Abstract
Mange studier har vist at prostata stamcelle antigen (PSCA) er et attraktivt mål for immunterapi basert på overekspresjon i prostata svulst vev, spesielt i enkelte metastatisk vev. I denne studien evaluerte vi dendrittcelle (DC) -rettet lentiviral vektor (DCLV) som koder for murin PSCA (DCLV-PSCA) som en ny tumor vaksine for prostatakreft hos musemodeller. Vi viste at DCLV-PSCA kan fortrinnsvis levere PSCA-genet til DC-SIGN-uttrykker 293T celler og benmarg-avledede DC (BMDCs). Direkte immunisering med DCLV-PSCA i mannlig C57BL /6 mus fremkalte robuste PSCA-responsive CD8
+ og CD4
+ T celler
in vivo
. I en transgen adenokarsinom mus prostata cellelinje (TRAMP-C1) synergistisk svulst modell, vi videre vist at DCLV-PSCA-vaksinerte mus kan være beskyttet mot dødelig svulst utfordring i et forebyggende modell, mens lavere tumorvekst ble observert i en terapeutisk modell. Dette DCLV-PSCA vaksine viste også effekt ved å hemme tumormetastaser ved hjelp av en PSCA-uttrykk B16-F10-modellen. Samlet utgjør disse data tyder på at DCLV er en potent vaksine bærer for PSCA i å levere anti-prostatakreft immunitet
Citation. Xiao L, Joo KI, Lim M, Wang P (2012) Dendritic Cell-Directed Vaksinasjon med en Lentivector Encoding PSCA for prostatakreft hos mus. PLoS ONE 7 (11): e48866. doi: 10,1371 /journal.pone.0048866
Redaktør: Lucia Gabriele, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 15 juni 2012; Godkjent: 02.10.2012; Publisert: 06.11.2012
Copyright: © 2012 Xiao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (R01AI68978 og P01CA132681) og en translasjonell akselerasjon stipend fra Joint Center for translasjonell medisin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i 2011 godkjente FDA den første terapeutisk kreftvaksine for behandling av asymptomatisk eller litt symptomatisk hormon ildfast prostatakreft [1], [2], en stor oppmuntring for både pasienter med prostatakreft og forskere jobber med kreft immunterapi . Immunologiske terapier kan instruere immunsystemet til å gjenkjenne og eliminere tumorceller, som under normale forhold, vanligvis unnslippe fra immunovervåkning av downregulating tumor antigen presentasjon [3], eller ved å initiere immuntoleranse [4], [5]. For tiden har flere antigener blitt identifisert som potensielle immunterapi kandidater for prostata kreft vaksiner. De inkluderer prostata-spesifikt antigen (PSA) [6], prostata-stamcelle-antigen (PSCA) [7] – [10], prostata-spesifikt membran antigen (PSMA) [11], prostatisk sur fosfatase (PAP) [2] , mucin 1 (MUC1) [12], gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) [13], og NY-ESO-1 vaksine [14], blant andre. PSCA er et 123-aminosyre glykosylfosfatidylinositol (GPI) -bundne celleoverflateprotein som tilhører den Ly-6 familien [15]. PSCA er et attraktivt immunterapeutisk mål basert på sin overekspresjon i et flertall av prostata kreft celler, mens dens uttrykk i andre somatiske vev er sterkt begrenset [16]. Selv om den konkrete mekanismen bak bidraget fra PSCA til tumorvekst forblir udefinert har PSCA blitt funnet å korrelere positivt med tumor malignitet, patologi klasse og androgen-uavhengighet [16], [17]. Det ble foreslått at PSCA kan spille en rolle i å motvirke naturlig immunrespons [18]. Videre ble PSCA uttrykk oppregulert i metastatisk vev [16], [19]. Foreløpig antistoff rettet mot PSCA har blitt testet for å hemme prostatakreft tumorvekst og undertrykke metastasedannelsen [20], mens andre har undersøkt kimære antigen reseptorer (CAR) -baserte adoptiv T celler terapi rettet mot PSCA for dens potensial i behandling av prostatakreft [21 ]. Eksperimenter har også blitt gjennomført for å teste PSCA som en vaksine antigen, og det har blitt klart vist i dyremodeller som PSCA målrettede vaksiner kan forsinke prostatakreft progresjon [22], [23].
