Abstract
Bakgrunn
γ-stråling er en effektiv behandling for kreft. Det er dokumentert at strålebehandling støtter tumor-spesifikk immunitet. Det ble beskrevet at bestråling induserer de novo proteinsyntesen og forbedrer antigen presentasjon, vi derfor undersøkt om γ-stråling fører til økt uttrykk av kreft-testis (CT) antigener og MHC-I, og dermed gir effektiv immunologisk kontroll. Dette er relevant fordi ekspresjon av CT-antigener og MHC-I på tumorceller er ofte heterogene. Vi fant at endringer indusert av γ-stråling fremme immunologisk gjenkjennelse av tumoren, som er illustrert ved den økte infiltrasjon av lymfocytter etter strålebehandling.
Måter /Funn
Vi sammenlignet ekspresjonen av CT-antigener og MHC-i i ulike kreftcellelinjer og ferske biopsi før og etter
in vitro
bestråling (20 Gy). Videre vi sammenlignet paret biopsier som ble tatt før og etter strålebehandling fra sarkom pasienter. For å undersøke hvorvidt den endrede ekspresjon av CT-antigener og MHC-I er spesifikk for γ-stråling eller er en del av en generalisert stressrespons, analyserte vi virkningen av hypoksi, hypertermi og genotoksiske stress på ekspresjonen av CT-antigener og MHC- JEG.
In vitro
bestråling av cancercellelinjer og av friske tumor-biopsier induserte en høyere eller de novo ekspresjon av forskjellige CT-antigener, og en høyere ekspresjon av MHC-I i en tids- og doseavhengig måte. Viktigere, viser vi at bestråling av kreftceller forbedrer deres gjenkjennelse av tumorspesifikke CD8 + T-celler. Analysen av parede biopsier tatt fra en kohort av sarcoma pasienter før og etter radioterapi bekreftet våre funn, og i tillegg viste at bestrålingen resulterte i høyere infiltrasjon av lymfocytter. Andre former for stress ikke har en innvirkning på uttrykk for CT-antigener eller MHC-I.
Konklusjoner
Våre funn tyder på at γ-stråling fremmer den immunologiske anerkjennelse av svulsten. Vi foreslår derfor at å kombinere radioterapi med behandlinger som støtter svulst spesifikk immunitet kan resultere i økt terapeutisk effekt
Citation. Sharma A, Bode B, Wenger RH, Lehmann K, Sartori AA, Moch H, et al. (2011) γ-stråling Fremmer Immunologisk Anerkjennelse av kreftceller gjennom økt uttrykk av kreft-testikler antigener
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 6 (11): e28217. doi: 10,1371 /journal.pone.0028217
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 02.05.2011; Godkjent: 03.11.2011; Publisert: 29.11.2011
Copyright: © 2011 Sharma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ludwig Institute for Cancer Research /Cancer Research Institute (Cancer Antigen Discovery Collaborative), Atlantic Philanthropies, den Cancer Research Institute, Hanne Liebermann Foundation, Hartmann Muller Foundation, Terry Fox Foundation og Ellinger Foundation, med Alumini universitet Zürich (www.alumuni.uzh.ch). Alessandro A. Sartori er støttet av Vontobel-stiftelsen og ved en Ambizione fellesskap fra den sveitsiske National Science Foundation (SNSF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
γ-stråling eller radioterapi er en av de mest brukte behandlinger for kreft [1]. Bestråling induserer død av tumorceller [2], [3], men det er vist at adaptiv immunitet i betydelig grad bidrar til effektiviteten av radioterapi [4]. For eksempel blir bestrålt tumorer hos pasienter og hos mus oftere infiltrert av leukocytter enn de ubestrålte tumorer [5], [6], [7] og meget nylige studier i prekliniske modeller viste at effekten av strålebehandling avhenger av tilstedeværelsen av CD8
+ T-celler [8]. Det faktum at svulster er målrettet og styres av CD8
+ T-celler som er foreslått av den økte tumortilfeller i immunsvekkede pasienter [9], [10], [11], og ved det faktum at tumor-spesifikk immunitet kan påvises i kreftpasienter [12], [13], [14], [15]. Som gjenkjennelse av tumorceller ved CD8
