Abstract
Utviklingen av effektive anti-kreft terapi har vært et tema for intens interesse for flere tiår. Kombinert administrering av visse molekyler og immunceller har vist seg å være en effektiv form for anti-kreftterapi. Her undersøkte vi effekten av å administrere en immunstimulerende peptid (WKYMVm), 5-fluor-uracil (5-FU) og modne dendrittiske celler (mDCs) mot heterotop kreft dyremodell. Administrasjon av trippelkombinasjonen sterkt redusert tumorvolumet i CT-26-inokulert heterotop kreft dyremodell. De induserte anti-tumor aktivitet ble godt korrelert med FAS uttrykk, kaspase-3 aktivering, og kreftcelle apoptose. Trippelkombinasjonen behandling forårsaket rekruttering av CD8 T-lymfocytter og naturlige killer (NK) celler inn i tumoren. Produksjonen av to cytokiner, IFN-γ og IL-12, var sterkt stimulert ved administrering av trippelkombinasjon. Uttømming av CD8 T-lymfocytter eller NK-celler ved administrering av anti-CD8 eller anti-asialoGM1-antistoff inhiberte antitumoraktivitet og cytokin produksjon av trippelkombinasjonen. Trippelkombinasjonen sterkt inhibert metastasering av tykktarmskreftceller i en heterotopisk kreft dyremodell så vel som i en metastatisk kreft dyremodell, og forbedret overlevelse av mus-modellen. Adoptiv overføring av CD8 T-lymfocytter og NK-celler ytterligere øket overlevelse. Tatt sammen, foreslår vi at bruk av trippelkombinasjonsbehandling av WKYMVm, 5-FU og mDCs kan ha implikasjoner i solid tumor og metastase behandling
Citation. Kim SD, Lee HY, Shim JW, Kim HJ , Baek SH, Zabel BA, et al. (2012) En WKYMVm holdig Kombinasjon utløser Potent antitumoraktivitet i Heterotop Cancer dyremodell. PLoS ONE 7 (1): e30522. doi: 10,1371 /journal.pone.0030522
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 12 august 2011; Godkjent: 18 desember 2011; Publisert: 25 januar 2012
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Research Development Program for Cancer Control, departementet for helse, velferd og familiedepartementet, Republikken Korea (0920220) (Y-SB); National Foundation of Korea forskningsstipend finansiert av Korea regjeringen (2009 0093198) (Y-SB); og National Institutes of Health gi AI-079320 (BZ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Utvikling av anti-kreft terapi har vært en viktig sak for mange tiår [1], [2]. Behandling med antikreftmidler er en av de mest anvendte former for antitumorterapi. En rekke anti-kreftmidler har blitt utviklet, herunder 5-fluor-uracil (5-FU) [3]. Mekanistisk har anti-kreftmidler blitt rapportert å forårsake apoptose av kreftceller, som induserer initiering av anti-kreftimmunresponser [4]. I vertens immunsystem, dendrittiske celler (DCS) ser ut til å spille en nøkkelrolle i anti-tumor aktivitet. DC gjenkjenne og opptak tumorantigener, og presentere bearbeidede antigener på store histocompatibility komplekse molekyler [5], [6], [7]. Således kan DC stimulere T-lymfocytter, noe som resulterer i cytotoksisk T-lymfocytt-aktivitet. DCs skiller også flere cytokiner som er viktige i effektiv antitumoraktivitet [7].
WKYMVm ble identifisert som et immunstimulerende syntetisk peptid fra et peptid bibliotek screening [8], [9]. WKYMVm stimulerer leukocyttisk celler slik som monocytter, neutrofiler, naturlige dreperceller (NK) celler, og DC [9], [10], [11], [12]. På grunn av monocytt og neutrofil stimulering, kjemotaktisk migrering, superoksid anion produksjon, og produksjonen av visse inflammatoriske mediatorer så som leukotrien B
4 induseres av WKYMVm [9], [13], [14]. NK-cellestimulering med WKYMVm resulterer i cytolytisk aktivitet og kjemotaktisk migrering [11]. Peptidet stimulerte kjemotaktisk migrering av DC [12]. Tre medlemmer av den formyl peptid reseptor (FPR) familie har blitt rapportert å være kognitive celleoverflatereseptorer for WKYMVm hos mennesker [15], [16]. Mus FPR har også blitt rapportert å virke som en WKYMVm reseptor [17]. Selv om WKYMVm er blitt rapportert å stimulere leukocytter som spiller viktige roller mot cancerantigener, er lite kjent om den rollen som WKYMVm i anti-kreft-aktivitet.
