene i avføringsprøver av CRC pasienter. Fordi onkogenesen av CRC, som involverer interaksjon av multiple gener, er en flertrinnsfremgangsmåte [4], slik som aktivering av proto-onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener, enkelt-genet deteksjonsfremgangsmåte misdiagnoses ofte sykdommen; Derfor, er den kombinerte påvisning av multiple gener nyttig i å øke frekvensen av positive diagnoser av sykdommen. Forekomst og utvikling av CRC følger ofte genmutasjon og endringer i genuttrykk [5]; Derfor innebærer CRC diagnose påvisning av disse aktivitetene [6-11]. Selv om DNA-sekvenseringsteknikken er en klassisk metode som genmutasjoner er oppdaget, kan det ikke analysere prøver hvor antall mutasjoner er 20% [12]. For detektering av genmutasjoner på lave nivåer i de tidlige stadier av kreft, ble en EndoV /ligase-baserte mutasjon skannemetode utviklet med en påvisningsgrense på 1,0% [13]; Imidlertid er fremgangsmåten ikke i stand til å detektere mutanter (muts) på et mye lavere nivå på grunn av sin kvantitativ analyse basert på det analoge signalet. Selv om den digitale analysemetode, kalt strålte [14,15], ble utviklet for å detektere muts på en ultra-lavt nivå (0,1% av muts), flowcytometer som brukes i fremgangsmåten er kostbar og bare ett gen blir detektert i en prøve. På grunn av sin høye følsomhet og høy spesifisitet, er kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) som anses å være den beste metoden som genekspresjon kan analyseres; imidlertid, på grunn av det begrensede antallet fluorescerende markører, er qPCR ikke egnet til å analysere multiple gener i den samme reaksjon. Selv om DNA microarray kan samtidig analysere flere gener, problemet er fortsatt en lav deteksjonsgrense og dårlig kvantitative ytelse for å analysere kreftrelaterte gener uttrykkes på lave nivåer i tidlig diagnostisering av CRC. Dessuten, selv om den kombinerte analysen av mutasjoner og kreftrelatert genekspresjon kan øke nøyaktigheten og følsomheten av CRC diagnose, nesten alle de rapporterte teknikker for anvendelse til bare ett felt til å detektere enten mutasjoner eller gen-ekspresjon.
Her vi foreslått en metode kalt «multiplex ligation avhengig sonde forsterkning-digital forsterkning kombinert med hydrogel perle-array» (MLPA-DABA) der mutasjoner og uttrykk nivåer av flere gener ved lave nivåer kan samtidig analyseres på en oppdagelse plattform. Basert på tidligere arbeid [3,16,17], teknisk plattform av MLPA-DABA ble utviklet ved å forbedre følgende tre aspekter: For det første, MLPA, i stedet for konvensjonell PCR eller target beriket multipleks PCR (Tem-PCR), ble brukt til å forberede maler med felles mål; sekund, mutasjoner og uttrykk av multiple gener, i stedet for bare det ene eller det andre, ble samtidig målt med den tekniske plattformen ved å endre utformingen av spesifikke MLPA sonder; tredje, fargestoff-fritt og genspesifikke prober MLPA, i stedet for høye kostnader og genspesifikke fluorescerende prober, ble brukt til å merke flere muts og kreft-relaterte gener. Problemene med usikre antall dye-merket deoksynukleotidtrifosfatene (dNTP) innlemmet i et DNA-tråden og konkurransen mellom forlengelsesreaksjonen og hybridisering reaksjon som nevnt i tidligere arbeider ble løst; derfor ble den høye spesifisitet, lav pris, og høy stabilitet av fremgangsmåten oppnådd. Metoden ble vellykket anvendt til CRC diagnose ved å analysere uttrykket av fem gener (
β-aktin
,
C-myc
,
H-ras
,
CD44v6
,
Cox-2
, og
N-ras
) og tre mutasjon loci på APC gener (kodon 1406, 1338 og 1356) i CRC vev, CRC celler, og krakk prøver fra CRC pasienter. Resultatene viser at metoden kan være et kraftig verktøy i tidlig diagnostisering av CRC.