+ T-celler er avhengig av presentasjonen av tumor-assosierte antigener (TAA) i sammenheng med MHC-I molekyler, den ofte heterogene ekspresjon av TAA og /eller MHC-I i løpet av en tumor påvirker negativt på effekten av tumor-spesifikk immunitet. I den foreliggende undersøkelse spurte vi bestemt spørsmål om bestrålingen induserer eller opp-regulerer ekspresjonen av et fremtredende gruppe av TAA, de såkalte CT-antigener. CT-antigenene danne en utvidet familie av antigener som er uttrykt i et stort utvalg av ondartede sykdommer, men er fraværende fra friskt vev bortsett fra testis og placenta [16], [17]. Kreftpasienter ofte utvikler spontane immunresponser mot CT-antigener, som illustrerer deres immunogenisitet [18]. På grunn av deres immunogenisitet og begrenset mønster av uttrykk, er CT-antigener ansett lovende mål for immunterapi hos kreftpasienter [19], [20]. Vi har observert at strålingsinduserte en høyere eller en
de novo
ekspresjon av forskjellige CT-antigenene, så vel som en oppregulering av MHC-I ekspresjon i flere cancercellelinjer og i frisk,
ex vivo
bestrålt tumor biopsier. Viktigere, sammenligning av sammenkoblede tumorsnitt hentet fra sarkom pasienter før og etter bestråling viste oppregulert eller
de novo
uttrykk for MHC-I og CT-antigener og samtidig økning av infiltrerende CD8
+ T-celler Dette tyder på at bestråling mobiliserer lokale, tumor-spesifikke immunresponser. Videre våre funn tyder på at en kombinasjon av strålebehandling og aktiv immunisering med relevante CT-antigener kan være en behandlingsform med høyere effekt sammenlignet med enten terapi alene.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
den etiske komiteen «Etisk komité av kantonen Zürich» spesielt godkjent denne studien (studie No: EK-1017)..
Cells
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
MDA-MB-469, MDA-MB-231 og MCF 7 (brystkreft cellelinjer), MCF 10A (normal brystcellelinje, udødeliggjort, ikke-transformert), Saos, LM5, 143B, HOS, HU09, og M132 (osteosarkom cellelinjer), A549, H460, Calu1 og Calu3 (cancercellelunge linjer), SK-MEL-37 (melanom cellelinje) og PC3 og DU145 (prostatacancercellelinjer) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). De osteosarcom cellelinjer var en gave fra Dr. Bruno Fuchs (Institutt for ortopedi, universitetsklinikken Balgrist, Zürich). Alle cellelinjer og biopsier ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO), L-glutamin og antibiotika. PC3 og DU145 ble dyrket i DMEM-medium (Invitrogen) inneholdende 10% FBS, L-glutamin og antibiotika.
Primære humane celler.
human forhud keratinocytter ble erholdt som en gave fra dr Onur Boyman (Hudavdelingen, Universitetssykehuset Zurich) og ble dyrket i keratinocytt serum fritt medium (K-SFM, Invitrogen), tilskudd (EGF humant rekombinant og Bovine hypofyseekstrakt, Invitrogen), L-glutamin og antibiotika som beskrevet [21] . Normale humane dermale fibroblaster (NHDF) ble oppnådd fra PromoCell GmbH (Heidelberg, Tyskland). Humane mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) ble erholdt som en gave fra Dr. Therese Resink (Institutt for biomedisin, universitetssykehuset Basel) og ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Invitrogen) supplementert med 5% FBS (Sigma-Aldrich ) og antibiotika. Humane lungefibroblaster (MRC-5) ble erholdt som en gave fra Dr. Giancarlo Marra (IMCR, Zurich) og ble opprinnelig oppnådd fra Coriell Cell lagringssteder (Camden, NJ) og dyrket i MEM-medium (Invitrogen), inneholdende 15% FBS, L-glutamin og antibiotika. ZT-821 celler (primærnyreceller) ble etablert i vår lab fra en enkelt celle suspensjon av frisk nyre vev. De NHDF og ZT-821-celler ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) inneholdende 10% FBS (Sigma-Aldrich), L-glutamin og antibiotika.
Behandling av celler
Ioniserende stråling.
Cells og ferske tumor biopsier ble utsatt for y-stråling fra en
60Co kilde. De doser av bestråling anvendt er beskrevet i hvert eksperiment.
hypertermi.