Kombinert administrering av visse molekyler som kan indusere effektive anti-cancer aktivitet. Selv om forskjellige anti-kreft-midler eller anti-cancerterapier er blitt rapportert, er utvikling av nye anti-cancer-terapier som er effektive og spesifikke med lav toksisitet fortsatt nødvendig. I denne studien undersøkte vi den terapeutiske aktivitet av WKYMVm når den ble administrert med en anti-cancer middel (5-FU) og en naturlig vaksineadjuvans (modne DCS, mDCs). Virkningsmekanismen av trippelkombinasjonsbehandling var også preget.
Resultater
Kombinert administrasjon av WKYMVm, 5-FU og mDCs fører anti-tumor aktivitet i heterotop kreft dyremodell
Det antatte antitumoraktivitet av WKYMVm, 5-FU, eller mDCs ble undersøkt. WKYMVm, 5-FU, eller mDCs ble først administrert enkeltvis. For eksempel, som vist i fig. 1A, WKYMVm (100 ug /hode) ble injisert fire ganger med 12 timers mellomrom. Enkel administrasjon forårsaket en liten reduksjon i tumorvolum (Fig. 1B). Når midlene ble testet i par (WKYMVm + 5-FU; WKYMVm + mDCs; mDCs + 5-FU) mot en dyremodell, anti-tumoraktivitet ble forsterket (figur 1B.). Tilstedeværelsen av 5-FU som syntes å ytterligere forsterke antitumor-aktivitet (Fig. 1B, 5-FU + WKYMVm og 5-FU + mDCs). Dessuten, når trippelkombinasjonen (WKYMVm + 5-FU + mDCs) ble administrert til heterotop kreft dyremodell, ble den mest potente antitumoraktivitet observert (Fig. 1B).
(A) Protokoll for studiet av antitumoraktivitet av WKYMVm, 5-FU, og mDCs. (B) Trippelkombinasjonen av WKYMVm, 5-FU, og mDCs har den mest potente antitumoraktivitet. CT-26-celler (5 x 10
5-celler i 100 ul PBS) ble injisert s.c. inn i den høyre flanken til Balb /c mus (n = 8) på dag -3. Musene ble behandlet i henhold til protokollen i (A). Tumorvolumet ble målt, og dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 8).
***,
P
. 0.001 sammenlignet med kontrollgruppen
Kombinert administrasjon av WKYMVm, 5-FU og mDCs utløser svulst apoptose
Ettersom tumor apoptose er nært knyttet til antitumoraktivitet, ble virkningen av hver administrering på tumor apoptose målt. Som vist på fig. 2, enkel administrasjon av WKYMVm, 5-FU, eller mDCs indusert lave nivåer av tumor celledød, og doble kombinasjoner viste ytterligere økning i celledød, med trippelkombinasjonen som resulterer i dramatisk økt tumor celledød i heterotop kreft dyremodell (Fig . 2). De TUNEL-positive celler sammenfaller med FAS ekspresjon, noe som indikerer at tumorcelledød observert skyldes apoptose (Fig. 2). Caspase-3-aktivitet etter behandling ble bestemt ved immunofluorescens-farging ved anvendelse av anti-fosfo-caspase-3 antistoff. I samsvar med TUNEL-farging og FAS uttrykk gir økte caspase-3 aktivering som antallet av kombinerte midler økes, med det WKYMVm + 5-FU + mDCs trippelkombinasjon indusere en dramatisk økning av caspase-3 aktivitet (Fig. 2). Nivåene av svulst celle apoptose og caspase-3-aktivitet korrelerer godt med tumor volum data i fig. 1B.
