Abstract
Ubiquitin-aktig med PHD og ringfinger domener 1 (UHRF1), som en epigenetisk regulator, spiller viktige roller i tumorigenesis og kreft progresjon. KiSS1 fungerer som en metastase suppressor i ulike kreftformer, og epigenetisk stanse all KiSS1 øker metastatisk potensial av kreftceller. Vi har derfor undersøkt om UHRF1 fremmer blærekreft celle invasjon ved å hemme KiSS1. Uttrykket nivåer av UHRF1 og KiSS1 ble undersøkt av kvantitativ real-time PCR-analyse
in vitro Hotell og
in vivo
. Rollen til UHRF1 i regulering av blærekreft metastase ble evaluert i blærecancercelle. Vi fant at UHRF1 nivåer er oppregulert i de fleste kliniske prøver av blærekreft sammenlignet med sammenkoblede normale vev, og UHRF1 ekspresjonsnivåene blir signifikant økt i primære tumorer som deretter metastasized sammenlignet med ikke-metastatiske tumorer. Tvunget uttrykk for UHRF1 fremmer blærekreft celle invasjon, mens UHRF1 knockdown reduserer celle invasjon. Overekspresjon av UHRF1 øker metylering av CpG nukleotider og reduserer ekspresjon av KiSS1. UHRF1 og KiSS1 uttrykk nivå er negativt korrelert
in vivo Hotell og
in vitro
. Knockdown av KiSS1 fremmer blærekreft celle invasjon. Viktigere, tvunget uttrykk for KiSS1 delvis opphever UHRF1-indusert celle invasjon. Disse dataene viste at oppregulert UHRF1 øker blærekreft celle invasjon av epigenetisk stanse av KiSS1
Citation. Zhang Y, Huang Z, Zhu Z, Zheng X, Liu J, Han Z, et al. (2014) oppregulert UHRF1 Fremmer blærekreft Cell invasjon av epigenetiske stanse av KiSS1. PLoS ONE 9 (10): e104252. doi: 10,1371 /journal.pone.0104252
Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences sentrum, USA
mottatt: 02.04.2014; Godkjent: 07.07.2014; Publisert: 01.10.2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Menneske blærekreft rangerer andre i frekvens av urin kreft [1], og ca 50% av pasientene diagnostisert med muskel-invasiv blærekreft (MIBC) utvikle fjernmetastaser i lungene og leveren, noe som resulterer i fattige fem-års overlevelse [2]. Foreløpig er fremskrittene i egnet terapi for å øke overlevelsen begrenset fordi de underliggende mekanismene som forårsaker kreft metastase ikke er godt forstått. Derfor er det meget viktig å avdekke den molekylære mekanisme av blærekreft metastase for utvikling av effektiv terapi.
UHRF1, også kalt ICBP90 hos mennesker og Np95 i mus, er en multidomain protein, noe som er nødvendig for regulering av epigenetisk genekspresjon og kromatin modifisering [3], [4]. UHRF1 øker G1 /S overgang som mål for transkripsjonsfaktoren E2F [5], og endringer i ekspresjonsnivået UHRF1 regulerer cellesyklusprogresjon, celleproliferasjon og cellevandring [6], [7]. UHRF1 blir oppregulert i flere typer kreft, og overekspresjon av UHRF1 er involvert i tumordannelse og progresjon av kreft [8], [9]. Flere rapporter har vist at UHRF1 kan være en viktig biomarkør for diagnose og prognose av kreft [5]. Unoki
et al
vist at UHRF1 overekspresjon er assosiert med karakteren og stadium av blærekreft [10]. Overekspresjon av UHRF1 i blærekreft er også korrelert med økt risiko for kreft progresjon etter transuretral reseksjon [10]. Wang
et al
viste at UHRF1 er overuttrykt i tykk- og endetarmskreft (CRC) cellelinjer og kliniske prøver [5]. UHRF1 uttrykk nivåer er korrelert med kreft metastasering og dårlig Dukes stadieinndeling. UHRF1 knockdown induserer celle apoptose og cellesyklus-stans i G0 /G1 fase og undertrykker celleproliferasjon og migrasjon.