lentiviral vektorer ( LVS) er lovende vektorer for kreft immunterapi [24], [25], og de blir nå vurdert i mange kliniske studier for et bredt spekter av menneskelige sykdommer [26]. En ønsket egenskap av LVS er deres evne til å omsette både dele og ikke-delende celler [27], inkludert perifere DC [28], [29]. Som en vaksine bærer, kan LVS samtidig levere antigener til DC [24] og aktivere DC gjennom toll-like reseptorer (TLR) [30] – [36]. For ytterligere å forbedre LVS har mye arbeid vært rettet mot målretting LVS til antigenpresenterende celler (APC)
in vivo
å oppnå bedre spesifisitet og sikkerhet [37] – [40]. Vi har tidligere rapportert en DC-rettet LV (DCLV), som spesifikt kan målrette DCs uttrykker DC-spesifikke inter adhesjonsmolekyl gripe non-inte (DC-SIGN) og levere antigen gener til dem. Direkte
in vivo
vaksinasjon ved hjelp DCLV koding kylling ovalbumin (OVA) fremkalte høy frekvens av OVA-spesifikke CD8
+ og CD4
+ T-celle responser [41] -. [43] Hotell
i denne rapporten, undersøkte vi DCLV-medierte kreftvaksiner i en mer relevant klinisk setting, og utforsket styrken av denne vektor immunisering for å overvinne den immuntoleranse til den selv-tumorantigen PSCA og for å generere beskyttende immunitet mot prostatakreft. Vi viste at DCLV koding PSCA (DCLV-PSCA) kunne målrette DC-SIGN-uttrykke cellelinjer og benmargavledede DC (BMDCs). Direkte immunisering ved haleroten fremkalt sterke PSCA-spesifikke T-celle-responser i mus prostatakreft modell. Videre vaksinering kan hemme tumorvekst på utfordringen med TRAMP-C1 tumorceller i mus. Når denne vaksinen ble benyttet i en terapeutisk setting, kan det undertrykke veksten av etablerte TRAMP-C1 tumorer. Våre data viser at anti-prostata tumor immunitet ved DCLV-PSCA avhenger av tilstedeværelsen av både CD8
+ og CD4
+ T-celler. Til slutt viste vi at immunisering med DCLV-PSCA kan effektivt hemme metastasering av B16-PSCA celler i lungevevet.
Resultater
Generering av DCLV-PSCA og dens evne til å målrette DC-SIGN -expressing celler in vitro
Vi konstruerte en lentiviral ryggrad som koder for den fulle lengde av murine PSCA og testet for ekspresjon av PSCA i 293T-celler. 293T celler ble transient transfektert med FUW-Null eller FUW-PSCA vektor. To dager etter transfeksjon, ble cellene samlet opp for ekspresjon av PSCA ved fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) analyse. 293T-celler transfektert med den FUW-PSCA plasmid viste positivt uttrykk for PSCA (22,5%), mens celler transfektert med den FUW-Null plasmid hadde bare bakgrunnsfarging (figur 1A).
(A) 293T-celler ble transfektert forbigående med plasmider FUW-Null (mock kontroll, blå linje) eller FUW-PSCA (rød linje). To dager senere ble cellene samlet opp og farget for PSCA ekspresjon analysert ved flow-cytometri. 293T-celler farget med isotype antistoff, ble inkludert som en kontroll (grå nyanse område). (B) 293T celler ble transfektert transient med plasmider FUW-PSCA, SVGmu, og andre nødvendige lentiviral emballasje plasmider å produsere DCLV-PSCA vektorer. Frisk virus supernatant ble brukt til å transduce 293T celler (blå linje) eller 293T.hDC-SIGN celler (rød linje) med MOI = 10. PSCA uttrykk ble analysert ved flowcytometri 3 dager etter transduksjon. (C) på benmarg-avledede DC ble omformet med en mock vektor DC-LV-Null eller DC-LV-PSCA vektor. Fem dager senere ble CD11c og PSCA ekspresjon bestemt ved strømningscytometrisk analyse. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger og representative data vises.