Balb /c-mus ble inokulert med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og mDCs i henhold til protokollen i fig. 1A. Mus ble avlivet 42 dager etter tumor-inokulering og tumorer ble kirurgisk kuttet ut, og bearbeidet for hematoxylin og eosin farging, immunhistokjemi for FAS-farging, caspase-3 flekker, og TUNEL-farging, som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene som presenteres er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Administrasjon av trippelkombinasjonen gjør at rekruttering av CD8 T-celler og NK-celler i svulsten
For å starte en anti-tumor immun respons, leukocyttisk cellene trenger for å bli rekruttert inn i svulsten området [18]. Etter administrering av trippelkombinasjonen (WKYMVm + 5-FU + mDCs) fremkalte potent anti-tumor-aktivitet mot heterotop kreft dyremodellen har vi undersøkt hvilke typer av celler som rekrutteres inn i svulsten ved immunhistokjemi ved anvendelse av anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD11b, eller anti-DX5-antistoff. Administrasjon av trippelkombinasjonen forårsaket dramatisk rekruttering av CD8 T-lymfocytter og NK-celler i tumorområdet, så vel som svak rekruttering av CD4 T-lymfocytter (fig. 3A).
(A) Balb /c-mus ble inokulert med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og mDCs i henhold til protokollen i fig. 1A. CD8 T-celler, CD4 T-celler eller NK-celler ble utladet ved i.p. injeksjon av 100 ug av anti-CD8 (B), anti-CD4 (C) eller anti-asialoGM1 antistoff (D) i Balb /c-mus. Mus ble avlivet 42 dager etter tumor-inokulering og tumorer ble kirurgisk kuttet ut, og behandles for farging ved anvendelse av anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, og anti-asialoGM1 antistoffer, som beskrevet i Materialer og Metoder. CD3
+ CD8
+ celler, CD3
+ CD4
+ celler, og CD11b
+ DX5
+ celler indikerer CD8 T-lymfocytter, CD4 T-lymfocytter og NK-celler, henholdsvis . Dataene som presenteres er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Administrasjon av anti-CD8 monoklonalt antistoff før trippelkombinasjonen forårsaket dramatisk hemming av CD8 T lymfocytt rekruttering til tumorområdet, uten at det påvirker NK celle rekruttering ( fig. 3B). Når anti-asialoGM1 antistoff ble administrert før injeksjon av trippelkombinasjonen, ble NK-cellerekruttering til tumorområdet sterkt blokkert, men CD8 T-lymfocytt rekruttering ble ikke påvirket (fig. 3D). Anti-CD4-antistoff administrering før injeksjon av trippelkombinasjonen påvirket ikke CD8 T-lymfocytt eller NK-cellerekruttering (Fig. 3C).
CD8 T-celler og NK-celler spiller viktige roller i anti-tumor aktivitet av trippelkombinasjonsterapi
for effektiv aktivering av anti-cancer-aktivitet i et forsøksdyr, flere leukocytt-typene kommunisere med hverandre og virke concertedly. Vi har undersøkt den relative bidrag fra hvert av leukocytt-typer på anti-tumor-aktivitet indusert ved trippelkombinasjonsterapi ved administrering av antistoffer mot hverandre leukocytt. Når anti-CD8 antistoff ble administrert til heterotop kreft dyremodell, den anti-tumor aktivitet av trippelkombinasjonen var nesten fullstendig hemmet (Fig. 4A). Administrering av anti-asialoGM1 antistoff fremkalt delvis inhibering av anti-tumoraktiviteten av trippelkombinasjonsterapi (fig. 4B). Imidlertid administrering av anti-CD4-antistoff ikke påvirker den anti-tumor aktivitet av trippelkombinasjonen (data ikke vist). Disse resultatene indikerer at CD8 T-celler og NK-celler spiller en stor rolle i anti-tumor aktivitet av trippelkombinasjonen av WKYMVm, 5-FU, og mDCs.
Balb /c-mus ble inokulert med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og mDCs i henhold til protokollen i fig. 1A. CD8 T-celler eller NK-celler ble utladet ved i.p. injeksjon av 100 ug av anti-CD8 (A) eller anti-asialoGM1 antistoff (B) i Balb /c-mus. Tumorvolumet ble målt, og dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 8).