Materialer og metoder
Reagenser
N-hydroksysuccinimidester (NHS)-aktivert sepharose HP affinitetskolonne og dNTP ble kjøpt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Taq
DNA polymerase var fra Promega (Madison, WI). DC 5225C Formulering Nødhjelp og DC 749 Fluid ble kjøpt fra Dow Chemical Co. (Midland, MI). AR20 Silicone Oil ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Super III revers transkriptase ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Amplicase ble kjøpt fra Epicenter (Madison, WI). Andre kjemikalier var av en kommersielt ekstra ren klasse. Alle løsninger ble tilberedt med avionisert og sterilisert vann.
Sekvenser av primere og prober
aminmodifisert primer (5′-NH
2-TTT TTT TTT TCC ATC TGT TGC GTG CGT GTC-3 «) ble syntetisert av Takara Bioteknologi Co, Ltd (Dalian, Kina). Alle de andre primere ble syntetisert ved Invitrogen Inc. (Shanghai, Kina). Et par vanlige primere, felles-1 (5»-CCA TCT GTT GCG TGC GTG TC-3 «) og felles-2 (5′-CCT TGG CAA TCA GGC GAA TC-3′) ble anvendt for å amplifisere MLPA produkter. De genspesifikke MLPA prober for påvisning av mutantene ble oppført i tabell 1. genspesifikke MLPA prober for analyse av genekspresjon var oppført i tabell 2. fluorescens-prober for perle-dekoding var 5»-Cy3-TGC CTT GTC ATT CGG- 3 «og 5′-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3». Det motsatte-transkripsjon primer var oligo (dT) 15.
Mal forberedelse
Prøver av CRC vev og CRC celler ble hentet fra Jiangsu Cancer Hospital (Nanjing, Kina) . Høsting av vev, celler og avføring fra deltakerne ble godkjent av etisk komité i First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University og deltakerne gitt skriftlig informert samtykke. Totalt RNA ble ekstrahert fra vev av CRC pasienter og CRC celler ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger. Det ekstraherte RNA ble bestemt ved gel elektroforese utført på en 2% agarosegel og en UV-VIS spektrofotometer (Naka Instruments, Japan). Den første tråd cDNA ble syntetisert fra oligo (dT) 15 primere ved å bruke Super III revers transkriptase, i henhold til produsentens anvisninger.
Genomisk DNA ble ekstrahert fra vev og celler ved fenol-kloroform ekstraksjon. Før ekstraksjon, ble cellene vasket to ganger med normal saltløsning og vev ble skåret ut og homogenisert i 1 ml fysiologisk saltvann. Den ekstraherte DNA ble fortynnet i TE buffer og bestemmes av UV-vis spektrofotometer.
Krakk fra en CRC pasient i Jiangsu Cancer Hospital (Nanjing, Kina) ble homogenisert i ASL buffer og ekstrahert med en QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Tyskland).
Multiplex ringsavhengig forsterkning sonde-digital forsterkning
Etter tilsetning av parene av sonder (100 fmol av hver), og 1,0 U Ampligase, ble reaksjonsblandingen som inneholdt DNA eller cDNA-prøvene ble inkubert ved 94 ° C i 1,0 minutter, fulgt av 60 ° C i 4,0 min; denne syklusen ble gjentatt 10 ganger.
Digital emulsjon PCR (emPCR)
De pakket perler (10 mikromol NHS sider /ml) fra 1 ml NHS-aktivert Sepharose HP affinitetskolonne ble fjernet fra kolonnen og spredt i isopropanol. Etter å ha vasket med 1 mM HCl for å grundig eliminere isopropanol, ble kulene aktivert med 1 mM iskald HCl ved 4 ° C i 1 time. Deretter ble de aktiverte perler og amin-modifiserte primere (10 mM) inkubert i bindingsbuffer (0,5 M NaCl, 0,2 M NaHCO
3, pH 7,5) ved 20 ° C i 5 timer. Kulene ble holdt borte fra sedimentering i inkubasjonen. Etter inkubering ble primer-immobiliserte perler lagret ved 4 ° C til bruk.
