Abstract
Gastric kreftforekomst viser en sterk etiologisk sammenheng med røyking. Nikotin, den viktigste komponenten i tobakk, er en overlevelse agonist som hemmer apoptose indusert av visse kjemoterapeutika, men de nøyaktige mekanismene som er involvert fortsatt i stor grad ukjent. Nylig studier har indikert at α5-nikotin acetylkolin reseptor (α5-nAChR) er sterkt forbundet med risikoen for lungekreft og nikotinavhengighet. Likevel har ingen informasjon vært tilgjengelig om hvorvidt nikotin påvirker også spredning av menneskelige mage kreftceller gjennom regulering av α5-nAChR. For å evaluere den hypotese at α5-nAChR kan spille en rolle i magekreft, undersøkte vi dets ekspresjon i magekreft vev og cellelinjer. Ekspresjonen av α5-nAChR økes i magekreft vev sammenlignet med para-karsinom vev. I lys av resultatene, fortsatte vi å undersøke om nikotin hemmer cisplatin-indusert apoptose via regulere α5-nAChR i magekreftcelle. Resultatene viste at nikotin betydelig fremmet celleproliferasjon i en dose- og tidsavhengig måte gjennom α5-nAChR-aktivering i humane mage-celler. Videre nikotin hemmet apoptose indusert av cisplatin. Silence of α5-nAChR ablated den beskyttende effekten av nikotin. Men når co-administrasjon LY294002, en hemmer av PI3K /AKT vei, ble en økt apoptose observert. Denne effekten korrelert med induksjonen av Bcl-2, Bax, Survivin og Caspase-3 av nikotin i gastriske cellelinjer. Disse resultatene tyder på at eksponering for nikotin kan virke negativt på apoptotiske potensialet av cellegifter og at α5-nAChR /AKT signalering spiller en nøkkelrolle i den anti-apoptotiske aktivitet av nikotin indusert av cisplatin
Citation. Jia Y Sun H, Wu H, Zhang H, Zhang X, Xiao D, et al. (2016) Nikotin hemmer Cisplatin apoptose via Regulering α5-nAChR /AKT signale i Human Gastric kreftceller. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10,1371 /journal.pone.0149120
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 1 juni 2015; Godkjent: 15 januar 2016; Publisert: 24 februar 2016
Copyright: © 2016 Jia et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. På grunn av restriksjoner fra Jinan Central Hospital, data er tilgjengelig på forespørsel. Interesserte forskere kan kontakte Dr. Xiaoli Ma ([email protected]) for å be om datatilgang
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av Natural Science Foundation National of China (nr 81272588) og Shandong Provincial Natural Science Foundation of China (No. ZR2012HM061and ZR2013CM010)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de viktigste årsakene. av kreft dødsfall i verden. Angivelig, både genetiske og miljømessige faktorer involvert i magekreftutvikling. Tidligere funn har raknet det sterk sammenheng mellom sigarettrøyk og magekreft forekomst [1-3], men den detaljerte mekanismen er ikke fullt ut undersøkt.
Nikotin, en viktig komponent av sigarettrøyk, har vist seg å være involvert i initiering, markedsføring, og til og med progresjon av flere tumorer inkludert magekreft. Flere linjer av bevis tyder på at nikotin utøver sin cellulære funksjoner ved nikotiniske acetylkolinreseptorer (nAChR). Ulike epitelceller, ikke bare nerveceller, uttrykte nAChR og strukturen i nAChR er en homo (α7or α9) eller heteropentamer (α2-α10, b2-b4). Studier har vist at nikotin stimulert proliferasjon av humane magecancerceller gjennom dets interaksjon med α7-nAChR [4, 5]. Mens ulike medlemmer av nAChR familien kan regulere konvergerende signalveier, de har ofte ulike og til og med motstridende handlinger. Nylig har genom brede assosiasjonsstudier indikerte at α5-nAChR er sterkt forbundet med risikoen for lungekreft og nikotinavhengighet [6, 7]. Likevel har ingen informasjon vært tilgjengelig om hvorvidt nikotin påvirker også spredning av menneskelige mage kreftceller gjennom regulering av α5-nAChR.