Vi benyttet tidligere rapporterte 293T.DC-SIGN celler [41] for å undersøke muligheten for DCLV å uttrykke PSCA. Som vist i figur 1B, omtrent 60% av de 293T.DC-SIGN-celler viste PSCA ekspresjon etter DCLV-PSCA transduksjon, mens bare 6,79% var PSCA-positive i 293T-celler. Spesifisiteten observert her er i samsvar med tidligere rapporter som viser evne DCLV til fortrinnsvis transduce DC-sign-uttrykke celler [41], [44]. Vi videre undersøkt om DCLV-PSCA kunne målrette og mekle PSCA uttrykk i benmargen-avledet DC (BMDCs). Umodne BMDCs var avledet fra den murine benmargskultur og bekreftet ved strømningscytometrisk analyse av celleoverflate markør CD11c (figur 1C). Når de utsettes for LVS, ble DCs selektivt endret av DCLV-PSCA å uttrykke PSCA (3,65% i CD11c
+ celler vs. 0,11% i CD11c
– celler, figur 1C). Våre resultater indikerer at DCLV-PSCA kunne målrette DC-sign-uttrykke celler og levere PSCA antigen til DC
in vitro
.
Induksjon av PSCA spesifikke CD8
+ og CD4
+ T celle immunresponser in vivo
for å finne ut om denne rekombinant DCLV-PSCA vektor kan effektivt levere antigen til DC og montere antigen-spesifikk T-celle responser
in vivo
, vi utførte vaksinasjon med DCLV-PSCA direkte til mannlige C57BL /6 mus. På grunn av variasjonen av DC-fordeling, immunisering utført ved forskjellige administreringsveier kan resultere i forskjellig antall DC å være målrettet, som fører til ulike nivåer av antigen-presentasjon. Som sådan, er sammenligningen av det immunogene respons utløst via forskjellige ruter er nødvendig for å etablere en optimal immuniseringsprotokoll. Derfor ble naive hann C57BL /6 mus immunisert med en enkelt dose av DCLV-PSCA (6 x 10
7 TU) ved intradermal område (id, på undersiden av halen), fotputen område (fp), intramuskulær område ( im), subkutane område (sc), eller intraperitoneal plass (ip). En tidligere rapportert CD8
+ epitop peptid for PSCA [23] ble brukt til å karakterisere PSCA-spesifikke CD8
+ -T-celleresponser i milten via IFN-γ intracellulær cytokin farging (ICCS). Som vist i figur 2A og 2B, er i.d. og F.P. administreringsveier resulterte i den sterkest PSCA-spesifikke CD8
+ T-cellerespons (ca. 2%) to uker etter immunisering. I.m. administreringsveier hadde nådd en moderat reaksjon (~1.2%), mens den s.c. og i.p. injeksjoner resulterte i en mye lavere respons ( 0,5%). Denne reaksjon trenden er i overensstemmelse med resultatene fra immunisering med DCLV som koder for HIV-1 Gag [45] eller menneske gp100 [44]. Basert på den indre diameter tilførselsvei, noe som ga den høyeste CD8
+ T-cellerespons, ble forskjellige doser av DCLV-PSCA (2~80 x 10
6 TU) administreres. Som vist i figur 2C, CD8
+ T-cellerespons var doseavhengig, noe som øker fra 0,5% til 2%. Således, en optimal immunisering diett av i.d. injeksjon av DCLV-PSCA med 80 × 10
6 TU ble ansatt for senere studier. For ytterligere å vurdere antigen-spesifikke CD8
+ T-celle-responser fremkalt ved i.d. immunisering, en ELISPOT-eksperiment som måler IFN-γ sekresjon fra T-celler fra både milt og inguinale lymfeknuter ble gjennomført. Ut av 1 million celler, ca 800 og 300 celler reagert på CD8
+ epitop peptid i milten og i lyskelymfeknutehenholdsvis (figur 2D).
