Abstract
Androgen deprivasjon terapi har blitt knyttneve behandling av metastatisk prostatakreft; men progresjon til kastrere motstand sykdom oppstår hos de fleste pasientene. Det er derfor et stort behov for forbedringer i terapi for kastrering resistent prostatakreft. Målet med denne studien var å fastslå effekten somatostatin analog oktreotid (OCT) kombinert med en lav dose docetaxel (DTX) med kastreringsresistent prostatakreft celler og for å undersøke de involverte molekylære mekanismer in vitro. Den anti-proliferative og synergisme skadelig virkning ble bestemt ved MTT-assay. Induksjon av apoptose ble analysert ved anvendelse av annexing V og propidiumjodidfarging og flowcytometri. VEGFA, CASP9, CASP3 og ABCB1 genekspresjon ble evaluert ved hjelp av RT-PCR og Q-RT-PCR-analyse. Oktober i kombinasjon med DTX behandlinger på DU145 cellemigrasjon ble også evaluert. Undersøkelse viser at kombinert bruk av DTX og oktober hadde betydelig, synergi større cytotoksisitet enn DTX eller oktober behandling alene. Kombinasjonen av de to medikamentene førte til en mer markert økning i apoptose og resultert i større undertrykkelse av invasiv potensial enn enten individuelle middel. Det var tydelig økning i caspase 3 uttrykk i oktober alene og to-drug kombinert behandlingsgruppene, men VEGFA uttrykk ble markert trykt i dem. Disse resultatene understøtter den konklusjon at somatostatinanaloger kombinert med docetaxel kan forsterke kjemoterapi virkningsfullhetene gjennom flere mekanismer i kastrering-resistent cellelinje PCa. Dette arbeidet gir en preklinisk begrunnelsen for den terapeutiske strategier for å forbedre behandlingen i kastrering motstand sykdom
Citation. Zhu S, Oremo JA, Li S, Zhen M, Tang Y, Du Y (2014) Synergistic antitumor-aktivitet av Docetaxel og Octreotide Associated med apoptotisk-Oppregulering i Kastrering resistent prostatakreft. PLoS ONE 9 (3): e91817. doi: 10,1371 /journal.pone.0091817
Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: Per 31. desember 2013, Godkjent: 13 februar 2014; Publisert: 14 mars 2014
Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet i deler av et stipend fra Natural Science Foundation National of China (81041102) og Scientific Research Preferred Foundation for den returnerte Overseas Chinese Scholars, State Education departementet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen som representerer en stor trussel mot menns helse. Androgen deprivasjon (ADT) involverer kirurgisk eller kjemisk kastrering er standard behandling for pasienter med avansert PCa [1]. Imidlertid vil de fleste pasienter bli ildfast til androgen deprivasjon og til slutt videre med kastreringsresistent sykdommer [2], vanligvis innen 12-24 måneder fra oppstart av hormonbehandling [3]. Fremveksten av aggressive kastrerings-resistente kloner under ADT er begrunnelsen for taxan-basert terapi, som er den eneste kjemoterapi klassen for å vise en overlevelsesfordel i metastaserende kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) [4], [5].
Docetaxel (DTX) er førstelinje kjemoterapeutiske alternativ for symptoma CRPC pasienter som er kandidater for kjemoterapi [6], som forbedrer den generelle responsen, klinisk remisjon av prostatakreftpasienter [7]. DTX behandling øker Bcl-2 fosforylering, nedregulerer Bcl-XL-proteinnivåer, induserer p53 og således resulterer i apoptose [8], [9]. I tillegg ble DTX rapportert å utøve antiangiogene effekter [10]. Det minner oss om den tidlige tegn på at TAXOTERE kunne hemme spredning av menneskelig navleveneendotel celleproliferasjon gjennom hemming av VEGF-sekresjon [11]. Derfor, undersøkte vi VEGFA sekresjon før og etter behandling med forskjellige midler. Imidlertid Cytotoksisiteten spesielt perifer neurotoksisitet og hematopoietiske bivirkninger er betydelig og uunngåelig progresjon oppstår etter behandling DTX [12], [13]. Motstand kan utvikle seg gjennom en rekke mekanismer inkluderer inhibering av apoptose og aktivering av de ekstracellulære signalmessige PI3 kinase /akt overlevelsesreaksjonsveier med utviklingen av metastase [14]. På grunn av motstand, ofte ikke klarer å kurere pasienter, derfor er det viktig å identifisere bedre eller alternative behandlingsstrategier som reverserer kjemoterapi motstand og øker følsomheten for docetaxel-basert kjemoterapi narkotika.