UHRF1 er en meget viktig regulator av DNA-metylering, og avvikende DNA-metylering er en hyppig hendelse i epigenetisk blærekreft [6], [11]. UHRF1 gjenkjenner hemimethylated DNA generert under DNA replikasjon og rekrutterer DNMT1 (DNA methyltransferase1) for å sikre trofast vedlikehold av DNA-metylering mønstre i dattercellene [6]. KiSS1 er identifisert som å undertrykke metastaser på forskjellige kreftformer, så som kreft i blære, bryst-kreftceller og melanom [12]. KiSS1 koder for et 145-aminosyreprotein som er behandlet i KiSSpeptins (KP), inkludert KP10, KP13, KP14 og KP54 [12], [13], [14]. Nyere studier viser at KiSS1 er epigenetiske brakt til taushet av hypermethylation i blærekreft [15]. Cebrian
et al
vist at KiSS1 hypermethylation ofte observert og er korrelert med lav genuttrykk, restaurert av demethylating azacytidin i blæren kreftceller [12]. Hypermethylation av KiSS1 er også korrelert med høy tumor klasse og scene. Til tross for disse spennende funn, er lite kjent om hvorvidt UHRF1 øker blærekreft celle invasjon av epigenetisk stanse av KiSS1.
I studien vi testet om UHRF1 /KiSS1 representerer en ny sti som regulerer blærekreft celle invasjon. Våre resultater viser at UHRF1 uttrykk er oppregulert i primære svulster som senere metastasized, og overekspresjon av UHRF1 fremmer blærekreft celle invasjon av epigenetisk stanse av KiSS1.
Materialer og metoder
Kliniske prøver og cellelinjer
Menneskelige blæren vev ble innhentet skriftlig informert samtykke fra Beijing Friendship Hospital tilknyttet Capital Medical University. Studien ble godkjent av etikkomiteen av Capital Medical University. 47 prøver (Tabell 1) av patologisk og normalt diagnostisert biopsier (≥3 cm unna blærekreft vev) ble samlet inn fra pasienter med blærekreft, inkludert 22 med ikke-muskel-invasiv [NMI, scene PTA-PT1] og 25 med muskel-invasiv [MI, scene ≥T2] .Human blærecancerceller ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), og ble opprettholdt i RPMI 1640 med 10% FBS (Gibco, Carlsbad, CA).
real-time kvantitativ PCR
Total RNA fra blærekreftcellelinjer og prøver ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California). RT (revers-transkripsjon) Reaksjonen ble utført under anvendelse av en M-MLV revers transkriptase sett (Invitrogen). Real-time kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av en standard protokoll SYBR Grønn PCR Master Mix (Life Technologies) på StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems) i henhold til anvisningene fra respektive produsent. p-aktin ble benyttet som intern kontroll for mRNA. Respektive ΔCt verdier (både UHRF1 og KiSS1) ble oppnådd ved normalisering p-aktin. Relativ ekspresjon ble beregnet i forhold til kontrollen. Resultatene ble uttrykt som 2
-ΔΔCt. *
p
. 0,05
Overuttrykte og små interfererende RNA
For å overuttrykker UHRF1, plasmid pcDNA-UHRF1 ble konstruert ved å innføre en
HindIII-EcoRI
fragment som inneholder UHRF1 cDNA inn i de samme områdene i pcDNA3.1. Den UHRF1 genet ble amplifisert ved PCR bruke forover og bakover primere: cccaagcttgggATGTGGATCCAGGTTCGGACCATGGACGGG og ggaattccTCACCGGCCATTGCCGTAGCCGGGGAAG. pcDNA-UHRF1 ble transfektert inn i blærekreft cellelinjer ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
For å hemme endogen UHRF1 og KiSS1 uttrykk, blære kreft celler ble transfektert med 30 nM indikert indikert siRNA eller negativ kontroll ved hjelp Lipofectamine 2000. UHRF1-sirnas (referansesekvensen, sc-76805) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Den KiSS1-sirnas (referansesekvensen, sc-37443) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology.
Transwell invasjon analysen
Cell invasjonen ble undersøkt ved hjelp av Transwell invasjon analysen med inserts av 8-mikrometer porestørrelse (Corning Costar) som tidligere beskrevet [16]. Kort sagt ble blærekreftceller (RT4 eller T24) suspendert i serumfritt medium, og deretter sådd ut på Matrigel-belagte Transwell filtre i BioCoat Matrigel invasjons kamre. Den serumholdig medium ble brukt som en chemo-tiltrekningsmiddel i det nedre kammer. Blæren kreft celler ble behandlet med angitte reagenser i 72 timer, og deretter celler som ikke invadere gjennom porene ble eliminert ved hjelp av en bomullspinne. Celler på den nedre overflate av membranen ble farget med krystallfiolett. Celletall ble bestemt ved å telle de trengende cellene under et mikroskop på 200 × forstørrelse i tilfeldige felt i hver brønn.