(A) Mann C57BL /6 mus ble immunisert med 6 × 10
7 TU av DCLV-PSCA gjennom ulike administrasjonsveier: intraperitoneal plass (IP), subkutan området (sc), intramuskulær området (im), footpad (fp), eller intradermal (bunnen av hale, id). En immunisering gruppen ble inkludert som en negativ kontroll. To uker etter immunisering ble splenocytter fra mus høstet og analysert for tilstedeværelse av PSCA-spesifikke CD8
+ T-celler ved restimulating splenocytter med en PSCA peptid (PSCA
83-91), etterfulgt av intracellulær farging for IFN y og overflatefarging for CD8. Prosentandel av IFN-γ-utskillende CD8
+ T-celler er angitt. (B) Statistisk sammenligning av immunisering fremkalt ved administrasjon av DCLV-PSCA mellom ulike administrasjonsveier. (C) Male C57BL /6 mus ble immunisert med forskjellige doser av DCLV-PSCA vektorer (0, 2, 10, 40 og 80 millioner TU) på basis av halen. To uker etter vaksinasjon, PSCA-spesifikke CD8
+ T-celler fra milt ble analysert ved restimulating med peptidet PSCA
83-91, etterfulgt av intracellulær farging for IFN-γ. (D) Fremstilling av PSCA-spesifikke IFN-y-utsondrende celler fra både milt (SP) og inguinal lymfeknuter (LN) ble evaluert ved restimulering med PSCA
83-91 peptidet, etterfulgt av ELISPOT-analyse for IFN-γ . (E) Fremstilling av PSCA-spesifikke IL-2 fra splenocytter (med CD8
+ T-celler utarmet) ble målt ved restimulering med 293T cellelysat transfektert til å uttrykke PSCA, etterfulgt av ELISPOT-analyse for IL-2. (**:
P
0,01; *:
P
0,05; En-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest Feilstolper representerer SD.). Alle forsøk ble gjentatt tre ganger og representative data vises.
med tanke på viktige rollen CD4
+ i tumorimmunterapi, ble en IL-2 ELISPOT analysen ansatt for å undersøke CD4
+ T-cellerespons utløst av denne immunisering strategi. Vi har oppdaget at omtrent 250 CD4
+ T-celler per million miltceller som er i stand til å skille ut IL-2 i respons på lysater fra 293T-celler transfektert med den FUW-PSCA plasmid (figur 2E). Våre resultater viser at DCLV-PSCA var effektivt som en vaksine bærer for å stimulere både CD8
+ og CD4
+ T celle responser i mus.
generasjon av anti-prostata svulst immunitet i både forebyggende og terapeutiske modeller
i lys av PSCA spesifikke CD8
+ og CD4 observert
+ T celle respons, var det nødvendig å vurdere antitumor effekt gitt av DCLV-PSCA immunisering. En transplantert musetumormodell med det transgene mus adenokarsinom prostata cellelinje (TRAMP-C1) [46] ble anvendt for denne evalueringen. Mann C57BL /6 mus ble vaksinert med DCLV-PSCA, DCLV-Null eller venstre ubehandlet. Disse mus ble deretter utfordret 10 dager senere etter s.c. injeksjon av 5 × 10
5 TRAMP-C1 celler (figur 3A). Tumor beskyttelse ble observert i DCLV-PSCA-vaksinerte gruppe med 8 av 12 mus tumorfri etter 44 dager etter tumor-utfordring (figur 3B, nederst til venstre). Videre de andre 4 mus i denne gruppen viste en mye lavere veksttakt enn i nullvektor gruppen. Spesielt, vaksinering med DCLV-Null mislyktes i å gi noen målbar tumor suppresjon fordel sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3B, øverst til høyre til øverst til venstre). Totalt sett mus fra DCLV-PSCA gruppen viste en signifikant bedre overlevelse enn for mus fra enten DCLV-Null eller kontrollgruppe. Alle tumorer fra DCLV-Null og kontrollgruppe overskredet den maksimale størrelsen innen 55 dager (tumorstørrelse på 2000 mm
3 ble anvendt som et surrogat sluttpunkt for å overleve), mens den DCLV-PSCA gruppe overlevde mer enn 70 dager (figur 3B, nederst til høyre).