Somatostatin (SST) ble oppdaget som en inhibitor av veksthormon som først ble isolert fra hypothalamus av sauer. Det er fordelt på flere organer og svulster med en rekke funksjoner som hemming av celleproliferasjon, til regulering av fosfotyrosin fosfatase aktivitet hemme PI3 kinase og MAP kinase aktivitet [15]. Mange syntetiske somatostatinanaloger (oktreotid, lanreotid, vapreotide, og depreotide) ble utviklet og fem ulike undergrupper av somatostatinreseptorer kan være bundet av dem [16]. Somatostatin-reseptorer er til stede på cellemembraner av kastreringsbestandig PCA cellelinjer, kan imidlertid deres dynamiske uttrykk varierer avhengig av den fenotypiske trekk ved hver cellelinje [17]. Den syntetiske somatostatin analoge oktreotid (OCT) har blitt grundig studert som en av de SST analogene og akkumulerende bevis støtter sin antitumoraktivitet i kreftterapi [18], [19]. Oktober har blitt godkjent av FDA for å bli brukt som en standardbehandling for medisinsk behandling i forskjellige typer kreft. Den har en svært forbedret stabilitet sammenlignet med naturlig somatostatin, slik at for langtidsbehandling [20].
Grer forskjellige anticancermidler er en rimelig strategi med å oppnå en potent cytotoksisk virkning på kreftceller. I vår studie fant vi ut effekten av kombinert behandling av DTX og oktober på profilen til gener uttrykk assosiert med apoptose, angiogenese og narkotika-toleranse i DU-145 celler. Resultatene som presenteres her viste at foreningen av DTX og oktober gitt en mer enn additiv apoptotisk respons. Denne romanen legemiddelkombinasjonen var mer effektiv ved å indusere apoptose og redusere migrasjon enn enten stoffet alene. Disse resultatene gir en helhetlig forståelse av de kliniske strategier for prostatakreft og stoffet motstand reversering.
Materialer og metoder
celler og cellekultur
DU145 prostatakreftceller og PC3 celler ble gitt vennlig som en gave av professor Peter Nelson (Fred Hutchinson Cancer Research Center). De er kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, USA) som var supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone) og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO2. Konfluente celler ble passert med trypsin-EDTA (0,05% trypsin og 0,53 mM tetranatrium EDTA) og innhøstet for å fremstille mRNA som beskrevet nedenfor.
Behandling og celleviabilitet assay
DU145 prostatakreft celler ble sådd i 96-brønners plater i quintuplicate med Dulbeccos basalmedium pluss 10% føtalt bovint serum og holdt i kultur i 24 timer. Cellene ble behandlet med DTX (5, 10, 20, 50 eller 100 nM) og oktober (10, 10
2, 10
3, 10
4, 10
5 nM), benyttes alene eller i simultane kombinasjoner for 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis. Ved slutten av inkubasjoner ble celle medium fjernet og 100 pl /brønn av MTT-løsning (0,5 mg /ml i PBS) ble tilsatt. Deretter, platene ble inkubert i 3 timer (ved 37 ° C, beskyttet mot lys). Etter inkubering ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 timer, ble supernatantene fjernet forsiktig og 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Cellene ble deretter rystet i 10 min i mørket. Absorbans ble målt ved 450 nm i en mikroplateleser (Bio-Rad 680). Analyse av de oppnådde resultatene ble utført ved bruk av GraphPad Prism 4 dataprogram for å vurdere celleformering hastighet og cytostatisk hastighet. Ubehandlede celler ble brukt som kontroller.
RNA og DNA-ekstraksjon
Totalt RNA fra dyrkede celler ble hentet ved hjelp Trizol reagens (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner og deres konsentrasjoner ble bestemt av et spektrofotometer (Nanodrop, Nyxor Biotech). Genomisk DNA fra dyrkede celler ble hentet ved hjelp DNeasy Blood Tissue Kits (Qiagen) og deres konsentrasjoner ble målt med Nanodrop spektrofotometer. Alle prosesser ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.