System ifølge emPCR blanding inneholder oljefase og vandig fase. Den vandige fase ble delt i to deler, Mock amplifikasjon blanding og PCR-reaksjonsblandingen. Ligerings produkter ble brukt som templater for PCR. Først, for å gjøre emulsjon mer stabil, 225 mL av mock forsterkning mix (1 × Promega
Taq
Buffer, 2 mM MgCl
2, 0,1% BSA og 0,01% Tween-80) ble homogenisert med 375 mL av emulsjon olje (40% (vekt /vekt) DC 5225C Formulation Aid, 30% (vekt /vekt) DC 749 Fluid og 30% (vekt /vekt) AR20 Silicone Oil) av et magnetisk microstir-bar ved 1200 rpm i 5 min i en 5 ml ampulle. For det andre 200 ul av PCR-reaksjonen mix (1 × Promega
Taq
Buffer, 2 mM MgCl
2, 0,5 mM dNTP blanding, 0,125 U /ml
Taq
DNA polymerase, 0,1 % BSA, 0,01% Tween-80, 0.06 mM felles-2-primer og 0,6 mM hver av felles-1 primere), primer-belagte kuler og malene ble tilsatt i glasset og deretter flasken ble omrørt ved 1500 rpm i 3 min for å blande emulsjonene også. Emulsjonene ble alikvotert med 100 ul hver i 8 PCR-rør. For det tredje, termocykling ble utført på PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Inc.) Ved en initiell denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, og deretter 40 sykluser (94 ° C, 58 ° C og 68 ° C i 30 sek , 60 s, 90 s hver) for forsterkning og 13 sykluser (94 ° C og 58 ° C i 30 s, 360 s hver) for hybridisering og forlengelse.
Digital perle regner med egenprodusert hydrogel bead matrise
etter forsterkning, ble emulsjonene brutt ned ved å legge isopropanol. Emulsjonene med isopropanol ble filtrert gjennom en 25 mm diameter mikroporøs membran, og kulene ble fanget på membranen. Etter at perlene på membranen var ønsket med isopropanol, 80% etanol i oppløsning (4,0 mM Tris, pH = 7,5) og 0,1% Tween 20, ble de gjenfunnet i 1,0 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). DNA (dsDNA) immobilisert perler ble behandlet med 0,1 mM NaOH i 5,0 minutter for å fremstille enkelt-trådet DNA (ssDNA) immobilisert perler. Etter at supernatanten var fjernet, ble kulene vasket to ganger med DDH
2O og lagres i oppløsningen.
akryl-modifiserte objektglass ble fremstilt i henhold til Xiao et al [18]. De objektglass (Shanghai Jinglun Industrial Glass Co, Ltd, Shanghai, Kina) ble renset ved bløtlegging i 10% vandig salpetersyre for 2,0 t.
hydrogel perle-matrise ble fremstilt ved tilsetning av perlene til en akrylamidmonomer-løsning og på akrylmodifisert slides og umiddelbart dekker med et dekkglass (20 x 20 mm) for å holde enkelt-perlesjikt. Etter kopolymerisasjon, som ble utført ved romtemperatur i 10 minutter, ble dekkglasset forsiktig fjernet fra hydrogelen. Fluorescens sonder (1,0 pmol /ul) ble hybridisert med ssDNA på perlene i polyakrylamidgelen ved 40 ° C i 1,0 timer. For å fjerne den frie og umake prober fra gelen chip, ble sonde-hybridiserte lysbilder utsatt for elektroforese på 4,0 ° C under 50 V for 5,0 min i 1 × Tris /borat /EDTA buffer. Etter vasking med vann, ble bilder av lysbildene gjort ved hjelp av LuxScanner (CapitalBio Corporation, Beijing, Kina). Til slutt, skanning bilde av perle-matrise var innspill til GenePix Pro 4.0 for å telle farge perler på tabellen.