(A, B) Mann C57BL /6 mus ble immunisert med 8 × 10
7 TU av DCLV-PSCA, mock vektor DC-LV-Null, eller PBS kontroll på undersiden av halen. Ti dager etter immunisering, ble disse musene utfordret subkutant med 5 × 10
5 av TRAMP-C1 tumorceller. Tumor vekstkurver ble overvåket med en fin caliper, og tumor volum ble beregnet på grunnlag av de største vinkelrette diameter (mm
3), i henhold til formelen
V = ab
2π /6
, hvor
en
og
b
er de største vinkelrette diameter. Representant Kaplan Meyer overlevelse kurve for profylaktisk svulst utfordring (n = 12). (C, D) Male C57BL /6 mus ble implantert med 5 x 10
5 TRAMP-C1 tumorceller subkutant, og 18 dager senere, er disse tumor-bærende mus ble behandlet med 8 x 10
7 TU av DCLV -PSCA (n = 12) eller DCLV-Null (n = 12) på undersiden av halen. Tumorvolumet ble overvåket og beregnet som tidligere beskrevet. Representant Kaplan Meyer overlevelse kurve for terapeutisk svulst utfordring. (***:
P
0,001; Log-rank (Mantel-Cox) test Feilfelt representerer SEM..) Alle forsøk ble gjentatt to ganger og representative data vises
.
Vi videre undersøkt om DCLV-PSCA kan være potent til inhibering av tumorvekst i en terapeutisk TRAMP-C1-modell, hvor en svulst allerede hadde blitt etablert (figur 3C). Tumorbærende mus terapeutisk vaksinert med DCLV-PSCA viste signifikant lavere tumorvekst (figur 3D, øvre og midtre), og gjennomsnittlig overlevelse ble forlenget fra 49,5 dager til 64 dager etter den DCLV-PSCA immunisering (figur 3D, lavere).
Avhengighet av vaksine-fremkalte antitumor immunitet på infiltrert CD8
+ og /eller CD4
+ T-celler
i et forsøk på å ytterligere forstå rollene til CD8
+ og CD4
+ -T-celler i antitumorimmunitet, ble tumor vevsprøver fra DCLV-Null- eller DCLV-PSCA-immuniserte mus ble oppsamlet, parafin-innleiret, og utsatt for farging av kjernen og overflatemarkører. Som vist i figur 4A, immuniseringen resulterte i infiltrasjon av flere T-celler (som identifisert ved CD3 farging), inkludert både CD4
+ og CD8
+ T-celler i tumorvev høstet fra DCLV-PSCA-immuniserte mus, enn for DCLV-Null-behandlede mus. Dette indikerer at både cytotoksiske og hjelper-T-celler som kan infiltrere inn i den lokale tumorvevet i respons til immunisering. For å bestemme avhengigheten av antitumoreffekt på følgende infiltrerte T-celler, en
in vivo
T-celle-uttømming eksperiment ble utført. Fire grupper av mus ble inokulert med TRAMP-C1 svulster, der tre gruppene ble deretter immunisert med DCLV-PSCA 14 dager etter tumor utfordring, mens de resterende gruppen ble vaksinert med DCLV-Null. For DCLV-PSCA-immuniserte grupper, ble en gruppe behandlet med et antistoff som er i stand til å tappe CD4 + T-celler, og en annen gruppe ble behandlet med et antistoff som er i stand til å tappe CD8
+ T-celler (Figur 4B). Som vist tidligere, kan DCLV-PSCA immunisering betydelig generelt tregere tumorvekst. I motsetning til dette, svulster i grupper med utarming av enten CD8
+ eller CD4
+ T-celler utviklet en raskere hastighet av tumorvekst, selv om noen tumor-beskyttende virkning var tilbake. Spesielt, CD8
+ T-celle-fratatte gruppe hadde markert større svulster enn for CD4
+ T-celle-fratatte gruppe (figur 4C). Våre data indikerer videre at T-celler er ansvarlige for den observerte vaksine-induserte antitumorimmunitet og at CD8
+ T-celler spiller jo mer uunnværlig rolle i å kontrollere tumorvekst.