Celler ble inkubert ved 42 ° C i 1 time og 5 timer og deretter dyrket i 72 timer ved 37 ° C. De behandlede og ikke-behandlede celler ble deretter behandlet for analyse ved RT-qPCR.
Hypoksi.
Celler ble inkubert i henhold til hypoksiske betingelser (1% O
2 vol /vol) igjen en hypoksisk arbeidsstasjon (InVivoO
2-400, Ruskinn Technology, Leeds, UK) for ulike tidspunkt (8 t, 48 timer eller 72 timer). De behandlede og ikke-behandlede celler ble deretter behandlet for analyse ved RT-qPCR.
Gentoksisk stress.
Cellene ble behandlet ved 37 ° C med 1 mg /ml cisplatin (Sigma-Aldrich Corp. . St. Louis, MO) i 24 timer eller med 15 uM etoposid (Sigma-Aldrich) i 1 time eller med 150 uM bleomycin (Sigma-Aldrich) i 1 time. Dette tidspunkt ble ansett som T
0. Ved slutten av behandlingen ble mediet erstattet med friskt kulturmedium uten medikamentet. Cellene ble deretter dyrket i ytterligere 72 timer ved 37 ° C. Kontrollkulturer ble behandlet under lignende forsøksbetingelser i fravær av medikamentet.
Lie-molekyl protein kinase inhibitorer.
A lager-konsentrasjon på 10 mM i 100% dimetylsulfoksyd (DMSO) av spesifikk hemmere for ataksi telangiectasia mutert (ATM), KU 55933 (Tocris biovitenskap, Ellisville, MO) og DNA-avhengig protein kinase katalytisk subenhet (DNA-PKCS), NU7441 (Tocris biovitenskap) ble fortynnet til en fungerende konsentrasjon på 10 mikrometer i 1% DMSO. Inhibitorene ble tilsatt i 1 time før bestråling, og var igjen i kulturen i løpet av eksperimentet. Kontrollkulturer ble behandlet under lignende eksperimentelle forhold i fravær av stoffet med 1% DMSO.
Tumor biopsier
Biopsi ble hentet fra Universitetssykehuset Zurich. Alle pasientene ble operert som en del av deres standard behandling og signerte informert samtykke. Den etiske komiteen «Etisk komité av kantonen Zürich» spesielt godkjent denne studien (studie No: EK-1017). Umiddelbart etter reseksjon, biopsier ble kuttet i flere biter av 2-4 mm
3. Stykkene ble randomisert i to grupper og satt inn i dyrkningsmediet. En batch ble bestrålt med en enkelt dose på 20 Gy, mens den andre sats tjente som kontroll. Tumorstykkene ble dyrket i 72 timer etter
ex vivo
strålingen og genekspresjon ble bestemt ved RT-qPCR-analyse. Sammenkoblede biopsier fra sarkom før og etter bestråling ble samlet inn for et annet formål, og derfor tidspunkter av samlingen etter strålebehandling variert mellom 2-6 uker. Svulstene ble bestrålt
in vivo
med en lineær akselerator og fikk en dose på 50-64 Gy.
RNA ekstraksjon og utarbeidelse av cDNA
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og ble senere oppløst med DNAse I (Invitrogen). Konsentrasjonen og renhet ble evaluert ved hjelp av Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). 150 ng av RNA ble revers transkribert med høy kapasitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosciences, Foster City, California). CDNA ble enten anvendt umiddelbart for RT-qPCR reaksjoner eller lagret ved -20 ° C inntil bruk. Alle sett ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner.
RT-qPCR
uttrykk for CT-antigener og MHC-I ble analysert ved bruk av TaqMan genet analyse primere og TaqMan 1x universell mester mix (Applied Biosystems) på en RotoGene cycler (Corbett Research, Sydney, NSW). Reaksjonsblandingen (10 pl) bestod av 1 pl cDNA, 3,5 ul vann, 0,5 ul primer og 5 ul TaqMan 1x Universal Master Mix. Følgende syklusbetingelser ble benyttet: 2 min 50 ° C, 10 min 95 ° C, 45 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C, 1 min 60 ° C. Endringen i ekspresjonsnivåer av CT-antigen og MHC-I er gitt som gangers økning i ekspresjon ved å sammenligne de delta-Ct-verdier av det behandlede den til de ikke-behandlede prøver etter normalisering til 18S rRNA. Ct verdier 38 sykluser ble tolket slik at genet ikke blir uttrykt, og en fold uttrykk 2 ble ansett som noen endring. Hver av brystkreft og osteosarcom-cellelinjer ble testet i to uavhengige eksperimenter og lungekarsinom og prostata carcinoma-cellelinjer i en. Hver prøve ble anbragt i duplikater /tre paralleller for hver av RT-qPCR eksperimenter.