Levering av kjemoterapeutisk middel cisplatin etter kirurgisk reseksjon for tiden definerer standard behandling for magekreft [8 -10]. Dessverre, ervervet resistens mot cisplatin er vanlig og unndragelse av celle apoptose er anerkjent som en av de viktigste mekanismene som er ansvarlig for cisplatin motstand [11, 12]. Spesielt kan nikotin hemme apoptose indusert av cisplatin i lungekreftceller [13-15] og muntlig kreft [16]. Den hemmende effekten av nikotin på apoptose har blitt tilskrevet dets evne til å aktivere anti-apoptotiske proteiner som Bcl-2 og survivin, så vel som inaktivering av proapoptotiske proteiner som Bax og Caspase-3, gjennom aktivering av både PI3K /AKT og PKC /ERK signalveier i kreftceller [13-15]. Denne effekten av nikotin på celle apoptose blir også formidlet av nAChR-er, men i tillegg til α5-nAChR, andre delenheter synes å være involvert [17, 18].
Selv om mange av disse mekanismer har blitt observert i lungekreft [19-21], er det ingen bevis for den anti-apoptotiske virkning og den mekanisme som utøves av nikotin på mage kreftceller. Hensikten med denne studien var å undersøke nikotin hemmer cisplatin-indusert apoptose via regulere α5-nAChR i magekreftcelle. Videre foreslår involvering av pro-overlevelse faktorer, som Bcl-2 og Survivin, aktiveres av AKT trasé, henholdsvis.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studien protokollen ble godkjent av Medical Ethics and human Clinical Trial komiteen i Jinan Central Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Vevsprøver, Cell kultur og medikamentell behandling
Femti formalinfikserte, parafininnstøpte prøvene inneholder 40 eksemplarer av magekreft og 10 para-karsinom vev ble retrospektivt og tilfeldig valgt fra arkivene i Jinan Central Hospital etter at protokollen ble godkjent av den lokale forskningsetisk komité. Ifølge registrering av røyking (eller ikke) når det gjelder historie av pasientene, 32 tilfeller hadde røykeforbud inntak historie, 8 hadde røyking inntak historie. Alle prøvene ble evaluert for diagnose av to erfarne patologer for diagnose.
Den menneskelige mage kreft cellelinjer MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27, og MKN45 ble hentet fra Cell Bank of Shanghai, Institute for biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Celler ble dyrket i DMEM (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen), 1% antibiotika ved 37 ° C i 5% CO2 fuktet luft. I alle forsøk ble 60-70% av konfluente cellene vasket og inkubert i serumfritt medium i 24 timer før behandling med nikotin, cisplatin og LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) i den angitte tid.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemisk farging ved hjelp av streptavidin-peroksidase-metoden (SP-metoden) ble utført på 4 um deler av parafininnstøpte prøver for å påvise α5-nAChR-ekspresjon i magekreft og para-karsinom vev. I korte trekk, etter deparaffinization og hydratisering, ble platene behandlet med endogen peroksidase i 0,3% H
2o
2 i 30 min og blokkert i to timer ved romtemperatur med 1,5% blokkerende serum i fosfatbufret saltvann (PBS ). Snittene ble deretter inkubert med anti-α5-nAChR-antistoff (Abcam, Inc., Cambridge, MA) (1: 100 fortynning) ved 4 ° C over natten, vasket med PBS, og inkubert med sekundært biotinylert anti-muse-antistoff (KIT-5010 Max Vision, Maixin.Bio, Kina) (1: 2000) i PBS i 30 minutter ved 37 ° C. Antistoffet binding ble påvist ved anvendelse av streptavidin-biotin-peroksidasekompleks /HRP (Kode K0377; Dako) med 3, 3- diaminobenzidin i 3 min som et kromogent substrat. Platene ble deretter lett kontra med hematoksylin. Som en negativ kontroll ble duplikate seksjonene farget uten eksponering for de primære antistoffer. Resultatene ble observert under et mikroskop.