(A) Infiltrasjon av T-celler i tumorvev. TRAMP-C1 svulster fra tumorbærende mus ble skåret 3 uker etter immunisering, parafininnebygd, og farget for immunfluorescens-konjugert CD3, CD4 og CD8 antistoff (grønn farge som angitt med hvite piler) sammen med nukleær farging (rød farge) . Representative bilder som viser CD4
+ og CD8
+ T-celler infiltrert til tumorvev fra DCLV-PSCA-immuniserte mus sammenlignet med de av DCLV-Null-immunisert mus. (B) Fire grupper av hann C57BL /6-mus (n = 8 for hver gruppe) ble transplantert med 5 x 10
5 TRAMP-C1-celler subkutant ved dag 0. Fjorten dager senere ble 3 grupper immunisert med DCLV-PSCA , mens den andre gruppen ble immunisert med mock vektor DCLV-Null. To grupper av mus fra DCLV-PSCA-immunisert grupper ble utsatt for CD4
+ eller CD8
+ T-celle uttømming ved å injisere CD4 eller CD8-uttømming antistoff intraperitonealt. (C) Tumorvolumet for hver gruppe av mus ble overvåket. Feilfelt representerer SEM. Alle forsøk ble gjentatt to ganger og representative data vises.
Beskyttelse mot lungemetastaser av B16-PSCA celler
Overuttrykte PSCA ble identifisert til å være forbundet med prostata tumormetastaser i mange studier, noe som gjør det til et ideelt mål for immunterapi. For å lette studiet av evnen til DCLV-PSCA immunisering for å hemme tumormetastase dannelse, ble villtype-B16-F10 celler som stabilt uttrykker PSCA konstruert (betegnet som B16-PSCA). Mann C57BL /6 mus ble først vaksinert med DCLV-PSCA eller DCLV-Null som en negativ kontroll. Ti dager senere ble syngeniske B16-PSCA tumorceller injisert intravenøst til dyrene. Etter ytterligere 14 dager ble dyrene hentet, og lungemetastatisk innskudd ble kvantifisert makroskopisk. Sammenlignet med DCLV-Null, DCLV-PSCA immunisering markant redusert antall overflaten lungemetastaser dannelse ( 75%, figur 5A og 5C). Histologiske lunge vevsprøver fra de to ovennevnte gruppene ble også undersøkt mikroskopisk for metastase innskudd, og en lignende funn ble observert (figur 5B). I motsetning til dette ble den beskyttende immunitet for DCLV-PSCA bare begrenset til PSCA-uttrykkende melanomaceller, slik det ble ikke observert noen signifikant forskjell når B16-F10 tumorceller ble transplantert (figur 5C). Disse resultatene bekreftet PSCA spesifikke antitumor immunitet ved DCLV-PSCA immunisering og dens evne til å undertrykke metastasedannelse.
(A) Mann C57BL /6 mus ble immunisert med DCLV-PSCA eller DCLV-Null som en mock-kontroll . Ti dager senere ble mus utfordret med 0,2 millioner B10-F10-PSCA celler ved intravenøs injeksjon gjennom halevenen. To uker senere ble musene avlivet, og makroskopiske visninger av lungene ble vist. (B) Mikroskopisk H E-farging (20 ×) av lunge vevsprøver fra mus immunisert med DCLV-PSCA eller DCLV-Null. (C) Statistisk kvantifisering av melanom lungemetastaser (antall sorte knuter på lungene) av immuniserte mus; lignende immunisering, men med de opprinnelige B16-F10-melanommetastaser inngår som en kontroll. (**:
P
0,01 og n /s.: Ikke statistisk signifikant, One-way ANOVA etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest Feilstolper representerer SD, n = 4). Alle forsøk ble gjentatt to ganger og representative data vises.
Diskusjoner
DC-baserte behandlinger har vist lovende resultater for kreft immunterapi [47], [48]. DC-rettet LVS er effektive vaksine vektorer. De er i stand til å omsette og aktivere DC
in vivo Hotell og megle holdbar transgene uttrykk, som kan deretter behandles av DC og presenteres for T-celler som antigener [49]. I tillegg er disse vektorer konstruert for å være ikke-replikerbare og med minimum av virale proteiner blir uttrykt, og, derfor, er mindre anti-vektor immunitet funnet [44]. Videre, på grunn av DC-spesifikk transduksjon, færre sikkerhet og off-target oppstå bekymringer når DC brukes som vaksine kjøretøy
in vivo product: [41]. I våre tidligere studier har vi vist at DC-rettet LVS (DCLVs) kan lokke fram sterke immunresponser mot OVA [50], HIV-gag [45], og hgp100 [44] antigener. I denne studien evaluerte vi DCLVs bærer PSCA, en sann selv tumor antigen for prostatakreft, som en vaksine for syngene transplantert prostata svulst
in vivo
. Så langt vi kjenner til, representerer dette den første studien å bruke DCLVs som en vaksine modalitet mot en selv svulst antigen i dyremodeller. Vi viste at DCLV-PSCA vaksinering kan overvinne den toleranse til selv-antigen PSCA og generere holdbare antigen-spesifikke T-celle-responser
in vivo
. Dette immunisering monterer en immunrespons som er i stand til å undertrykke etablering av TRAMP-C1 prostatakreft og sakker tumorvekst i en terapeutisk modell.