Metylering Analyse av
KiSS1
Et søk på anrikning av CpG i KiSS1 ble utført og bisulfitt sekvense primere ble utformet ved hjelp av CpG Island Searcher nettbasert verktøy (MethPrimer, https://www.urogene.org/methprimer/). Termin primere er GATGGAAGGGGAATAGTTTTATTAGA, og omvendt primere er TACAACTAAAACTCCTTCCACCTAC [12].
Genomisk DNA ble fremstilt fra blæren kreftceller ved å QiAmp DNA blod Mini kit, og deretter genomisk DNA ble bisulfite modifisert ved hjelp av EZ DNA Metylering -Gold Kit fra Zymo forskning [17]. PCR-produktene ble klonet inn PMD-18T (Takara) i henhold til produsentens instruksjoner. 9 positive kloner ble sekvensert. Dataene ble analysert ved anvendelse av BIQ analysator-programvaren [17].
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (standardavvik) fra minst tre separate forsøk. Forskjellene mellom gruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
test. Forskjellen ble ansett statistisk signifikant på
p
. 0,05
Resultater
UHRF1 nivå er oppregulert i metastatisk blæren urothelial karsinom
UHRF1 resulterer i unormal DNA-metylering og kreft metastase, og UHRF1 ekspresjon er korrelert med en dårlig prognose i flere krefttyper. For å vurdere om UHRF1 regulerer blærekreft metastaser, må vi først undersøkt UHRF1 uttrykk i blærekreftcellelinjer og kreft vev. Figur 1A viser at uttrykket nivåer av UHRF1 er signifikant oppregulert i de fleste blærekreft vev sammenlignet med tilstøtende normale kontroller. UHRF1 er bemerkelsesverdig økt uttrykk i 77% (36/47) av blærekreft vev (figur 1A). Når de 47 tumorvev ble stratifisert basert på klinisk progresjon, er UHRF1 uttrykk betydelig økt i primære svulster som senere metastasized sammenlignet med ikke-metastatisk tumorer (Figur 1b). Da vi testet uttrykket nivåer av UHRF1 i begge blærekreft cellelinjer og ikke-invasiv blærekreft cellelinjer. Blant de tre invasive cellelinjer (253J, T24 og KU7) de UHRF1 nivåene er relativt høyere enn i de ikke-invasiv de (figur 1C). Disse data antyder at UHRF1 overexpressoin kan være relatert til blærekreft metastasering.
(A) kvantitativ analyse av UHRF1 ekspresjonsnivået ble utført i blærekreft vev (n = 47) og tilstøtende normale vev. Total RNA ble ekstrahert og utsatt for real-time PCR for å analysere ekspresjon av UHRF1 i hver prøve. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Den relative UHRF1 nivået ble beregnet ved 2
-ΔΔCt hvor ΔCt = Ct (UHRF1) – Ct (β-aktin) og ΔΔCt = ΔCt (svulstvev) – ΔCt (tilstøtende normalt vev). (B) blærekreft prøvene ble delt inn i to grupper basert på klinisk progresjon. De UHRF1 nivåer i metastasegruppen (n = 25) var høyere enn de i den ikke-metastase gruppe (n = 22). *
p
0,05. (C) UHRF1 uttrykk nivå ble analysert ved real-time PCR i tre ikke-invasiv og tre blærekreft cellelinjer. Normale urotelialceller ble anvendt som kontroll. *
p
. 0,05
oppregulert UHRF1 øker blærekreft celle invasjon
in vitro
For å undersøke hvilken rolle UHRF1 i regulering celle invasjon, ble blærekreftcellelinjer som ble behandlet med UHRF1-siRNA eller pcDNA-UHRF1 analysert. Vi først demonstrert om RT4 og T24 celler kan brukes som
in vitro
modell for å undersøke UHRF1 ved å analysere sitt uttrykk i RT4 eller T24 celler etter overekspresjon eller knockdown av UHRF1. Figur 2A og C viste at pcDNA-UHRF1 behandling øker betydelig UHRF1 nivåene i ikke-invasive RT4 celler, mens UHRF1-siRNA behandling minsker UHRF1 uttrykk i invasive T24 celler. Videre oppregulering av UHRF1 fremmer RT4 celle invasjon (figur 2B), mens siRNA-mediert UHRF1 stanse hemmer T24 celle invasjon (figur 2D). Disse resultatene viste at UHRF1 positivt regulerer blærekreft celle invasjon.