Strømningscytometri
Celler ble farget med PE-merket anti-HLA-A, B, C (klone G46 -2,6, 1:100), FITC-merket anti-β2-mikroglobulin (klone TU99, 1:100) (BD Pharmingen, San Diego, California) og propidiumjodid (PI, Sigma). Prøvene ble målt med en FACS Calibur (BD) og analysert med FlowJo programvare (Treestar) etter gating på live (PI-negative) celler. Passende isotype kontroller ble brukt.
Immunohistochemistry
Formalin fiksert, ble parafininnstøpte sammenkoblede vevssnitt hentet fra sarkom pasienter før og etter bestråling farget med mus anti-human monoklonale antistoffer mot CD4 (klone 1F6, 01:30, Zymed Laboratories Inc.), CD8 (klone C8 /114B, 1:100, DAKO A /S, Carpinteria, CA), granzyme B (klon Gr B-7, 01:25, DAKO A /S ), MHC-I (klone C21, 1:1000, RDI Forskning Diagnostics, Inc.), CT7 (klone CT7-33, 1:80, DAKO A /S), CT10 (kanin polyklonale, 1:500, ProteinTech Group, Inc.), NY-ESO-1 (klone E978, 01:50, Zymed) og perforin (klone 5B10, 01:20, Novocastra Laboratories Ltd). Seksjoner ble kontra med hematoxylin, dehydrert og montert. Alle deler ble farget enten med Ventana Benchmark automatiserte farging system (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) ved hjelp av Ventana reagenser for hele prosedyren for NY-ESO-1, CT7, granzyme B, CD4, CD8 og perforin og BondMax (vison BioSystems , Newcastle upon Tyne, UK) for CT10 og MHC-i. UView (Ventana) eller Spesifisert DAB (Vision BioSystems) ble anvendt som kromogener mot de primære antistoffer. Bilder av de fargede delene ble kjøpt på Zeiss-Axiovert 200 M (Carl Zeiss lysmikroskopi Göttingen, Gearmany) inverse mikroskop med Carl Zeiss Axiovision CD28 imaging system. De stainings ble bedømt på en skala fra 0 til 5 for ekspresjon av NY-ESO-1, MAGE-C1 /CT7, og MAGE-C2 /CT10 som en prosentandel, på grunnlag av antallet positive celler som uttrykker antigenet til den totale antallet celler i en høy effekt felt (HPF) ved hjelp av et 40X objektiv. Scoringen for MHC-I uttrykket ble gjort basert på intensiteten av farging. Tumor infiltrater ble beregnet som antall celler som uttrykker CD4, CD8 og granzyme per HPF bruker en 40X objektiv. Hver farget delen ble evaluert i fem ulike regioner (for detaljert liste over skårer se tabell S4). Tre personer utførte scoring blindt og uavhengig for MHC-I stainings og to personer utførte scoring blindt for de andre stainings.
immunfluorescens
Cells (10’000-20’000 celler i 1 ml medium) ble sådd ut på kammere kultur lysbilder (BD Biosciences) å forholde seg over natten. Cellene ble deretter fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur, permeabilisert med 0,1% TritonX-100 (Sigma-Aldrich) i 5 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av blokkering med 10% BSA /PBS i 30 min ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert med monoklonale muse-antistoffer mot NY-ESO-1 (klon E978, 1:500, Invitrogen) eller MAGE-C1 /CT7 (klon CT7-33, 1: 500, Dako) i 10% BSA /PBS i 1 time ved romtemperatur i mørket, etterfulgt av inkubasjon med FITC- merket sekundært antistoff geit-anti-mus lgG1 (Poly4053, 1:2000, Biolegend) i 15 min ved romtemperatur i mørke. Objektglassene ble motfarget med 4 «, 6»-diamidino-2-fenylindol-hydroklorid (DAPI, 1:500) i 2 minutter i mørket og kontrolleres ved hjelp av et Zeiss Axiovert-200 M omvendt mikroskop og et Carl Zeiss Axiovision CD28 avbildningssystem.