Konvolutten protein brukes til pseudotyping LVS er en konstruert form for Sindbis virus glykoprotein (SVGmu). Villtypen av dette glykoprotein har bindende affinitet til både heparin sulfat og DC-SIGN; DC-SIGN er et overflateprotein som uttrykkes hovedsakelig i makrofager og visse undergrupper av DCs [51]. Vi oppnådde målretting av DC ved å deaktivere heparin sulfat bindende og beholde den DC-SIGN binding av Sindbis virus glykoprotein. Det er vist at bindingen av SVGmu til DC-SIGN er avhengig av høy mannose struktur på DC-SIGN. Derfor kan viral glykoprotein bli ytterligere konstruert for å vise en høyere mannose struktur for å forbedre effektiviteten transduksjon [52]. Vi først bekreftet at DCLV-PSCA kan produseres effektivt og selektivt transduce DC-SIGN-uttrykke celler.
in vitro
BMDC transduksjon analysen underbygger den observasjon at DCLV-PSCA kan direkte levering av PSCA antigen i DC.
Det er tidligere vist at hud-avledet DC er hovedmål for LV-baserte vaksinasjon [49]. Fordelingen og tilgjengeligheten av DC i forskjellige deler av kroppen variere, slik at immunisering via forskjellige ruter kan utløse forskjellige nivåer av immunresponser. Vi har tidligere rapportert at F.P. ruten hadde en relativt høyere respons over andre administrasjonsveier for noen antigen leveranser [44], [45]. I denne studien har vi sammenlignet direkte immunresponser utløst gjennom ulike vaksinasjons ruter (indre diameter, F.P., i.m., subkutant og intraperitonealt). Interessant, fant vi at indre diameter og f.p injeksjoner generert mye høyere respons enn de i.m. og s.c rute, mens i.p. administrasjon resulterte i laveste respons. Immunisering genereres gjennom indre diameter rute vises en litt høyere respons enn den F.P. rute. For å veie opp for dette resultatet, er det spekulert i at DCLV-PSCA har en bedre sjanse for å møte DC når det gis gjennom enten i.d. eller F.P. ruten.
En enkelt dose av DCLV-PSCA var i stand til å beskytte disse musene fra prostata svulst utfordring og forbedret sin overlevelse. Dette resultatet er i samsvar med en tidligere studie ved hjelp av en påfyllings- /løft strategi for å generere PSCA-spesifikk immunrespons i et profylaktisk modell [22], [23], selv om DCLV-PSCA fremkalte en høyere størrelsesorden CD8
+ T-cellerespons. I en TRAMP-C1 terapeutisk modell, vår radar vaksine markert bremset tumorvekst og utvidet mus overlevelse, mens den tidligere stats /boost vaksine metode knapt generert tilfredsstillende svulst beskyttelse [22]. Dette resultat kan forklares ved tidsintervallet mellom tumor-inokulering og tumor palpability, vil en periode på rundt 20~25 dager. Dessuten tar det betydelig lengre tid å gjennomføre den prim /boost immunisering, noe som trolig fører til mangler det mest beleilig tid til å bremse ned kreft progresjon. Dermed er en potensiell fordel av DCLVs deres evne til å overvinne immuntoleranse og etablere et effektivt antitumor immunrespons innen 2 uker.