Diskusjon
Resultater og
Prinsipp
Rettet mot samtidig analyse av multiple mutasjoner og ekspresjonen av multiple gener, ble en target-anrikede MLPA kombinert med kule-baserte emPCR for multiplex enkelt-molekyl forsterkning. Protokollene av analysen er vist i figur 1 og omfatter følgende trinn:. Mal forberedelse, emulgering, single-molekylære forsterkning, demulgering, utarbeidelse av hydrogel perle-array, probe hybridisering, og perle telling
Analysen består av følgende tre trinn: (1) MLPA for å forberede maler tagget med universelle sekvenser; (2) emulsjon (em) PCR for fremstilling av kuler belagt med amplikonene generert fra et enkelt molekyl av MLPA produkter; og (3) vulst dekoding ved å hybrid universale Cy5-merkede prober og universelle Cy3-merkede prober. Hvis en perle vises som grønn, bør amplikonene belagt på perlen bli forsterket fra MUT maler eller mål av CRC-relaterte gener, mens en rød perle betyr villtype maler eller mål for husholdningsgener.
for det første DNA og cDNA ble brukt som mål i MLPA å forberede brønnrammene som er kvalifisert for emPCR, som er en ekstremt presis digital PCR-teknikken hvor det er en reaksjon for å amplifisere en molekyl for å realisere enkelt-molekyl forsterkning. I mutasjonspåvisning, må ligering tre prober for en loci, nemlig den «venstre sonde», «høyre sonden 1», og «riktige sonde 2». Det er to deler i den venstre sonden og tre deler i hver av de to rette prober. De to delene i det venstre sonden er en vanlig halen på 5′-enden for tilførsel av et vanlig grunnings område som trengs i den påfølgende PCR-amplifisering og en gen-spesifikk sekvens ved 3′-enden for gløding av målet. De riktige prober inneholder et gen-spesifikk sekvens med en mutasjon område av interesse ved den første base i 5′-enden, en kilde-spesifikk sekvens for hybridisering av fluorescerende prober i midten, og en felles priming-sete ved 3′-enden. Høyre prober 1 og 2 svarer til den MUT og villtype (WT), respektivt. I genekspresjonsanalyser, to sonder, venstre og høyre sonde sonde ble anvendt i ligeringsreaksjonen. Den venstre sonde inneholder en felles priming området og et gen-bestemt rekkefølge. Den høyre sonde inneholder en gen-spesifikk sekvens ved 5′-enden, en kilde-spesifikk sekvens i midten, og en felles priming-sete ved 3′-enden. Deretter ble enkelt-molekyl amplifisering utføres i vann-i-olje-emulsjon. Fordi både perler og maler fra MLPA fortynnes slik at ikke mer enn ett mål molekyl og en perle er til stede i hver avdeling, beaded amplikonene generert fra emPCR stammer fra nøyaktig ett mål molekyl. Etter demulgering, ble perlene oppsamlet og fiksert som en enkelt-lags vulst (40 um tykt) på en hydrogel perle-array. Kulene forsterkede fra husholdningsgenet (eller WT amplikoner) ble dekodet ved hybridisering av 3′-Cy5-merkede prober, mens perlene amplifisert fra CRC-relaterte gener (eller muts) ble dekodet ved hybridisering av 3′-Cy3-merkede prober; Derfor kan antallet av røde (Cy5 fargestoff) perler, og antallet grønn (Cy3 fargestoff) perler reflekterte ekspresjonsnivåene av husholdningsgenet (eller WT amplikoner) og CRC-relaterte gener (eller muts), respektivt. Kostnaden av analysen blir dramatisk redusert ved hjelp av vanlige fluorescerende prober for å dekode de kuler belagt med amplikonene av muts, WT amplikonene, husholdningsgenet, og CRC-relaterte gener.