RT-PCR og Q-RT-PCR
kvantitativ real-time PCR ble utført med QPK-201 SYBR Grønn mester mix (Toyobo, Osaka, Japan) og ABI 7300-systemet fra Applied Biosystems. Primerne benyttet i studien ble oppnådd fra Invitrogen (Beijing, Kina) og presentert i tabell 1. termocykling parametre som inngår et RT trinn ved 50 ° C i 20 min, etterfulgt av en DNA-polymerase aktiveringstrinn ved 95 ° C i 2 minutter og 50 PCR-sykluser (95 ° C i 20 s, 60 ° C i 30 s). Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Den sammenleggbare endringen i differensial uttrykk for hvert gen ble beregnet ved hjelp av komparative C
Tmethod (også kjent som 2
-ΔΔCTmethod) som beskrevet av Lu et al [21].
Strømningscytometrisk evaluering av annexin V-FITC /PI-fargede celler
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP ble dyrket i 6-brønners plater i 24 timer, behandlet med DTX (20 nM) og oktober (10
3 nM) alene eller i samtidig kombinasjon for ytterligere 48 timer. For å detektere apoptotiske hendelser, ble cellene vasket to ganger med PBS og pelleten ble resuspendert i 1 x Annexin bindingsbuffer ved en konsentrasjon på 10
6cells /ml. Deretter ble 100 ul av cellesuspensjonen overført til 5 ml dyrkningsrør. Deretter ble 5 ul av Annexin V-FITC og 5 ul av propidium jodid tilsatt til hver prøve, og prøvene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Etter dette tidsrom ble 400 ul av 1 x Annexin bindingsbuffer tilsatt til hvert rør, og cellene ble analysert ved anvendelse av en BD FacsCanto strømningscytometer (BD Biosciences). Hvert eksperiment omfattet kontrollprøvene celler farget med Annexin V-FITC (ingen PI) og celler farget med PI (ingen Annexin V-FITC). Levedyktige celler ble Annexin V-FITC- og PI-negative celler i tidlig apoptose var Annexin V-FITC-positive og PI-negative og celler i slutten av apoptose eller døde var positive både for Annexin-FITC og PI. Resultatene ble representert som brette endringer i relative midlere forhold mellom cellene ubehandlede sammenlignet med de forskjellige behandlingsmetoder. Hvert forsøk ble utført in triplo.
sårheling assay
ripe Analysen ble utført for å vurdere innvirkningen av DTX og oktober på prostata kreftcelle motilitet alene og i kombinasjon. DU145-celler ble sådd ut i en høy tetthet på 6-brønners plater og dyrket i 24 timer. Mediet ble fjernet og erstattet med medium inneholdende DTX og /eller oktober i ytterligere 24 timer. Monolagcellene ble fysisk skadet ved å skrape i overflaten med en pipette tips (1000 mL) som jevnt og rett som mulig. Bildene av cellene som invaderer bunnen ble tatt ved angitte tidspunkter (0, 4, 6, 8 og 24 timer) under anvendelse av fasekontrastmikroskopi (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Bildene ble evaluert ved å måle forskjellen i området av sårene med en Leica bildeanalysesystem (Leica, Mannheim, Tyskland) og migrasjonshastigheten uttrykt som prosent av bunnen lukke ble beregnet som følger:% av skrapelukke = a-b /a, hvor (a) er en avstand mellom kantene av såret, og (b) er den avstand som forble celle-fri i løpet av cellemigrering for å lukke såret. Forsøkene ble gjentatt i triplikate brønner minst to ganger.