*
P
0,05,
***,
P
. 0.001 sammenlignet med kontrollgruppen
Administrasjon av WKYMVm, 5-FU, og mDCs trippelkombinasjon frembringer en endring av cytokin profil i en heterotopisk kreft dyremodell
Vi testet hvorvidt administrering av WKYMVm, 5-FU, og mDCs i forskjellige kombinasjoner fører til endringer i cytokin-profil sammenlignet til styre tumor lysatet. Som vist på fig. 5A, administrering av trippelkombinasjonen forårsaket dramatiske endringer i nivåene av IFN-γ og IL-12 produsert av tumor lysater i heterotop kreft dyremodell. Fremstillingen av IFN-γ i tumoren gradvis økt som antallet av kombinerte midler økes, med doble kombinasjoner generelt viser mer IFN-γ produksjon enn enkelt administrering, og trippelkombinasjonen som viser det høyeste nivået av IFN-γ produksjon (fig. 5A ). Når IL-12-nivåer ble målt, har vi funnet at enkelt administrering av hvert middel ikke induserer produksjon av IL-12, og mellom de doble kombinasjoner, bare kombinasjonen av WKYMVm + mDCs forbedret IL-12 produksjon i dyremodell (fig. 5B). Administrasjon av trippelkombinasjonen (WKYMVm + mDCs + 5-FU) dramatisk økt IL-12 produksjonen til et nivå som var to ganger høyere enn den WKYMVm + mDCs dobbel kombinasjon (Fig. 5B).
Balb /c-mus ble inokulert med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og mDCs i henhold til protokollen i fig. 1A. (A, B) IFN-γ og IL-12-nivåer ble målt fra tumorvev lysat. (C-F) IFN-y og IL-12 nivåer i perifert blod på trippel kombinasjonsbehandling ble målt. 100 ug av anti-CD8 (C, D) eller anti-asialoGM1 antistoff (E, F) ble injisert i.p. til Balb /c-mus. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 8).
*
P
0,05,
***,
P
0,001, sammenlignet med kontroll verdi;
#
P
. 0,05, signifikant forskjellig fra WKYMVm + 5-FU + mDCs behandlet kontroll
Administrasjon av trippelkombinasjonen ble også observert for å forbedre produksjon av IFN-γ og IL-12 i perifert blod (fig. 5C-5F). For å undersøke rollen av CD8 T-lymfocytter og NK-celler i produksjonen av disse to cytokinene ved trippel administrasjon, anti-CD8 eller anti-asialoGM1 antistoff ble administrert før trippelkombinasjonsbehandling. Administrering av anti-CD8 eller anti-asialoGM1-antistoff blokkerte trippelkombinasjonen-induserte IFN-γ og IL-12 produksjon i perifert blod (fig. 5C-5F). Disse resultatene indikerer at CD8 T-lymfocytter og NK-celler spiller en rolle i IFN-γ og IL-12-produksjon indusert ved trippelkombinasjonsbehandling.
Anti-metastasering aktivitet av kombinert administrering av WKYMVm, 5-FU, og mDCs
Ved utvikling av en effektiv anti-tumor terapeutisk middel, er det viktig å utvikle midler som inhiberer tumorresidiv [19]. Den metastatisk evne av kreftceller til å migrere fra sitt opphav til andre målvev er en av de viktigste grunner som gjør det vanskelig å utvikle et effektivt middel mot kreft [20], [21]. I vår heterotop kreft dyremodell, observerte vi at subkutan inokulering av CT-26 colon cancerceller forårsaket spontan metastasering av cellene inn i lungevevet (Fig. 6A). Administrasjon av trippel WKYMVm + mDCs + 5-FU kombinasjon nesten fullstendig blokkert metastasering av tykktarmskreftceller til lungene (Fig. 6A). Denne trippelkombinasjon-induserte anti-metastase-aktivitet ble blokkert ved administrering av anti-CD8 eller anti-asialoGM1-antistoff (Fig. 6A), som indikerer at den antimetastase-aktivitet formidles av CD8 T-lymfocytter og NK-celleaktivitet.