(A) RT4 celler ble behandlet med pcDNA-UHRF1, og det relative nivået av UHRF1 ble analysert ved realtime PCR. *
p
0,05. (B) UHRF1 ble overuttrykt i RT4 celler, og invasjonen analysen ble utført som beskrevet i Materiale og metode. Representative figurer av hvert forsøk er vist. Disse resultatene viser data fra fem uavhengige forsøk, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05. (C) T24-celler ble behandlet med UHRF1-siRNA, og det relative nivået av UHRF1 ble analysert ved realtime PCR. *
p
0,05. (D) Invasion Analysen ble utført etter UHRF1 knockdown. Representative figurer av hvert forsøk er vist. Disse resultatene viser data fra fem uavhengige forsøk, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
. 0,05
UHRF1 øker metylering av CpG nukleotider og reduserer uttrykk for KiSS1
Tidligere studier viste at KiSS1 ofte hypermethylated i blæren kreft og er korrelert med progresjon av kreft [12]. Her undersøkte vi om UHRF1 regulerer blærekreft celle invasjon av epigenetisk stanse av KiSS1. Vi først analysert hvorvidt UHRF1 regulerer KiSS1 uttrykk. Som vist i figur 3A og B, tvunget ekspresjon av UHRF1 inhiberer KiSS1 uttrykk, mens knockdown av UHRF1 øker KiSS1 uttrykk. Vi deretter analysert uttrykket nivået av UHRF1 og KiSS1 i begge blærekreft cellelinjer og ikke-invasiv blærekreft cellelinjer. Figur 3C viste at UHRF1 nivåene er relativt høyere med samtidige lave nivåer av KiSS1 i invasive cellelinjer. En betydelig negativ korrelasjon er også observert mellom UHRF1 mRNA nivåer og KiSS1 mRNA nivåer
in vivo product: (
r
2 = 0,0648,
p
= 0,0063, Figur 3D). Vi videre undersøkt om UHRF1 hemmer KiSS1 uttrykk ved å øke metylering av CpG nukleotider av
KiSS1
. Vi analyserte metylering status av CpG øyer i KiSS1 av bisulfitt sekvensering, som rapportert tidligere [12], [15]. De metylering analyseresultatene for
KiSS1
genet i 14 blærekreft vev og tilstøtende normale kontroller er oppsummert i figur 4A. Bisulfite sekvensering analyse viste at
KiSS1
metylering frekvensen økes markert hos blærekreft vev sammenlignet med tilstøtende kontroller (Figur 4A). Korrelasjonsanalyse viste at de
KiSS1
metylering nivå er positivt korrelert med UHRF1 ekspresjon i både blærekreft og normale blære vev (figur 4B, p = 0,0036, R «sup> 2 = 0,2091). Bisulfite sekvensanalyse viste videre at UHRF1 overekspresjon øker metylering av CpG nukleotider av
KiSS1 plakater (figur 4C, D). Disse resultatene tyder på at UHRF1 undertrykker KiSS1 uttrykk ved epigenetisk stanse av KiSS1.
(A og B) KiSS1 uttrykk nivået ble analysert i RT4 celler overuttrykt med UHRF1 eller T24 celler behandlet med UHRF1-siRNA. *
p
0,05. (C) UHRF1 og KiSS1 nivåene ble analysert ved real-time PCR i tre ikke-invasiv og tre blærekreft cellelinjer. Normale urotelialceller ble anvendt som kontroll. *
p
0,05. (D) negative korrelasjonen mellom UHRF1 mRNA nivåer og KiSS1 nivåer i 24 blærekreftprøver (
r
2 = 0,0648,
p
= 0,0063).
(A) metylering analyse av
KiSS1
genet i 14 blærekreft vev og tilstøtende normale prøver. BSQ analyse viste at
KiSS1
metylering frekvensen økes markert med blærekreft prøver. ** P 0,01. (B) En positiv sammenheng er observert mellom
KiSS1
metylering og UHRF1 uttrykk (R
2 = 0,2091, p = 0,0036). (C og D) CpG øy metylering status av KiSS1 ble analysert ved sekvensering bisulfitt i RT4 celler. Ni individuelle kloner ble vist per cellelinje. CpG dinukleotider var representert som mørke rutene for denaturert cytosines og åpne plasser for unmethylated cytosines.