Statistisk analyse
Data fra forsøkene ble analysert ved hjelp av SPSS 18,0 programvare og uttrykt i form av gjennomsnittet ± SD. De to-sidig t-test ble brukt til å analysere forskjeller i forsøkene. P-verdien 0,05 ble ansett som viktig, mens p-verdi 0,01 eller 0,001 som svært betydnings
Resultater
apoptotiske egenskaper DU145 celler behandlet av DTX alene, oktober alene og deres kombinasjon i 48 timer
i den første studien ble den veksthemmende virkning av DTX, oktober og kombinasjonen av dem på prostatakreftceller DU145 undersøkt. Etter disse midler behandling, deler av cellene begynner å krympet, ble inter-celle avstanden større og cytoplasmatiske partikkelavsetning ble observert i DTX og oktober behandlede celler. Denne effekten var mye kraftigere i kombinasjonsbehandlingsgruppen enn i de enkelte behandlingsgruppene. Det var mer flytende og skumceller vises morfologiske trekk ved apoptose i kombinasjonsbehandlingsgruppene og økningen i behandlingen konsentrasjon forbedret apoptotiske opptredener. Fig. 1 viser cellemorfologi av forskjellige konsentrasjoner av DTX og /eller oktober behandling i 48 timer. I tillegg, som behandlingstiden utviklet seg, ble cellevekst treg og det var økt antall flytende celler kan observeres i mediet.
A. Ubehandlede celler; B. 1 nM DTX; C. 100 nM oktober; D. 10 nM DTX; E. To-stoff kombinasjon av 10 nM DTX og 100 nM oktober; F. 100 nM DTX.
Veksthemming av DTX og oktober alene henholdsvis
Den veksthemmende virkning av DTX og oktober ble undersøkt henholdsvis. Det er åpenbart at hver av de to midlene utviste anti-spredning effekt på DU145-celler (fig. 2A og 2B). Både DTX og oktober redusert celleproliferasjon i en tid og doseavhengig måte. Som vist på fig. 2C, sammenlignet med ubehandlede kontroller, var det 14%, 31% og 43% inhibering i proliferasjon av DU145-celler utsatt for 10 nM av DTX ved 24 timer, 48 timer og 72 timer. Som for OCT (fig. 2D), sammenlignet med kontroll, var det en 10%, 18% og 29% inhibering i proliferasjon av DU145 cellene eksponert for 100 nM av medikamentet ved 24 timer, 48 timer og 72 timer . Dataene viste at den høyeste cytotoksisitet var på 72 timer og IC
50 verdier av DTX (Fig. 2A) og oktober (Fig. 2B) ble beregnet fra celleproliferasjonsprosesser plott respektivt. DTX viste en sterkere cytotoxity med lavere IC
50 med en verdi på 10,784 ± 3,122 nM enn oktober viste en svakere hemming effekt med IC
50 være 2,342 ± 0,262 mikrometer.
Celleviabilitet var bestemt ved MTT-analyse og uttrykt som en prosent av kontrollverdien (gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter utført i triplikat); feilfelt = SEM (n = 6).
DTX sammen med oktober produserer synergistisk hemming av vekst i menneskelige DU145 cellene
For å vurdere mulige synergieffekter av DTX-oktober kombinert på veksten av kreftceller, ble DU145-celler eksponert for forskjellige konsentrasjoner av DXT og oktober kombinert i 72 timer (fig. 3B). Den synergistiske virkning av DTX og oktober på DU145-celler spredning ble observert. Prosentandelene av hemming av cellevekst fremkalt av DTX i kombinasjon med oktober var større enn hvert enkelt middel alene. Ved en konsentrasjon på 10
3 nM, oktober betydelig redusert IC50-verdien (P 0,05) og promotert apoptose (P 0,05) i de DU145 cellene i respons til DTX. Som vist på fig. 3A, 10 nM DXT og 10
2 nM oktober resultat i en 39% og 14% inhibering i proliferasjon i DU145-celler, henholdsvis mens begge kombineres i samme doser forårsaket en 68% reduksjon i celleformering, sammenlignet med ubehandlet kontroll, hvilken indikerte en sterk synergi.
Resultatene er den prosentandel av kontrollverdi oppnådd med ubehandlede celler (gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter utført i triplikat). (**) Sprednings ble betydelig redusert (
p
0,001); feilfelt = SEM.