(A) Balb /c-mus ble inokulert med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og mDCs i henhold til protokollen i fig. 1A. CD8 T-celler eller NK-celler ble utladet ved injisering av 100 ug av anti-CD8 eller anti-antistoff asialoGM1 i.p. i Balb /c-mus. På dag 42 ble musene avlivet og tumorknuter på overflaten av lungene ble observert. (B) CT-26-celler (2 x 10
5-celler i 100 ul PBS) ble injisert i halevenen til Balb /c-mus. Etter 14 dager ble musene avlivet og hematoxylin og eosin-farging ble utført ved anvendelse av de isolerte lunger. Bildene som vises er representative for åtte uavhengige eksperimenter.
**
P
0,01,
**
P
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
Vi har også brukt et kunstig metastase dyremodell for å teste effekten av forskjellige kombinasjoner av WKYMVm, 5-FU, og mDCs mot metastasering. Injeksjon av CT-26 colon cancerceller i halevenen fører til metastase i lungene. Lungene ble isolert 14 dager etter at CT-26 celleinjeksjon. Dramatisk lungemetastase ble observert med bærer-behandlede mus (Fig. 6B). Enkle eller doble kombinasjoner av WKYMVm, mDCs, og 5-FU hemmet tumormetastaser i varierende grad å redusere lungemetastaser, og den mest potente effekten ble observert med trippelkombinasjonen (Fig. 6B).
Kombinert administrasjon av WKYMVm, 5-FU og mDCs øker overlevelsen i en heterotop kreft dyremodell
overlevelses~~POS=TRUNC av heterotop kreft dyremodell ved kombinert behandling ble undersøkt. Vi testet kombinasjonene som viste relativt høy anti-tumor aktivitet i våre tidligere analyser ovenfor; 5-FU alene, 5-FU + WKYMVm, 5-FU + mDCs, og 5-FU + mDCs + WKYMVm. Administrasjon av 5-FU alene, 5-FU + mDCs, eller 5-FU + WKYMVm bare noe økt overlevelse, men administrasjonen av trippel 5-FU + mDCs + WKYMVm kombinasjon sterkt forbedret overlevelsesrate (Fig. 7A). Alle musene i kontrollgruppen var døde etter 65 dager, mens 80% av trippelkombinasjonen administreres gruppe var i live 80 dager (fig. 7A).
(A) Overlevelse av mus behandlet med kombinasjoner av WKYMVm, 5-FU og mDCs. Balb /c mus ble inokulert med CT-26 celler (5 × 10
5 celler /hode) og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og mDCs henhold til protokollen i fig. 1A. (B) adoptiv overføring av CD8 T-lymfocytter eller NK-celler kan øke overlevelsen av trippelkombinasjonen behandlet heterotop kreft dyremodell mus. Balb /c mus ble inokulert med CT-26 celler (1 x 10
6 celler /hode) og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og mDCs henhold til protokollen i fig. 1A, og isolerte CD8 T-lymfocytter (1 x 10
6 celler /hode) eller NK-celler (1 x 10
6 celler /hode) ble overført inn i halevenen. Overlevelse ble overvåket i 80 dager.
**
P
0,01,
***,
P
. 0.001 sammenlignet med kontrollgruppen
For å teste hvis adoptiv overføring av CD8 T-lymfocytter og NK-celler kan forbedre trippelkombinasjonen-indusert overlevelse av heterotop kreft dyremodell mus inokulert vi et økt antall av tykktarmskreftceller (1 x 10
6 celler /hode) i mus. I denne modellen, ble virkningen av trippelkombinasjonen redusert, noe som reduserer overlevelse til 40% i 80 dager (fig. 7B). Under disse betingelser adoptiv overføring av CD8 T-lymfocytter eller NK-celler ble utført. Adoptiv overføring av CD8 T-lymfocytter eller NK-celler bare noe økt overlevelse vurdert forårsaket av trippelkombinasjonen administrasjon, mens kombinert adoptiv overføring av CD8 T-lymfocytter og NK-celler dramatisk økt overlevelse (Fig. 7B). Disse resultater indikerer at både CD8 T-lymfocytter og NK-celler kan øke overlevelsesgraden indusert av trippelkombinasjonen i heterotop kreft dyremodellen.