Kvantitativ Sanntids RT-PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Tjuefem nanogram total RNA per prøve ble revers transkribert ved hjelp av Reverse Transcription Reaction Kit (Takara Kode: DRR061S) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ real-time PCR ble utført analysert på Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System for å bestemme de relative mengdene av α5-nAChR og β-aktin (internkontroll) mRNA uttrykk. Den SYBR Grønn Supermix ble brukt for alle real-time PCR reaksjoner. PCR primere som brukes i denne studien er som følger: α5-nAChR Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Omvendt: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) fremover, 5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 «og omvendt, 5′-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3». De kvantitative real-time PCR parametre var 95 ° C i 10 s som en pre-denaturering trinn etterfulgt av 40 PCR-sykluser med 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 10 min. Alle prøvene ble utført i tre paralleller i hvert eksperiment. Den relative mengde mRNA ble beregnet ved hjelp av sammenlignende CT metode etter normalisering til p-aktin mRNA-nivåer.
Western blot-analyse
Cellepelletene ble homogenisert i utvinning buffer (50 mmol /liter Tris-HCl , pH 6,8, 0,1% SDS, 150 umol /l NaCl, 100 mg /l fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mg /l aprotinin, 1% NP-40 og 0,5% natrium-ortovanadat), inkubert ved 4 ° C i 30 minutter, og sentrifugert i 20 min ved 12 000 g /min. Totalt protein i cellelysatet ble målt ved bruk av Bio-Rad kolorimetrisk kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For western blot-analyse, ble totalt protein separert på 10% SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, USA), som ble inkubert i 24 timer ved 4 ° C med antistoffene for α5-nAChR (1: 500, ab41173 eller ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 2118-1), Caspase-3 (1: 500, Epitomics Cat no: 1087-1), BCL-2 (1: 500, Epitomics Cat no: 1017-1), survivin (1: 500, Epitomics Cat no: 2463-1) og GAPDH (1: 1000, ab37168), deretter pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus /kanin-IgG-antistoff (Santa Cruz Biotechnology) etter en siste vask. Signaler ble detektert ved bruk av en forbedret kjemiluminescens kit (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). GAPDH nivå var en intern standard
RNA interferens
A dobbel tråd siRNA oligonukleotid rettet mot CHRNA5, som koder for α5-nAChR, (forstand.: 5′-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 «, antisense: 5» -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 «) ble syntetisert ved Shanghai Genepharma Co. Ltd. (Kina). Et par negativ kontroll siRNA er også utformet med sekvenser som er forskjellige fra siRNA-CHRNA5 og ikke homologe til noen sekvenser som finnes i genbank (sense: 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGA-3»). Cellene ble sådd ut i seks-brønns plater. Når cellene nådde 30-50% samløpet ble sirnas lagt til en endelig konsentrasjon på 50 nM med lipofektamin 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger.
celleviabilitet analysen
Celleviabilitet var bestemt ved CCK8 analysen (Dojindo, Tokyo, Japan). I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater (1500 celler /brønn) ble behandlet med nikotin ved de angitte doser. Analysen celleformering ble utført ved tilsetning av 10 ul CCK8 løsning til hver brønn, fulgt av inkubering ved 37 ° C i 2 timer. Absorbansen ble målt ved en bølgelengde på 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser (Synergy 2 Multi-Mode mikroplateleser, BioTek, Winooski, VT, USA).