VEGFA, CASP3, CASP9 og ABCB1 mRNA uttrykk i DU145 cellene
For å undersøke mulighetene mekanismen som DTX pluss oktober induserer celledød ved apoptose, uttrykk for gener som er involvert i apoptose-signal, ble celle motstand mot DTX og angiogenese evaluert ved hjelp av RT-PCR og QRT-PCR etter 48 h (fig. S3), og 72 timer etter behandling. Sammenlignet med kontrollen, 10 nM og 100 nM DTX oktober, vil de to midler kombinasjonsgruppen markert redusert VEGFA mRNA-ekspresjon (Fig 4A.) (P 0,01). Som for CASP9 og CASP3, basal mRNA nivå av CASP9 og CASP3 var lav, men detekterbare og mRNA-ekspresjon ble økt vesentlig som vist i fig. 4B og fig. 4C (P 0,01). Protein Ekspresjonsnivået av de to kaspase-genene ble også undersøkt, og i overensstemmelse med resultatet av QRT-PCR (fig. S4). I tillegg ble uttrykket av ABCB1, som er anerkjent som et gen assosiert med resistens [22], ikke berørt i behandlingsgruppene (Fig. 4D). Disse resultatene antyder at anti-tumoreffekt av DTX i kombinasjon med oktober kan være involvert i å fremme apoptose forbundet med høy ekspresjon av caspase 9 og caspase 3.
M: Marker, uttrykket nivåer av objektive gener ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR (A, B, C og D) og kvantitativ sanntids -PCR (B, D, F og H) henholdsvis, ved hjelp av celler som ble behandlet med testlegemidler i 72 timer. Ekspresjonsnivået av hvert mRNA ble normalisert til nivået av β-aktin mRNA. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD av tre eksemplarer analyser (*
p
0,05, **
p
0,01).
Effekter av DTX, oktober alene og to-medikamentkombinasjonsbehandling på DU145-celler apoptose
i henhold til QRT-PCR-resultater, ble forsøkene inndelt i fire behandlingsgrupper, inkludert kontrollen, DTX (10 nM), OCT (100 nM) og de to-legemiddel kombinasjonsgruppene (fig. 5). Etter behandling i 48 timer, ble en apoptose test utført av flowcytometri henhold til instruksjonene i Annexin V-FITC /PI farging kit (Fig. 5A). I motsetning til kontrollgruppen, ble indusert apoptose i både DTX og OCT-grupper (P 0,05). I samsvar med tidligere observasjoner, ble andelen av apoptotiske celler markert øket ved anvendelse av DTX pluss oktober sammenlignet med DTX eller oktober behandling alene (figur 5B.). Disse resultatene indikerer at kombinasjonsbehandling forsterket apoptotisk celledød i DU145-celler.
Dataene er gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. ***
p
. 0,000 vs. kontroll
Effekt av DTX, oktober alene og to-medikamentkombinasjon på migrasjon av DU145 cellene
for å påvise effekten av de to medikamentkombinasjon på migrering av DU145-celler, ble en sårheling assay utført etter 24 timers behandling. Resultatene av den til sårheling analysene viste at enten av medikamentet alene har den hemmende virkning på celler migrasjon. Men cellene i kombinasjonsgruppen migrerte saktere enn de i stoffet alene og ubehandlede kontrollgrupper (Fig. 6A). Sammenlignet med kontrollen, den relative migrerte avstand av cellene i DTX, OCT og DTX /OCT kombinerte grupper (Fig. 6B), var henholdsvis 76,5 ± 10,21, 53,2 ± 12,13, 79,4 ± 13,04 (P 0,05). Cellene ble inkubert i kontrollgruppen migrert over et område som var vesentlig større enn den til celler inkubert i medikamentkombinerte gruppen, noe som indikerer at DTX i kombinasjon med oktober hemmet migreringen av DU145 cellene.
( A) Sårtilheling analyse for å bestemme virkningen av angitte medikamenter på DU145-cellemigrering. (B) Den oppsummert migreringen forholdet (%) etter 72 timer behandling målt ved sårheling assay. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SEM. **
p
. 0,01, vs. kontroll
Diskusjoner
microtubule målretting basert kjemoterapi er den mest brukte metoden i behandling av prostatakreft [23]. Imidlertid langtidsbehandling ofte resulterer i bivirkninger og kjemoterapi motstand, vanligvis bidrar til de variable kliniske resultater hos pasienter med tilsynelatende lignende tumortyper. I et forsøk på å overvinne resistens, bestemte vi oss for å undersøke den effektive cytotoksiske og apoptotiske konsentrasjoner av mikrotubuli-målsøkende stoff docetaxel (DTX) og somatostatin analog oktreotid (OCT) og deres synergistiske virkning av de to legemidlene i kastrering motstandsdyktig prostatakreft-cellelinjen DU145.