diskusjon
I denne studien, vi viste at administrasjon av trippelkombinasjonen av det syntetiske peptid WKYMVm, mDCs, og 5-FU begaver potent anti-kreft immunitet. Enkelt (WKYMVm, mDCs eller 5-FU) eller dobbel (WKYMVm + mDCs, 5-FU + WKYMVm eller 5-FU + mDCs) behandling av mus litt redusert tumorvolumet, men administrasjonen av trippelkombinasjonen dramatisk hemmet tumorvekst (Fig . 1). Tumorvolumet Måleresultatene var korrelert godt med FAS uttrykk, caspase-3 aktivitet, og TUNEL fargingsresultater (fig. 1 og 2). I henhold til tidligere rapporter, er IFN-γ kjent for å indusere ekspresjonen av celledød reseptorer slik som FAS [22], [23]. I denne studien viste vi at administrasjonen av forskjellige kombinasjoner av WKYMVm, 5-FU, eller mDCs kan indusere IFN-γ uttrykk, med trippelkombinasjonen som forårsaker den mest forbedrede IFN-γ produksjon (fig. 5A). Ekspresjonsnivået av IFN-γ ble godt korrelert med anti-tumor aktivitet av hver kombinasjon, noe som tyder på at IFN-γ indusert ved administrering av hvert middel eller kombinasjonen er kritisk involvert i anti-tumor-aktivitet i dyremodell.
IL-12 kan prime eller stimulere CD4 T-celler, CD8 T-celler og NK-celler [24], [25], [26]. I denne studien var det bare visse kombinasjoner, nemlig WKYMVm + mDCs og trippelkombinasjonen indusere IL-12 uttrykk i heterotop kreft dyremodell (fig. 5B). Enkel administrasjon av WKYMVm eller mDCs fremkalte ikke IL-12 produksjon (Fig. 5B). Dette tyder på at stimuleringen av mDCs med WKYMVm er ansvarlig for effektiv induksjon av IL-12 i dyremodell. Siden WKYMVm er en ligand for FPR familien, synes det sannsynlig at aktiveringen av FPR familien induserer IL-12-ekspresjon fra mDCs. I overlevelsesgraden eksperimentet, trippel administrering av WKYMVm + 5-FU + mDCs induserte en sterk forbedring av overlevelsesraten i en heterotopisk kreft dyremodell, men 5-FU + mDCs behandling hadde en mye mindre effekt (Fig. 7). Siden IL-12-produksjon er sterkt indusert av trippelkombinasjonen, men ikke ved 5-FU + mDCs (fig. 5B), kan det være mulig at trippelkombinasjonen øker overlevelsesgraden ved å stimulere produksjon av oppløselige faktorer, slik som IL-12.
NK og CD8 T-celler ble nylig rapportert å være viktig i kreft regresjon [27], [28], [29]. Her, demonstrerte vi at CD8 T- og NK-celler ble anriket i tumorer når trippelkombinasjonen ble administrert (fig. 3), og uttømming av CD8 T-celler eller NK-celler økt tumorvekst (fig. 4). I tillegg utarming av CD8 T-celler eller NK-celler reduserte nivåene av induserte IFN-γ og IL-12 (fig. 5C-5F). Disse resultatene indikerer at CD8 T-celler og NK-celler er involvert i den anti-tumor effekt av trippelkombinasjon. Trippel administrering av WKYMVm, mDCs og 5-FU fremkalte også en anti-metastase effekt i en heterotopisk kreft dyremodell (fig. 6). Intravenøs injeksjon av ATRA-kationiske liposom /IL-12 pDNA-komplekser ble påvist å øke veksten hemning av metastatisk lungesvulster hos mus [30], som støtter vårt oppfatningen om at IL-12-produksjon kan være assosiert med antimetastase-aktivitet av trippelkombinasjonen .
i denne studien demonstrerte vi at CD8 T-celler og NK-celler spiller en viktig rolle i antitumoraktivitet av trippelkombinasjon. Tidligere har vi rapportert at NK-celler uttrykker funksjonell FPR familie, og stimulering av NK-celler med FPR agonist WKYMVm utløser IFN-γ produksjon [11]. I denne studien har vi også funnet at mus NK-celler uttrykker FPR familie, og stimulering av muse NK-celler med WKYMVm utløser produksjon av IFN-γ (data ikke vist). Dette funn forklarer WKYMVm-induserte NK-celleaktivering i det vesentlige er nødvendig for den anti-tumor aktivitet av trippelkombinasjonen mot heterotop kreft dyremodell. I forhold til aktivering av CD8 T-celler og deres rolle i heterotop kreft dyremodell, tidligere viste vi at T-celler ikke uttrykker reseptorer for WKYMVm [31]. Ettersom CD8 T-celler kan aktiveres ved mDCs og IL-12 [32], [33], vil det være rimelig å tro at administrasjonen av trippelkombinasjonen inneholdende WKYMVm kan indusere aktivering av CD8 T-celle blir mediert av mDCs eller IL -12.