Begge CD8
+ og CD4
+ T-celler infiltrert i lokale tumorvev følgende DCLV-PSCA immunisering. Selv om CD8
+ og CD4
+ T-celler er begge nødvendige for tumor beskyttelse, viser antistoffet uttømming eksperiment som CD8
+ T-celler spiller en viktig rolle i å kontrollere tumorvekst. Det har blitt godt etablert at cytotoksiske CD8
+ T-celler som direkte kan drepe tumorceller [53] – [55]. Som for CD4
+ T-celler, flere mulige årsaker forklare deres behov for svulst beskyttelse. Først CD8
+ T-celler er avhengig av CD4
+ T-celler [56], [57] for å utløse sterke immunresponser. Tidligere har vi observert en CD4-avhengig CD8
+ T-cellerespons som ble utløst av DCLVs [58]. Sekund, i det minste en del av antitumoreffekt mediert av Th1 respons, som er avhengig av CD4
+ T-celler [59].
For tiden finnes det ingen pålitelig behandling for å kurere avansert metastatisk prostata kreft. PSCA er sterkt uttrykt i metastatisk vev for prostatakreft, og er derfor et godt mål for kreft immunterapi. Vi har vist i denne studien at DCLV-PSCA kan generere immunitet i stand til å undertrykke lungemetastaser i B16-PSCA modell. Interessant, da det samme antall av B16-F10 eller B16-PSCA-celler ble injisert intravenøst, B16-PSCA-celler var i stand til å generere flere lungemetastasedannelse enn den til B16-F10 celler (figur 5C). I dag, forholdet mellom tumormetastase og PSCA uttrykket har ikke blitt grundig undersøkt, selv om noen studier tyder på at PSCA kan spille en rolle i å begrense svulst migrasjon og metastase [60]. Likevel er flere studier for å videre forstå hvordan PSCA uttrykk bidrar til prostata kreft metastasering, og B16-PSCA kan være en egnet modell for slike studier.
Til sammen har vi rapportert en roman DCLV vektorsystem som kan leverer selv-tumor antigen PSCA til antigen-presenterende celler og montere vaksine-spesifikke immunresponser. Dette DCLV-PSCA kan overvinne immuntoleranse til PSCA, generere T-celle immunitet som kan beskytte mus i TRAMP-C1 prostata tumormodeller, og hemme B16-PSCA lungemetastase formasjon. Disse resultatene gir bevis for å støtte bruk av DCLVs å levere prostata kreft vaksiner.
Materialer og metoder
Mus og cellelinjer
Mann C57BL /6 mus (6-8 uker gamle) ble kjøpt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA). Alle mus ble opprettholdt i dyrefasiliteter ved University of Southern California (USC) under kontrollert temperatur og en 12 timers lys /mørke syklus, med fri tilgang til vann og standard laboratorium chow. Animal prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjer fastsatt av National Institutes of Health (NIH publikasjon nr 85-23, revidert 1996) og dyret protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité USC (2010-11450) . Den tumorstørrelse på 2000 mm
3 ble anvendt som et surrogat sluttpunkt for å overleve, og mus blir avlivet ved CO2-inhalering fra en tank kilde og en oppfølgings cervikal dislokasjon. TRAMP-C1-celler ble erholdt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i DMEM høy glukose (Cellgro, Manassas, VA, USA) med L-glutamin supplert med 5% FBS, 5% Nu Serum IV (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), storfe bukspyttkjertelen insulin 5 mikrogram /ml (Sigma, St. Louis, MO, USA) og 10 nM dehydroisoandrosterone (ChromaDex, Irvine, CA, USA). B16-F10 celler ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i DMEM høy glukose (Cellgro, Manassas, VA, USA) med L-glutamin supplert med 10% FBS. B16-F10-celler som stabilt uttrykker PSCA ble generert av transducing B16-F10 celler med lentivirus (FUW-PSCA) pseudotyped med vesikulær stomatitt viruset glykoprotein (VSVG), og klonale celler ble valgt.
produksjon og konstruksjon av lentiviral vektorer
lentiviral ryggrad plasmid FUW-PSCA ble konstruert ved innsetting av cDNA av murine PSCA nedstrøms av ubiquitin promoter i FUW. FUW er et HIV-1-stammer lentiviral plasmid sammensatt av et indre human ubikvitin-C-promoteren for å drive transgene ekspresjon og woodchuck reagerende element for å forbedre stabiliteten av RNA-transkriptet [61]. Vi har anvendt en tidligere rapportert fremgangsmåte for transient transfeksjon av 293T-celler til å produsere den DCLV-PSCA vektor [41].