Spesifisitet av perle-matrise
spesifisiteten av hydrogelen brikken plattformen for å analysere de målene fra forskjellige kilder, ble undersøkt. CDNA av
β-aktin
ble ligert med genet spesifikke MLPA sonder som inneholder tag-sekvens for koding Cy5-stemplet sonder for å produsere MLPA produkter av
β-aktin
. De MLPA produkter ble så forsterket ved hjelp av to vanlige primere og 5’end av en primer ble modifisert med biotin. Etter at biotin-modifisert PCR-produktene ble immobilisert på streptavidin-modifiserte perler ble vulsten-matrise fremstilt og dekket med Cy5- og Cy3-stemplet prober for analyse. Som vist i figur 2A, er det bare røde perler på bildene. Tilsvarende, når cDNA av CRC-relaterte gener ble ligert med den genspesifikke MLPA prober inneholdende kodesekvensen for koding Cy3-stemplet prober, bare grønne kuler kan bli skannet (figur 2B). Resultatene indikerte at elektroforese effektivt fjerner de umake sondene på perlene «overflate eller de øvrige sonder inne i hydrogelen. Den hybridisering mellom fluorescerende prober og mål inne i hydrogel er bestemt. Plattformen av vulsten-matrisen kan brukes til nøyaktig å skille målene fra forskjellige kilder i MLPA-DABA.
Både Cy5-merkede og Cy3-merkede prober ble tilsatt til perle-array for hybridisering, og elektroforese ble utført for å fjerne feilaktige og frie prober. Endelig er de tre fotografier av panel A og panel B tatt ved hjelp av tre typer fluorescens kanaler, både i Cy3 Cy5 og kanaler, bare Cy3 kanal, og bare Cy5 kanal, henholdsvis.
Spesifisitet av MLPA -DABA for å analysere mutanter og genekspresjon
for å analysere genuttrykk, brøkdel av CRC perler feilaktig scoret i 100% cDNA av
β-aktin Hotell og brøkdel av renholds perler feilaktig scoret i 100 % cDNA av CRC genene ble bestemt. Etter hybridisering og elektroforese, ble bildene tatt av perler belagt med 100% fragmenter fra
β-aktin Hotell og 100% fragmenter fra CRC-relaterte gener; resultatene er vist i figur 3A og 3B. Det var nesten ingen feilaktig scoret perler funnet i enten test; Derfor er MLPA-DABA bruk meget spesifikt for å analysere uttrykk for CRC-relaterte gener i CRC
De prøvene var 100% mål for
β-aktin product: (A).; 100% mål for CRC-relaterte gener (b); 100% WT-DNA av kodon 1338 i normalt vev (C); og 100% MUT DNA av kodon 1338 i SW480-celler (D). Syv par av prober av CRC-relaterte gener og
β-actin
ble tilsatt til MLPA reaksjonsblandingen (A og B), og alle sonder av kodoner 1406, 1338 og 1356 ble anvendt til de MLPA reaksjoner (C- og D). Etter PCR-emulsjon, både de Cy5-merkede og Cy3-merkede prober ble tilsatt til perle-array for hybridisering.
SW480-celler (human CRC celler) med en homozygot mutasjon ved kodon 1338 (4012 C T) ble valgt som MUT mål. Normalt vev anvendt som WT målet ble samtidig analysert. Fraksjonen av feilaktig skåret perler i en 100% MUT DNA eller i et 100% WT-DNA ble påvist. Resultatene er vist i figur 3C og 3D viser at prosentandelen av feilaktig skåret perler (inkludert urenheter) i begge er nesten 0, noe som tyder på at fremgangsmåten er også spesifikk for påvisning mutasjon i CRC.