Annexin V /7-AAD flekker
BGC823 celler ble dyrket til konfluens i seks-brønns vevskulturplater (Falcon, Becton Dickinson Labware) i et fullstendig medium. Deretter ble mediet erstattet med friskt komplett medium eller ved serumfritt medium; Cellene ble deretter stimulert med 100 uM nikotin alene eller i kombinasjon med 20 mM cisplatin i 24 timer basert på vår tidligere data, trypsinert og vasket to ganger med PBS. Cellene ble farget med PE-merket annexin V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D) i henhold til produsentens instruksjoner (annexin V /7-AAD kit, Becton, Dickinson and Company). I korthet ble en vasket celle pellet resuspendert i 500 ul bindingsbuffer. Deretter ble 5 pl Annexin-V-PE og 5 ul 7-AAD lagt. Strømningscytometrisk analyse ble utført umiddelbart etter supravital farging. Datainnsamling og analyse ble utført i et Becton Dickinson FACSCalibur flowcytometer hjelp Cellquest programvare. Cellene i tidlige stadier av apoptose var AnnexinV positive og 7-AAD negative, mens cellene i de sene stadier av apoptose var både AnnexinV og 7-AAD positive.
Hoechst 33342 farging
Celler ble sådd i 12-brønns vevskulturplater og behandlet med de angitte konsentrasjoner av nikotin og cisplatin. Ved slutten av hver inkubasjon ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, vasket med PBS, og deretter inkubert med Hoechst 33342 (1 pg /ml) i 10 minutter. Etter vasking med PBS, ble cellene observert ved bruk av et fluorescerende mikroskop (Olympus, Japan). Minst 400 celler fra 12 tilfeldig utvalgte felt per tallerken ble telt, og hver behandling ble utført i tre eksemplarer.
Statistikk analyse
Resultatet av immunhistokjemi ble analysert ved hjelp av χ
2 test. Alle resultater ble presentert som betyr ± S.D. fra triplikate eksperimenter utført på en parallell måte med mindre annet er angitt. Betydningen av forskjell mellom kontrollgrupper og nikotinbehandlingsgruppene ble bestemt ved en to-halet t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant ved P 0,05 eller P 0.01.
Resultater
a5-nAChR uttrykk i mage kreft vevsprøver og cellelinjer
uttrykk for α5-nAChR ble funnet og lokalisert i parafin-embedded human mage vev seksjoner. α5-nAChR er hovedsakelig lokalisert på membranen av tumorcellene, selv om noen cytoplasma farging ble også observert (figur 1A). Uttrykk for α5-nAChR var høyere i mage kreft vev (77,5%, 31/40) enn det i para-karsinom vev (20%, 2/10). Resultatene viste en trend at den positive frekvensen av α5-nAChR uttrykk økt hos pasienter med nikotin inntak historie (87,5%, 7/8) sammenlignet med pasienter uten nikotin inntak historie (75,0%, 24/32).
A: uttrykk for α5-nAChR i mage para-karsinom vev (Venstre) og kreft vev (Høyre). (IHC 200 ×); B: Protein uttrykk for α5-nAChR i mage kreft cellelinjer (N87, MKN28, MGC803, BGC823, HGC27, SGC7901, MKN45, AGS); C:. Ekspresjon av α5-nAChR mRNA i de ovennevnte celler i (A) ble analysert ved RT-PCR, og normalisert til den av GAPDH
α5-nAChR mRNA og protein ble påvist i en panel av magekreft cellelinjer. Cellelinjene uttrykte forskjellige nivåer av α5-nAChR-protein, hvor cellelinjer med en høyere ekspresjon var BGC823, AGS og SGC7901 normalisert med den i GAPDH (figur 1B). Nivåene av α5-nAChR mRNA-ekspresjon detektert ved hjelp av RT-PCR korrelert med nivåer av protein ekspresjon (Fig 1C). BGC823 uttrykker høyere nivåer av α5-nAChR enn for andre cellelinjer. For ytterligere funksjonelle eksperimenter, ble BGC823 cellelinje valgt på grunn av sin høyere uttrykk (egnet for induksjon av nikotin eller stanse av siRNA).