UHRF1 øker blærekreft celle invasjon ved å hemme KiSS1
UHRF1 avtar KiSS1 uttrykk ved å øke metylering av CpG nukleotider av
KiSS
og nedregulering av KiSS1 fremmer blærekreft celle invasjon. Derfor spekulerte vi at rollen UHRF1 i å regulere celle invasjon er delvis mediert av KiSS1. Vi først analysert hvorvidt KiSS1 hemming øker blærekreft celle invasjon. Som vist i figur 5A og B, knockdown av KiSS1 fremmer RT4 celle invasjon. Mer viktig, KiSS1 overekspresjon delvis hemmer UHRF1-induserende RT4 celle invasjon (figur 5C og D). Disse resultatene bekrefter at UHRF1 fremmer blærekreft celle invasjon, i det minste delvis, ved epigenetisk stanse av KiSS1.
(A og B) RT4 celler ble behandlet med KiSS1-siRNA og invasjon Analysen ble utført etter KiSS1 knockdown. Representative figurer av hvert forsøk er vist. Disse resultatene viser data fra fem uavhengige forsøk, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05. (C og D) RT4 celler ble overuttrykt ved UHRF1 eller UHRF1 pluss KiSS1, og invasjon assay ble utført. *
p
. 0,05
Diskusjoner
I pattedyr, oppstår DNA metylering ved C5 posisjonen cytosin i sammenheng med CpG dinukleotider, noe som resulterer i fem -methylcytosine (5mC) [18]. Modifiseringen av genomisk DNA ved metylering er et viktig epigenetisk signal, og forandringer i mønsteret av DNA-metylering har vært en gjennomgående funn i ulike tumortyper [19]. Nyere studier viser at epigenetisk arv av DNA metylering krever UHRF1, som rekrutterer DNMT1 til DNA replikering gafler gjennom en unik hemimethylated CpG-bindende aktivitet [20]. Liu
et al
rapportert at UHRF1 rekrutterer DNMT1 for DNA vedlikehold metylering gjennom forpliktende enten hemi-metylert CpG eller H3K9me2 /3, og at tilstedeværelsen av både bindende aktiviteter sikrer høy fidelity DNA vedlikehold metylering [20].
UHRF1 overekspresjon er assosiert med kreft etapper og spår dårlige prognoser i ulike kreft [21]. UHRF1 koordinerer PPARG (peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor γ) epigenetisk taushet formidler kolorektal kreft progresjon [22]. Knockdown av UHRF1 utløser PPARG re-aktivering, fulgt av positive histone merker og DNA demetylering Bekreftende sin rolle i PPARG lyddemping. Babbio
et al
viste at UHRF1 bidrar til epigenetisk genet Slå i prostata kreft progresjon [23]. I denne studien fant vi at uttrykket nivåer av UHRF1 er betydelig økt i de fleste blærekreft vev sammenlignet med tilstøtende normale kontroller. Videre er UHRF1 ekspresjon signifikant økt i primære tumorer som deretter metastasized sammenlignet med ikke-metastatiske tumorer. Vi fant også at UHRF1 nivåene er relativt høyere i invasiv blærekreft cellelinjer enn i de ikke-invasiv seg. Videre oppregulert UHRF1 fremmer invasiv RT4 celle invasjon, mens knockdown av UHRF1 hemmer invasiv T24 celle invasjon. Disse dataene viste at oppregulering av UHRF1 bidrar til blærekreft celle invasjon.
KiSS1 er en metastase suppressor genet i flere kreftformer. KiSS1 uttrykk er markert redusert i invasive blæren svulster sammenlignet med sine respektive normal urothelium [24]. Lavere KiSS1 nivå er korrelert med total overlevelse i blæren svulster [24]. KiSS1 er betydelig metylert. Inaktivering av KiSS1 av arrangøren metylering er en sjelden hendelse i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) [25]. KiSS1 er også epigenetiske modifisert på tykktarmskreft, og KiSS1 metylering er forbundet med svulst klasse, spådde tilbakefall og total overlevelse [15]. Her fant vi at UHRF1 regulerer negativt KiSS1 uttrykk. UHRF1 nivåene er relativt høyere med samtidige lave nivåer av KiSS1 i invasiv blærekreft cellelinjer. En betydelig negativ korrelasjon er også observert mellom UHRF1 mRNA nivåer og KiSS1 mRNA nivåer
in vivo
. Bisulfite sekvense analyse viste at UHRF1 hemmer KiSS1 uttrykk ved å øke metylering av CpG nukleotider av
KiSS1
. Mer viktig, KiSS1 overekspresjon delvis hemmer RT4 celle invasjon i UHRF1-overekspresjon celler.
Konklusjon
Våre data viste at oppregulert UHRF1 bidrar til blærekreft celle invasjon av epigenetisk stanse av KiSS1.