Kvantifisering av to gener ved hjelp MLPA-DABA
for å bekrefte muligheten for å bruke MLPA-DABA å analysere ulike gener, ble to housekeeping gener brukes som et eksempel. I et rør, ble målene for
p-aktin
ligert med MLPA sonder som kan hybridisere de Cy5-stemplet sonder, mens målene for
GAPDH
ble ligert med MLPA sonder som kunne hybridiserer de Cy3-stemplet sonder. Etter digital amplifikasjon av ligeringsprodukter og sonde hybridisering av kulene, ble de røde og grønne kuler telles. Resultatene er vist i figur 4. Antall røde perler og grønne perler gjenspeiler uttrykket nivåer av
β-aktin
og
GAPDH
, respektivt. Ved å telle de fargede perler på brikken, ble det funnet at forholdet mellom ekspresjonen av
β-actin
med den i
GAPDH
var nesten 1: 1, noe som tyder på at de to husholdningsgener var hell oppdaget. Det var ingen gule kuler, noe som indikerer at enkelt-molekylære amplifisering ble oppnådd ved å holde ikke mer enn ett målmolekyl i hvert kammer, og at det er mulig at MLPA-DABA kan analysere gener fra forskjellige kilder.
A rød perle stammer fra ett molekyl av
β-actin
og en grønn perle stammer fra ett molekyl av
GAPDH
.
Application
for å demonstrere anvendelsen av MLPA-DABA i deteksjon av kliniske prøver, ble de relative ekspresjonsnivå av fem CRC-relaterte gener og muts både i tumorvev og tilstøtende normale vev fra CRC-pasienter detektert. De typiske skannede bilder av en pasient er vist i figur 5. De relative ekspresjonsnivåer av de totale fem CRC-relaterte gener til
β-aktin
i tumorvevet er mye høyere enn de i den tilstøtende normalt vev (Fig 5A og 5B). Alle perlene var rød i DNA-analyse av den tilstøtende normalt vev (figur 5C), som indikerer at de var MUT negativ, mens de grønne kuler (figur 5D) indikerer at de var MUT positiv i tumorvevet. Den MUT satsen var 3,1%, beregnet ved forholdet av grønne kuler til røde perler. Signifikante forskjeller i mutasjon og genuttrykk mellom svulstvev og tilstøtende normalt vev viste at MLPA-DABA kan brukes for tidlig diagnostisering av CRC med lavnivå mutasjoner og lav overflod av genuttrykk.
( A) Expression analyse av CRC-relaterte gener i tilstøtende normalt vev; (B) uttrykk analyse av CRC-relaterte gener i svulstvevet; (C) mutasjon påvisning av tilstøtende normalt vev; (D) mutasjons påvisning av tumorvevet. Røde perler stammer fra cDNA av
β-aktin Hotell og villtype DNA; grønne perler stammer fra cDNA av CRC-relaterte gener (
C-myc
,
H-ras
,
N-ras
,
CD44v6
, og
Cox-2
) og mutant DNA.
for å vurdere muligheten for MLPA-DABA i ikke-invasiv påvisning av kliniske prøver, ble avføring fra seks CRC pasienter brukt. Som vist i tabell S1, var MUT positive og 83% av de seks pasientene CRC (5/6) ble testet med en høy ekspresjon av CRC-relaterte gener i noninvasive analyser av bare 50% av de seks pasientene CRC (3/6) avføringsprøver. Den totale oppklaringsprosenten av MLPA-DABA er 83%. Basert på deteksjonsresultater og Dukes «stadium av pasienter, er det konkludert med at vår metode er lovende i tidlig diagnostisering av tykktarmskreft fordi deteksjonsraten av pasienter på et tidlig stadium (Dukes» etapper A og B) er så høy som 75% (3/4). Vi tror at deteksjonsraten kan økes ytterligere ved å øke størrelsen av panelet av mutasjonen loci og CRC-relaterte gener. Typiske resultater fra MLPA-DABA hjelp av en av avføring av CRC-pasienter, og som fra en frisk frivillig er vist i figur 6. krakk fra den CRC pasient ble påvist å være MUT positiv med en høy ekspresjon av CRC-relaterte gener, mens avføring fra friske frivillige ble påvist å være MUT negativ med et lavt uttrykk for CRC-relaterte gener
(A) Mutasjon deteksjon av avføringsprøve fra CRC pasienten.; (B) analyse av CRC relatert genekspresjon av avføringsprøven fra CRC pasienten; (C) Mutasjon påvisning av avføringsprøven fra friske frivillige; (D) analyse av CRC-relaterte genuttrykk av avføringsprøve fra friske frivillige.