Nikotin fremmet magekreft celleproliferasjon gjennom α5-nAChR
Å bestemme hvorvidt nikotin kan regulere proliferasjon av gastriske celler, undersøkte vi effekten av nikotin med forskjellige konsentrasjoner på cellelevedyktigheten i BGC823 ved en CCK8 analyse (figur 2A). BGC823 ble eksponert mot nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) i 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Som vist i figur 2A, nikotin fremmet celleproliferasjon i en tidsavhengig og konsentrasjonsavhengig forhold. Nikotin signifikant stimulert celle-proliferasjon ved lavere konsentrasjon (1, 10, 100, 500 pM) og tid (24-72 timer), men en merkbar nedgang i celleantall ble observert i nikotin-behandlede kulturer ved høyere konsentrasjon (1000 pM) og tids (72 timer). Undersøkelser viste nivåer av nikotin i kroppen varierer mye mellom individer, selv når røyking det samme antall identiske sigaretter [22-24] sikret konsentrasjon av nikotin (100 uM) som anvendes i den foreliggende undersøkelse etterlignet det daglige inntaket av sigaretter i moderate røykere [ ,,,0],25, 26]. Konsentrasjonen av nikotin (100 pM) er ekvivalent med konsentrasjonen i spytt i røyker som inntak for 25 sigaretter /dag [27]. For ytterligere funksjonelle eksperimenter, ble konsentrasjonen av nikotin (100 uM) valgt til å behandle mage-celler i 24 timer
A:. BGC823 ble eksponert mot nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000μM) i 24 , 48, og 72 timer, henholdsvis. Nikotin fremmet celleproliferasjon i en tidsavhengig og konsentrasjonsavhengig forhold; B: Behandling av nikotin i en dose av nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000μM) i 24 timer fremmet ekspresjonen av α5-nAChR-protein på en doseavhengig måte; C: Celler ble transfektert med α5-nAChR spesifikk siRNA (Si-α5) og deretter behandlet med nikotin ved 100 uM i 24 timer. α5-nAChR uttrykk ble betydelig redusert sammenlignet med egge uspesifikk kontroll siRNA (si-NC) og Nic (Nikotin) + si-NC gruppe; D: Ved sammenligning med Si-NC, transfeksjon med si-α5 betraktelig hemmet celleproliferasjon. * P 0,05 vs. den ubehandlede kontroll; hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
For å finne ut om nikotin-mediert fremme celleproliferasjon i mage celler er mediert gjennom α5-nAChR signalering, analyserte vi effekten av nikotin på uttrykk for α5- nAChR protein i BGC823-celler ved hjelp av Western blot. Som vist i figur 2B, behandling av nikotin i en dose av nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) i 24 timer fremmet ekspresjonen av α5-nAChR-protein på en doseavhengig måte. For ytterligere å bekrefte involvering av α5-nAChR signalveien i nikotin-mediert fremming av magekreft celleproliferasjon, vi blokkert α5-nAChR protein uttrykk ved trans BC823 celler med en α5-nAChR spesifikke siRNA (si-α5-nAChR) ( fig 2C) og evaluert effektene av nikotin-mediert fremme celleproliferasjon ved CCK-analysen (figur 2D). Ved sammenligning med det forvrengte uspesifikk kontroll siRNA (Si-NC), transfeksjon med si-α5-nAChR inhiberte celleproliferasjon. Videre si-α5-nAChR transfeksjon betydelig redusert nikotin-mediert fremme celleproliferasjon i BGC823 celler (figur 2D).
Nikotin hemming av cisplatin-indusert apoptose
For ytterligere å karakterisere apoptose effektene av nikotin i kombinasjon med cisplatin på BGC823, cisplatin ble anvendt for å indusere apoptose i de BGC823 cellene. Cellene ble behandlet med 20 mM cisplatin [28]. Som vist i figur 3A, ble de apoptotiske celler avrundet form, og deres kjerner oppviste en fragmentert morfologi, danner apoptotiske legemer. I kontrast, celler ko-behandlet med nikotin og cisplatin viste liten atom fragmentering og få apoptotiske legemer
A.: Cisplatin induserte celler apoptose sammenlignet med kontrollen. I kontrast, celler ko-behandlet med 100 uM nikotin og 20 mM cisplatin viste liten atom fragmentering og få apoptotiske legemer ved fluorescens mikroskopi (200 X); B: Cisplatin apoptose ble analysert ved AnnexinV /7-AAD farging. Flowcytometri plott viste at andelen av totale apoptotiske celler ble redusert når de utsettes for 20 mM cisplatin i kombinasjon med 100 uM nikotin.