i denne studien, vurderte vi den kombinerte effekten av DTX og oktober mot prostatakreft DU145 og PC3 celler (fig. S1). Kombinasjonen av DTX med oktober indusert en større reduksjon i cellelevedyktighet enn noen av midlene alene. Oktober redusert IC
50 verdi av DTX i DU145 og PC3-celler på en doseavhengig måte, hemmet PCa celler proliferasjon (fig. S2), økt følsomhet DTX, cellulære cytotoksiske og apoptose. Selv om vi funnet at PC3-celler viste mer følsomme for DTX enn DU145-celler som er forenlige med undersøkelsen in vivo (fig. S5). Disse resultatene tyder på at oktober synergistisk forsterker virkningen av mikrotubul-målsøkende midler i PCA-celler in vitro. Disse konsistent med fersk studie av Lattanzio et al. docetaxel kombinert med oktreotid synergistisk øket effekt av kombinert behandling i et spesielt docetaxel-resistent PC-3-cellelinjen [24]. Men vi fant en av de to legemidlene alene stimulerer spredning av DU145 cellene i en lavere konsentrasjon av DTX 1 nM eller oktober. 10 nM henholdsvis, som ikke ble observert i deres samlede gruppe
Den anti-proliferative effekten av DTX og oktober kan skyldes enten cellenekrose eller celle apoptose. Derfor undersøkte vi apoptotisk effekt av DTX, oktober alene og deres kombinasjonsbehandling i DU145 cellene. Resultatene viste at kombinasjonen av DTX med oktober nedsatt cellelevedyktigheten og øke caspase 9/3 aktivitet i større grad enn hver enkelt middel alene i en tidsavhengig måte (fig. S4). Sammenlignet med kontrollgruppen er det tydelig økning i kaspase 3 ekspresjon spesielt i OCT alene og to-legemiddel kombineres behandlingsgruppene. Dette er i samsvar med rapporten viste at oktober økte caspase 3 mRNA-ekspresjon og indusert celle apoptose i HepG2 celler [18]. Det ble angitt at apoptotiske program for celledød ble avfyrt ved å aktivere initiatoren caspase-8, indusere mitokondrie ytre membran permeabilization (MOMP), mitokondrie fragmentering, og til slutt aktivering av nedstrøms proteaser Caspase-9 og -3. MOMP indusert utgangen av cytokrom c, dannelsen av apoptosome og til slutt aktivering av caspase-9 [25]. I den foreliggende undersøkelse ble caspase 9 aktivitet signifikant økt etter behandling av DU145-celler etter kombinasjonen av DTX og oktober behandling, impliserer det MOMP og mitokondrielle fragmentering induksjon, noe som resulterer i den observerte aktivering av apoptose i DU145 cellelinje.
VEGF signale fremmer angiogenese ved å stimulere vaskulære endotelceller spredning, migrasjon og tube dannelse og markert øker vaskulær permeabilitet [26]. VEGF familien omfatter fem medlemmer, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D og placenta vekstfaktor (PlGF) og VEGF-A er kjent for sine viktige roller i tumor-relatert angiogenese [27]. Derfor, undersøkte vi effekten av oktober, DTX og kombinasjonen av de to medikamenter på VEGFA ekspresjon i DU145-celler. Studien viste at kombinasjonen av DTX og oktober utøve en sterk hemmende effekt på VEGFA mRNA-ekspresjon, men hadde en moderat effekt av DTX alene behandling. Rapporter viste at VEGF-ekspresjon ble betydelig undertrykt i glioma celler ved oktober doseavhengig. Imidlertid oktober hadde liten effekt i mikromiljøet av hypoksi-indusert VEGF produksjon in vivo [28].