Konklusjon
I denne studien en sensitiv og spesifikk analyse for digitalt oppdager muts og uttrykk nivåer av multiple gener på en hydrogel perle-matrise ble utviklet. Ved å kombinere MLPA og kulebaserte emPCR, enkelt-molekyl amplifikasjon med felles primerne anvendt for alle mål ble oppnådd. MLPA ble anvendt ved utarbeidelsen av maler med universelle endene fra DNA og cDNA prøver fra ulike kilder, noe som favoriserer multiplex forsterkning. I motsetning til analog forsterkning i konvensjonelle PCR-reaksjoner, 10
6 individuelle amplifikasjonsreaksjoner kan utføres samtidig i ett rør med vulst-baserte emPCR
perler er immobilisert som et enkelt lag på en hydrogel brikke til. full høy gjennomstrømming gjenkjenning. Sammenlignet med vanlige metoder for anvendelse av akrylamid i elektroforese for å separere proteiner og nukleinsyrer, bruker MLPA-DABA polyakrylamidgel for å legge kulene. Prepolymeren av akrylamidmonomer med perler er stiplet på akryl-modifisert glass og polymeriseringen blir utført for å legge kulene på overflaten av glasset brikke med ammoniumpersulfat og tetrametyletylendiamin. På grunn av den høye permeabilitet av geler med en tre-dimensjonal porestruktur, ikke samsvarer sonder og andre urenheter er innebygd i den porøse strukturen kan fritt passere gjennom strukturen; derfor kan probene og urenhetene bli effektivt eliminert ved elektroforese. Den høye ytelsen til hydrogel overvinner problemene med andre metoder, for eksempel den høye bakgrunnsstøy fra utilstrekkelig vasking av de øvrige sonder. I MLPA-DABA, ble bakgrunnen betydelig redusert; senere, sensitivitet og spesifisitet av MLPA-DABA ble kraftig forbedret. Videre fordi polyakrylamidgel har amfifile og uladede egenskaper, er det biokompatibilitet bidrar til hybridisering av sonder og mål i en løsning-lignende miljø.
På grunn diagnostisering av sykdommer er gjort basert på generell informasjon av flere gener, det er ikke nødvendig å måle en genetisk MUT, eller ekspresjon av et spesifikt cancer-relaterte genet. Et panel av flere gener som én diagnostisk biomarkør viser en mer markant forskjell enn enkeltgener. I MLPA-DABA, ble én type fluorescerende signal med en farge brukes til å reflektere flere muts og uttrykk for flere CRC-relaterte gener. Både generell informasjon om den totale ekspresjon av kreft-relaterte gener og et samlet MUT hastighet oppnås ved å beregne forholdet mellom det totale antall grønne kuler fra forskjellige kilder for antall røde perler. Det er bemerkelsesverdig at de viktigste trinnene i prosessen med MUT deteksjon og prosessen med analyse av genuttrykk er identiske; Derfor er MLPA-DABA stand til å analysere både samtidig på den samme brikke plattformen, noe som er meget ønskelig i kreftdiagnose. Bruken av MLPA-DABA, som har fordelene av å være tumorspesifikke; krever enkel prøvetaking, har stor nøyaktighet; er ikke-invasiv til kroppen; og krever ingen diett forberedelser før testen sammenlignet med andre ikke-invasive metoder, slik som koloskopi og fekal okkult blod test, er lovende for å analysere ekspandert celler i avføringsprøver fra CRC pasienter og vil bli et kraftig verktøy for ikke-invasiv og tidlig diagnostisering av CRC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Detaljer og gjenkjenning resultatene av 6 pasienter ved hjelp av avføring som utgangsmateriale
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123420.s001 product: (PDF)