Cisplatin apoptose ble ytterligere analysert ved AnnexinV /7-AAD farging. Flowcytometri plott viste at andelene av totale apoptotiske celler (AnnexinV + /7-AAD-) ble redusert from43.2 ± 2,32% to29.9 ± 1,26%, når den utsettes for cisplatin i kombinasjon med 100 uM nikotin (figur 3B). Disse resultatene antydet at nikotin kan undertrykke apoptose indusert av cisplatin.
α5-nAChR /AKT signalveien involvert i anti-apoptotiske effektene av nikotin i cisplatin-indusert apoptose av BGC823 celler
For å bestemme rollen til AKT i medier effektene av nikotin i disse cellene, bestemt vi om nikotin induserer aktivering av AKT i BGC823 celler. I figur 4A, 20 mM cisplatin sterkt undertrykkes aktiviteten av AKT (spor 2), men nikotin øket AKT ekspresjon (felt 3) i nærvær av cisplatin. Det foreslått at AKT ble aktivert etter eksponering for 100 uM nikotin i BGC823-celler som rapportert i forskjellige papirer [29, 30]. Nedregulering av α5-nAChR ekspresjon ble redusert P-AKT uttrykk (felt 4). Behandling med 10 mM LY294002, et fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT pathway inhibitor, redusert anti-apoptotiske virkninger av nikotin i BGC823-celler (kolonne 5). I tillegg behandling med LY294002 kombinert med si-CHRNA5 transfeksjon betydelig undertrykt nikotin induserte P-AKT protein nivåer (spor 6). Disse data tyder på at α5-nAChR /AKT trasé spille en avgjørende rolle i å mediere virkningene av nikotin og kjemoterapi i magekreftceller
A.: P-AKT ble aktivert etter eksponering for 100 uM nikotin i BGC823 celler (søyle 2 og Lane3). Cisplatin sterkt undertrykkes aktiviteten av P-AKT (spor 1 og spor 2), men nikotin også indusert P-AKT i nærvær av cisplatin (kolonne 2 og kolonne 3). Nedregulering av α5-nAChR ekspresjonen reduserte nivået av P-AKT (felt 4 og spor 5). Behandling med LY294002 downregulated P-AKT uttrykket (felt 3 og spor 5). Kombinasjon LY294002 med SI-CHRNA5 transfeksjon betydelig undertrykt nikotin indusert P-AKT protein nivåer (kolonne 3 og spor 6); * P 0,05; B: Cisplatin induserte en økning i kaspase-3 og Bax aktivering i celler BGC823 en reduksjon i Bcl-2 og Survivin uttrykk, mens nikotin blokkert cisplatin- indusert Bcl-2, Bax, caspase-3 og Survivin uttrykk; Med taushet av α5-nAChR ko-administreres LY294002, ble en økt apoptose observeres med induksjon av Bcl-2, Bax, Survivin og Caspase-3 av nikotin i BGC823 celler. * P 0,05; C: Vurdering av apoptose ved AnnexinV /7-AAD flekker i hver gruppe. BGC823 celler ble forbehandlet med 100 mikrometer nikotin og cisplatin i 24 timer, og /eller si-α5-nAChR for 48t, og /eller AKT inhibitor LY294002 for 24 timer, og høstet.
Vi videre undersøkte effekten av nikotin på cisplatin-indusert kaspase-3 aktivering i BGC823 celler ved Western blot-analyse. Som vist i figur 4B, cisplatin induserte en økning i kaspase-3 aktivering, mens nikotin blokkert cisplatin-indusert kaspase-3 aktivering i BGC823 celler. Videre eksponering av celler til BGC823 cisplatin skyldes ekspresjonen av apoptotiske protein Bax økte, mens den prosurvival proteinet Bcl-2 og Survivin redusert, som ble inhibert ved behandling med nikotin.