Western blot analyse
trålet og ikke-bestrålt celler ble sjekket for protein uttrykk ved hjelp av monoklonale mus antistoffer mot NY-ESO-1 (klone E978, 1:500, Invitrogen) eller MAGE- C1 /CT7 (klone CT7-33, 1: 500, Dako) og β-aktin (klone 4i374, 1:8000,
Santa Cruz
Biotech, CA). Effekten av gentoksiske stoffer og DNA-PKCS og ATM hemming, på γ-bestråling indusert genuttrykk i celler ble evaluert ved hjelp av antistoffer mot pS2056-DNA-PKCS (kanin polyklonale til fosfor S2056-DNA-PKCS, 1:300, Abcam Inc, MA), fanc-D2 (klone Fl17, 1:200,
Santa Cruz
Biotech, CA), pS1981-ATM (klone EP1890Y, 1:5000, Eitomics, CA) og pS15-p53 (klone 16G8, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA). Etterfulgt av inkubasjon med det sekundære antistoff, polyklonalt geit anti-mus lgG1 HRP (Poly4053, 1:10000, Biolegend) eller polyklonalt geite-anti-kanin HRP (1:10000, Abcam). ECL-reagens (Amersham, UK) ble anvendt som substrat luminescens.
CD107a degranulering Assay
Godkjenning av celler som uttrykker NY-ESO-1 etter bestråling av antigen-spesifikke CD8
+ T-celler ble testet ved anvendelse av CD107a degranulering analysen. Tre x 10
5 NY-ESO-1
157-165 /HLA-A2-spesifikke klonet CD8
+ T-celler (generert som beskrevet [22]) ble inkubert med 10
6 CFSE- merket (1 uM) HLA-A2
+ MDA-MB-469-celler – som var eller ikke var bestrålt med 20 Gy 72 timer tidligere – i en 96-brønners mikrotiter rundplate i et endelig volum på 200 ul RPMI + 10 % FCS og antibiotika i nærvær av PE-merket anti-CD107a (01:20, BioLegend, SD, California). Som positiv kontroll ble MDA-MB-469 celler lastet med 10
-6 M NY-ESO-1
157-165 peptid. To uavhengige T-cellekloner (2A7 og 2B5) ble anvendt, og alle kulturer ble utført i duplikat. Inkuberingen ble utført ved 37 ° C i 4 timer. Cellene ble samlet opp og vasket i 2 ml FACS-buffer (FB) etterfulgt av farging med Pacific Blue-merket anti-CD8 (BioLegend) i 50 mL FB i 30 minutter ved 4 ° C. Cellene ble vasket en gang med 2 ml FB og resuspendert i 200 ul FB. Prøvene ble målt på Cyan ADP9 (Beckman Coulter Inc, Fl, USA) og analysert med FlowJo programvare (Treestar).
Resultater
In vitro
γ-stråling opp- regulerer transkripsjoner av CT-antigener og MHC-i-molekyler
Bryst, osteosarkom, lunge og prostata kreft og normale primære celler ble eksponert for en enkeltdose stråling på 20 Gy, etter 72 timer ble cellene høstet og analysert for ekspresjon av CT-antigener og MHC-i ved RT-qPCR. De fleste av disse kreftcellelinjer uttrykte ikke målbare eller meget lave nivåer av CT-antigener under standard dyrkningsbetingelser. I motsetning til dette, y-stråler celler viste
de novo
eller oppregulert ekspresjon av ulike CT-antigener i en randomisert måte (figur 1A-D). I et panel av de fire kreftcellelinjetyper, ble γ-stråling funnet å ha den mest dyptgående effekt på brystkreft og osteosarcom-cellelinjer, og minst på prostata kreftcellelinjer. Den oppregulering av MHC-I og CT-antigener på γ-stråling ser ut til å være en bestemt funksjon av maligne celler, da dette ikke ble observert i noen av de normale primære celler som vi har testet her (ZT-812, human forhud keratinocytter , HMEC-en, MRC-5, NHDF og MCF 10A, figur S1 A, S1B). Melanomcellelinjen SK-MEL-37 er kjent for å uttrykke alle testede CT-antigener under normale dyrkingsbetingelser og er derfor inkludert som en positiv kontroll. Bestråling av denne cellelinjen som resulterte i en klar opp-regulering av alle de CT-antigener og MHC-I (data ikke vist). Vi har oppdaget en økt ekspresjon av CT-antigener og MHC-I så tidlig som 24 timer etter bestråling i noen tilfeller, og en jevn økning i genekspresjon ble observert opp til 96 timer etter bestråling. Som vi har observert betydelig celledød i 96 timer etter bestråling, utførte vi analyserer all videre på 72 timer etter bestråling. Som radioterapi kan gis som en enkelt høy dose (20 Gy) eller som fraksjonerte doser, vi bestrålte utvalgte cellelinjer (de brystkreftcellelinjer MDA-MB-469 og MCF7, så vel som osteosarcom-cellelinjer Saos, HOS, LM5 og 143B, med 2 Gy pr dag i 10 påfølgende dager. Denne protokollen resulterte i tilsvarende endring av CT-antigen og MHC-i ekspresjon som observeres med en enkelt dose på 20 Gy (figur S2A, S2B). en enkelt dose på 20 Gy ble brukt i alle videre forsøk.