I den foreliggende undersøkelse vi viser en signifikant reduksjon i cellemigrering in vitro etter eksponering for de to medikamentkombinasjonsbehandling . Studie antyder at DTX i kombinasjon med oktober hemmer DU145 proliferasjon eller migrasjon gjennom hemming av frigjøring av peptidet VEGFA og deretter resulterer i hemming av cellemigrering. Studie rapporterte at økningen av VEGF /VEGFR samhandling forbedrer overføringen av tykktarmskreftceller [29]. Imidlertid ble noen inkonsistente studere resultatene oppdaget. For eksempel, i lever iskemisk reperfusjonsskade-modellen viste oktober den hemmende virkning på lever apoptose og svekkede hepatocytt skade forårsaket av iskemisk reperfusjon [30]. Kortsiktig anvendelse av oktober kan indusere oktober reseptor SSTR2 desensitivisering og internalisering, noe som hemmet apoptotisk effekt av oktober i leveren kreftceller [31]. Disse motstridende resultatene kan skyldes de ulike celle egenskaper, celle mikromiljøet, uttrykk for reseptorer og oktober behandling konsentrasjon.
Det er rapportert at ABCB1 er uttrykt i over femti prosent av resistente kreftformer og anerkjent som en hoved~~POS=TRUNC mekanismen som ligger bak medikamentresistens [32]. ABCB1 uttrykk ble oppregulert etter kjemoterapi i ulike svulster som en generalisert stress respons [33], [34]. I vår studie ingen signifikant forskjell ble observert mellom de ulike gruppene som ble behandlet med kombinert DTX og oktober, hvert enkelt agent alene og untreatment kontroll. Høy ekspresjon av ABCB1 genet før og etter at disse medikamenter behandling indikerer en DTX og /eller oktober legemiddelresistent cellelinje fra prostatakreft DU145-celler som er blitt observert i vårt tidligere studium av mus xenograft modell in vivo (data ikke publisert).
Disse dataene tyder på at kombinert behandling av DTX og oktober i DU145 og PC3-celler som utøves en større hemning av tumorcelle-proliferasjon og markert indusert apoptose, som kan være knyttet til oppregulering av kaspase 9/3 aktivitet og redusert ekspresjon av VEGFA in vitro. Selv om våre resultater må utvides til in vivo-modeller i fremtidige studier, heve de den spennende muligheten for at målretting mikrotubuli med et taxan kombinert en somatostain analog kan være en nyttig tilnærming for å forbedre resultatene i prostatakreft.
Støtte Informasjon
Figur S1.
Effekt av DTX alene, synergistisk effekt av DTX i kombinasjon med 100 nM oktober på PC3-celler proliferasjon etter 48 h (A) og 72 t (B) for behandling. Resultatene er den prosentandel av kontrollverdi oppnådd med ubehandlede celler (gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter utført i triplikat). (**) Sprednings ble betydelig redusert (
p
0,001); feilfelt = SEM
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
synergistiske virkning av DTX i kombinasjon med oktober på DU145-celler proliferasjon etter 48 timers behandling. Resultatene er den prosentandel av kontrollverdi oppnådd med ubehandlede celler (gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter utført i triplikat). (**) Sprednings ble betydelig redusert (
p
0,001); feilfelt = SEM
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Effekter av DTX alene, oktober alene og kombinasjonen av DTX /oktober på ekspresjon av VEGFA, caspase 9, caspase 3 og ABCB1 i DU145 celler ved QRT-PCR henholdsvis, ved hjelp av celler etter 48 timers behandling. Ekspresjonsnivået av hvert mRNA ble normalisert til nivået av β-aktin. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD av tre eksemplarer analyser (*
p
0,05, **
p
0,01)
doi: 10,1371 /journal.pone.0091817.s003. product: (TIF)
Figur S4.
Påvisning av kaspase 3, og caspase 9 ekspresjon i DU145 cellene ved western blot (A). Resultatene viser at betydelig kaspase 3 og caspase 9 uttrykk nivåer i DTX alene og i kombinasjon med oktober etter 48 timer behandling. (B) Densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av Kodak endimensjonal bildeanalyse programvare. (P 0,01)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Vekstkurver av prostatakreft xenograft PC3 (A) og DU145 (B) i kontrollmusene, kastrerte mus og mus behandlet med docetaxel inkludert to grupper på 10 mg /kg og 20 mg /kg docetaxel behandling. Tumor målingen starter fra medikamentell behandling (p 0,015). (N = 5)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s005 plakater (TIF)