I mellomtiden, slik som vist i figur 4C, er anti-apoptotisk effekt av nikotin var tydeligvis blokkert av si-α5-nAChR i BGC823 celler. Flowcytometri plott viste at andelen av totale apoptotiske celler (AnnexinV + /7-AAD-) økte fra 18,5 ± 0,92% til 34,9 ± 1,74% etter si-5 behandling, sammenlignet med Si-NC-gruppe. Tilsetting av AKT inhibitor LY294002 med si-α5-nAChR forfremmet betydelig apoptotisk effekt av cisplatin fra 31,5 ± 1,57% til 61,2 ± 3,06% sammenlignet med LY294002 gruppe. Disse resultatene indikerer at nikotin spiller en viktig rolle i forebygging av cisplatin-indusert apoptose via α5-nAChR /AKT signalveien.
Diskusjoner
Denne studien er den første til å demonstrere en viktig rolle α5-nAChR i nikotin anti-apoptose av cisplatin i menneskelige mage kreftceller. Analysen av kliniske prøver indikerte at α5-nAChR uttrykk er generelt høyere i tumorceller sammenlignet med para-carcinomceller. Resultatene viste en trend at den positive frekvensen av α5-nAChR uttrykk var høyere hos pasienter med nikotin inntak historie enn pasienter uten nikotin inntak historie. In vitro resultatene viste at nikotin oppregulert ekspresjonen av α5-nAChR protein og hemmet cisplatin-indusert apoptose ved å regulere α5-nAChR /AKT-signalveien i magekreftceller. Nikotin forhindret cisplatin-indusert aktivering av kaspase-3 og Bax, og opp-regulert ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner, Bcl-2 og Survivin. Videre aktivering av AKT ble funnet å spille en rolle ved formidling av cisplatin-indusert apoptose, så vel som anti-apoptotiske effekter av nikotin i BGC823 celler. Det kan være interessant å ta hensyn til forholdet mellom sigarettrøyk (andre fritt) og magekreftforekomst.
Tidligere funn har raknet det sterk sammenheng mellom sigarettrøyk og magekreft [31, 32]. Nikotin ble vist å øke proliferasjonen og migreringen av magecancerceller ved å indusere cyclooxgenase-2 (COX-2), prostaglandin E2, VEGF, p-adrenerge reseptorer, protein-kinase C [26, 33, 34]. Disse effektene synes å være formidlet gjennom homopentameric α7-nAChR [35]. Imidlertid har nyere studier vist en uventet effekt av heteropentameric a5-nAChR på nikotininntaket [36-38]. Våre tidligere arbeider rapportert at nikotin /α5-nAChR veien er kritisk for lungekreft celleviabilitet [21, 39]. Likevel har ingen informasjon vært tilgjengelig om hvorvidt nikotin påvirker også spredning av menneskelige mage kreftceller gjennom regulering av α5-nAChR. Her studerte vi rollen til α5-nAChR i human magekreft. Våre resultater viste at ekspresjon av α5-nAChR var høyere i magekreft vev sammenlignet med para-karsinom vev, noe som antydet at α5-nAChR kan spille en rolle i mage karsinogenese. Videre nikotin fremmet α5-nAChR protein ekspresjon og blokkerer aktivering av nAChR-α5 av siRNA dempes nikotin-indusert gastrisk cancer celleproliferasjon. Det foreslått at α5-nAChR er en av de store molekyler for å formidle celle-proliferasjon stimuleres av nikotin i magekreftceller.