Etablert kreftcellelinjer ble utsatt for enkelt dose bestråling av 20 Gy og mRNA uttrykk for CT-antigener og MHC-i ble bestemt 72 timer senere ved RT-qPCR. (A ) brystkreftcellelinjer, (B) osteosarcom-cellelinjer, (C) lungekreft cellelinjer, (D) prostatacancercellelinjer. Alle Ct-verdiene er normalisert til 18S rRNA og dataene er presentert som gangers økning av ekspresjon i bestrålt sammenlignet med de tilsvarende ubehandlede prøvene. Fordi fold uttrykk ikke kan beregnes for gener som er
de novo
uttrykt ved bestråling, setter vi symbolene i slike saker over den tynne horisontal linje i (A).
In vitro
γ-stråling up-regulerer CT-antigener og MHC-i-molekyler på proteinnivået
for å bekrefte bestråling-indusert ekspresjon av CT-antigener på proteinnivået, farget vi bestrålt og ikke-bestrålt MDA-MB-469-celler med antistoffer mot NY-ESO-1 og CT7 og analysert ekspresjon av CT7 og NY-ESO-1 ved forskjellige tidspunkter etter bestråling ved immunofluorescens-mikroskopi og ved Western blotting. Melanomcellelinjen SK-MEL-37 konstitutivt uttrykker NY-ESO-1 og CT7 og ble brukt som positiv kontroll. Vi har observert
de novo
ekspresjon av både CT-antigener ved bestråling som økte med tiden (figur 2A, 2B), noe som bekrefter dataene oppnådd med RT-qPCR. Bestråling av normale brystcellelinje MCF10A ikke resultere i økte NY-ESO-1 eller CT7 proteinnivåer (figur 2B). For å studere effekten av γ-stråling på overflaten ekspresjon av MHC-I på proteinnivået, bestrålt vi flere cancercellelinjer (bryst karsinom og osteosarkom) og normale primære celler av forskjellig opprinnelse, etterfulgt av flowcytometric påvisning av overflate MHC-I og observert at bestrålingen resulterte i en tidsavhengig økning i MHC-i ekspresjon overflate på forskjellige kreftcellelinjer (figur 2C, 2D), men ikke i den normale primære celler (figur S1B).