som konklusjon, trippelkombinasjonen immunterapi med mDCs, det syntetiske peptid WKYMVm, og 5-FU var overlegne i forhold til enkle eller doble behandling ved inhibering av etablerte primærsvulster og metastase, samt forlenge overlevelse. Økningen i terapeutisk effektivitet skyldes effekter som forekom lokalt (forbedrede nivåer av FAS og kaspase-3 ekspresjon) og systemisk (økt produksjon av IFN-γ og IL-12). Derfor kan bruk av trippelkombinasjonsterapi har implikasjoner i solid tumor og metastase behandling.
Materialer og metoder
Mus
Institutional Review Committee for Animal Care og hvert Dong-A Universitetet er spesielt godkjent denne studien (godkjent ID: DIACUC 07-6). Balb /c mus (hanner, 6-8 uker gamle) ble innhentet fra Jackson Laboratory
Cell kultur og materiell
CT-26 celler (CRL-2638;. ATCC American Type Culture Collection ) er et kolon adenocarcinom-cellelinje avledet fra Balb /c-mus. CT-26-celler ble holdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum og antibiotika ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator. Den syntetiske peptid, WKYMVm, ble syntetisert ved Anygen (Kwangju, Korea). Renheten av syntetiserte WKYMVm var 98%. 5-FU ble kjøpt fra Choongwae, Pharma Co. (Seoul, Korea).
DC forberedelse og modning Anmeldelser
benmargceller ble dyrket i 5 dager i DC medium (RPMI 1640 medium med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 50 mM β-merkaptoetanol, antibiotika) i nærvær av mus GM-CSF (1000 U /ml) og IL-4 (500 U /ml), som beskrevet [34]. GM-CSF og IL-4 ble påfylt på dag 2 og 4. På dag 5 ble cellene oppsamlet og overført til en ny plate med DC-medium og stimulert med lipopolysakkarid (100 ng /ml; Sigma), CpG 1826 oligodeoksynukleotid (10 ug /ml), og CT-26 lysat (100 ug /ml) i 2 dager for å indusere modning. På dag 7, ble DCs samlet for bruk som vaksiner.
Tumor vekst og overlevelse
For å måle tumorvekst, CT-26 celler (5 × 10
5 celler i 100 ul PBS) ble injisert sc inn i den høyre flanken til Balb /c mus (n = 8) på dag -3. På dagene 0 og 1, ble 5-FU (100 ug /100 ul) injisert s.c. i Balb /c-mus. På dag 2, ble mus behandlet med fire injeksjoner av WKYMVm (100 ug /100 ul) og mDCs (1 x 10
6 celler) ved 12 timers intervaller. På dag 4 og 5, ble 5-FU (100 ug /100 ul) injisert s.c. i Balb /c-mus. Deretter ble musene behandlet med s.c. injeksjon av 5-FU, mDCs og WKYMVm gang i uken i 4 uker. Tumorvolumet ble bestemt ved følgende formel: tumorvolumer (i mm
3) = lengde (mm) x bredde (mm)
2/2 [35]. I tillegg til overvåkning av tumorvekst, ble musene observert for overlevelse etter tumor-inokulering og behandling.
Hematoxylin og eosin og immunofluorescens-farging
Mus ble avlivet 42 dager etter tumor-inokulering, og tumorer ble kirurgisk utskåret fast i 24 timer i 10% nøytral fosfat bufret formalin (NBF), innebygd i parafin, og seksjonert og farget med hematoxylin og eosin for morfologisk analyse. For farging ble de følgende primære antistoffer anvendt: anti- mus Fas (Santa Cruz), anti-muse-spaltet caspase-3 (Cell Signaling), FITC-konjugert anti-muse-CD3 (BD Pharmingen), PE-konjugert anti-mus CD4 (BD Pharmingen), PE-konjugert anti-mus CD8 (BD Pharmingen), FITC-konjugert anti-mus CD11b (BD Pharmingen), og PE-konjugert anti-mus DX5 (BD Pharmingen) antistoff. For konfokalmikroskopi ble faste tumorvev farget med FITC-konjugert anti-mus IgG og Alexa 594-konjugert anti-mus IgG (BD Pharmingen).