Den gjeldende standard kjemoterapi for magekreft er cisplatin, men suksessrate på denne behandlingen er dårlig. Effekten av cisplatin er avhengig av evnen til å indusere DNA-skade [40, 41]. Derfor hvordan kreftceller svare på cisplatin- indusert apoptose spiller en avgjørende rolle i cisplatin følsomhet. Nye rapporter viser at nikotin hemmer cisplatin indusert apoptose i lungekreftceller, kreft i munnhulen, Raw264.7 og EL4 celler [13, 16, 18], noe som kan tyde på at nikotin har evnen til ikke bare å fremme kreftutvikling ved å aktivere cellevekst trasé , men også for å redusere effekten av kjemoterapeutiske midler ved å stimulere overlevelsesreaksjonsveier. I overensstemmelse med tidligere funn, Resultatene fra denne studien viste at samtidig behandling av cellene med cisplatin og nikotin, en betydelig aktivering av kaspase-3 ble observert, noe som indikerer at nikotin er i stand til å bestemme en hemming av apoptotiske potensialet i cisplatin i magekreft.
De signalveier som regulerer celleprosesser, inkludert celleproliferasjon, cellesyklusprogresjon og celle apoptose, har betydelig innvirkning på å bestemme cellulær respons til cisplatin. Tidligere studier har vist at aktiveringen av AKT-reaksjonsveien kan føre til resistens mot cisplatin [42, 43]. En over-ekspresjon av serin fosforylering AKT er blitt detektert i et vidt spekter av humane kreftformer, inkludert magekreft [44, 45]. Som rapportert i forskjellige papirer, nikotin ved binding til nAChR fører til nedstrøms aktivering av tumor fremme proteiner, inkludert aktivering av AKT trasé [46-48]. Eksponering for nikotin kan ha en negativ innvirkning på den apoptotiske potensialet av cisplatin i humane orale kreftceller, og AKT veien var nødvendig for nikotin funksjon [16]. Men AKT sti av nikotin nedstrøms signalering og anti-apoptotiske effektene av nikotin i mage kreftcellene var ukjent. Derfor, undersøkte vi hvorvidt P-AKT kan forklare den antagonisere effekten av nikotin på cytotoksisiteten av cisplatin. Vi fant at samtidig behandling med siRNA-α5-nAChR og LY294002, et PI3K /AKT pathway inhibitor, økte cisplatin-indusert apoptose og dempet virkningene av nikotin i BGC823 celler. Flere studier markert nikotin aktivert AKT signalbaner som er i modulering av celle proliferasjon og overlevelse gjennom aktivering av prosurvival proteinet Bcl-2 og Survivin [15, 49, 50]. Vår forskning viste også at rollen av nikotin på celle apoptose indusert av cisplatin gjennom α5-nAChR /AKT er bekreftet av induksjon av Survivin og BCL-2, som endelig effektorer av de ovennevnte risiko.
I sammendraget, vi demonstrert at nikotin aktivert α5-nAChR /AKT signalering og er involvert i motstands av cisplatin i magekreft. Disse funnene gir ny innsikt i de mulige molekylære mekanismer for nikotin hemming av cisplatin-indusert apoptose i humane mage kreftceller (fig 5). Nikotin stede i sigarettrøyk kan forstyrre magekreft farmakologisk behandling ved å hemme kjemoterapeutisk legemiddelindusert apoptose. Strategier rettet mot å forstå nikotin-mediert signale kan legge til rette for bedre behandling i magekreft.
Nikotin kan samhandle med α5-nAChR på overflaten av magekreftceller, deretter aktivere AKT signalveien og opp-regulerer Survivin og BCL-2 uttrykk for å hindre cisplatin-indusert apoptose.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Uttrykk for α5-nAChR og α7-nAChR uten eller med α5-siRNA behandling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Nedregulering av α5-nAChR uttrykk redusert nivået av P-AKT
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. Uttrykk for α5-nAChR i BGC823 celler uten eller med si-α5-nAChR behandling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s003 plakater (TIF)
S4 Fig. Nikotin fremmet BGC823 celleproliferasjon gjennom α5-nAChR og α7-nAChR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s004 plakater (TIF)
S5 Fig. Nikotin fremmet SGC7901 celleproliferasjon gjennom α5-nAChR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s005 plakater (TIF)
S6 Fig. Nikotin hemming av cisplatin-indusert apoptose av SCG7901
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s006 plakater (TIF)