In situ
TUNEL farging
terminal deoksy-nucleotidyl transferase-mediert digoxigenin-dUTP nick ende merking (TUNEL) ble utført for å påvise apoptotiske celler i tumorvev. Parafinsnitt ble deparaffinized, hydratisert, behandlet med 3% H
2o
2 i 5 minutter, og skylt med PBS i 15 min, og den
In situ
død Detection Kit, POD, ble brukt (Roche, Penzberg, Tyskland). I korthet ble digoxigenin-dUTP ende-merket DNA påvises med anti-digoxigenin-peroksidase-antistoff, etterfulgt av peroksydase deteksjon med diaminobenzidin (DAB). Vev ble kontra med Mayers hematoksylin.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
På dag 42, blod ble samlet fra hjertet av mus og avklares ved sentrifugering. Serumet ble lagret ved -80 ° C inntil de er klare for cytokin analyse. Murine IL-12 (P70) og IFN-y-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av en standardisert sandwich-ELISA-metoden (BD Biosciences Pharmingen).
In vivo
immunceller undergruppe uttømming
å utarme CD4, CD8 T-celler og NK-celler, mus ble behandlet med det tilsvarende antistoff på dagene -1, 0, og 5 (der dag 0 er dagen for primær tumorinokulering). Det monoklonale rotte anti-mus CD4 (klon GK1.5), rotte-anti-muse-CD8 (klon 53-6,7) og rotte-anti-mus-antistoffer asialoGM1 ble anvendt for immunodepletion. I de leukocytt utarming studiene, 100 ug av anti-CD4, anti-CD8, eller anti-asialoGM1 antistoff ble injisert i.p. i Balb /c mus.
Lung metastase
For heterotop lungemetastase eksperiment, CT-26 celler (5 × 10
5 celler i 100 mL PBS) ble injisert subkutant inn i den høyre flanken til Balb /c mus (n = 8) på dag -3. 5-FU, WKYMVm, og mDCs ble administrert i 3 uker, som beskrevet ovenfor for eksperiment for å måle tumorvolumet. På dag 42 ble musene avlivet og tumorknuter på overflaten av lungene ble observert. For metastatisk kreft dyreforsøk, ble CT-26-celler ble vasket to ganger med PBS, og injisert i halevenen til Balb /c mus (2 x 10
5-celler i 100 ul PBS). Etter 14 dager ble musene avlivet og lungene ble veid.
adoptiv overføring
For å få CT26 tumor-reaktive CD8 T-celler, ble Balb /c mus immunisert tre ganger (på en uke intervaller) med 1 × 10
7 CT26 tumorlysatene (sc injeksjon). Den 21. dag ble immuniserte mus avlivet, og CD8 T-celler eller NK-celler ble isolert ved anvendelse av CD8 T-celler isolert kit eller NK-celleisolasjonskit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) fra deres milt. For adoptiv terapi, ble svulster etablert av subkutan injeksjon av 5 x 10
6 CT26 tumorceller på den høyre flanke av Balb /c-mus. Palpable tumorer (~ 5 mm i diameter) vanligvis dannet ved injeksjonsstedet etter 4 til 5 dager. Før trippel kombinasjonsbehandling, renset CD8 T (1 × 10
6-cellers /100 mL) celler eller NK (1 × 10
6 celle /100 mikroliter) celler overført (iv injeksjon) til CT26 tumor lastet mus og deretter begynne med trippel kombinasjonsbehandling.
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av gjentatte eksperimenter. Statistisk signifikans av forskjeller ble bestemt ved hjelp av ANOVA. Overlevelsesdata ble analysert ved bruk av log-rank test.
P
. . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Takk
Vi takker Dr. Min Sung Choi av Sungkyunkwan Universitetet for redaksjonell bistand