(A) immunfluorescens av MDA-MB-469 og SK-MEL-37-celler utsatt for en enkelt dose bestråling på 20 Gy og farget med antistoffer mot NY-ESO-1 og CT7 ved forskjellige tidspunkter etter bestråling. (B) MDA-MB-469, SK-MEL-37 og MCF 10A cellelinjene ble utsatt for en enkelt dose på 20 Gy og ekspresjon av NY-ESO-1 og CT7 ble analysert ved Western blotting 72 timer senere. (C) brystkreft og (D) osteosarcom-cellelinjer ble utsatt for enkel dose bestråling på 20 Gy og ekspresjon av HLA-ABC og β
2microglobulin ble kvantifisert ved forskjellige tidspunkter etter bestråling ved strømningscytometri. RAD: indikerer γ-stråling
Bestråling av kreftceller øker T-celle anerkjennelse
in vitro
For å finne ut om bestråling-indusert oppregulering av. CT-antigener og MHC-i gir økt anerkjennelse av antigen-spesifikke CD8
+ T-celler, målte vi degranulation [23] – [24] av NY-ESO-1
157-165 /HLA-A2- spesifikke klonet CD8
+ T-celler ved inkubasjon med bestrålt og ikke-bestrålt HLA-A2
+ MDA-MB-469 brystkreftceller. MDA-MB-469 celler som er negative for NY-ESO-1, men blir positiv ved bestråling (figur 1A, 2A, 2B). Vi fant at bare bestråles MDA-MB-469-celler indusert degranulering av to uavhengige NY-ESO-1
157-165-spesifikke CD8
+ T-cellekloner (2A7, 2B5) (figur 3). Bestråling ikke ytterligere å øke degranuleringen når peptid-lastet MDA-MB-469 celler ble anvendt (data ikke vist), noe som indikerer at ikke mengden av MHC-I, men mengden av NY-ESO-1
157-165 presentert av MHC-i var den begrensende faktoren i ubestrålte MDA-MB-469 celler, som passer på at bestråling indusert
de novo
uttrykk for NY-ESO-1 i MDA-MB-469 celler (figur 1A, 2).
10
6 CFSE-merkede HLA-A2 + MDA-MB-469 brystcancerceller ble bestrålt eller ikke med en enkelt dose på 20 Gy og ble inkubert i 72 timer senere med 3 x 10
5 NY-ESO-1
157-165 /HLA-A2-spesifikke CD8 + T-cellekloner (klon 2A7 og 2B5 klone) i nærvær PE-merket anti-CD107a-PE i 4 timer ved 37 ° C. Cellene ble deretter farget med Pacific Blue-merket anti-CD8- i 30 minutter ved 4 ° C. Peptid-lastet MDA-MB-469-celler ble anvendt som positiv kontroll. Alle kulturer ble utført i duplikat. Den degranulering ble målt som prosent CD107a
+ celler av CD8
+ -celler etter gating på CFSE-negative celler ved flow cytometri.
Ex vivo
bestråling av frisk tumor biopsier induserer oppregulering av CT-antigener og MHC-i
for å utvide våre funn til klinisk relevant materiale, vi samlet ferske tumor biopsier fra 23 ulike kreftpasienter, kuttet de i minst 50 små biter, og randomisert dem i to eksperimentelle grupper. Vi bestråles en gruppe av biopsier med 20 Gy, mens den andre tjente som kontroll, og analysert ekspresjonen av CT-antigener og MHC-I 72 h senere ved RT-qPCR og immunhistokjemi. Disse resultatene bekreftet funnene vi oppnådd med kreftcellelinjer, som γ-stråling ofte indusert øket ekspresjon av CT-antigener og /eller MHC-I (figur 4A, 4B, Tabell S1). Viktigere, våre resultater tyder på at heterogene uttrykk for CT-antigener og /eller MHC-I kan bli mer homogen på strålebehandling, som åpenbart støtter immunologiske kontroll av svulsten.
Ferske kreft explants fra ulike kreftpasienter (n = 23) ble bestrålt eller ikke med en enkelt dose på 20 Gy. Diagnosen av de enkelte pasientene er vist i supplerende tabell S1. (A) Etter 72 timer, ble de bestrålte og kontroll eksplantater analysert for ekspresjon av NY-ESO-1 og MHC-I ved RT-qPCR. (B) Representative seksjoner (pasient nummer 9 og 20) som viser uttrykk for NY-ESO-1 og MHC-I ved immunhistokjemi (20X forstørrelse). NR indikerer ikke-stråling og RAD indikerer tilsvarende bestrålte seksjoner.
In vivo
bestråling av menneskelige sarkom resulterer i økt uttrykk av CT-antigener og MHC-I og i lymfocytter infiltrasjon
til slutt sammenlignet vi ekspresjonen av CT-antigener MHC-i og infiltrasjon av lymfocytter i 15 sammenkoblede parafinseksjoner oppnådd fra sarcoma pasienter før og etter radioterapi ved immunohistokjemi. Vi fant at radioterapi resulterte i betydelig oppregulering eller
de novo
ekspresjon av CT-antigener og /eller MHC-I molekyler, som ble ledsaget av en øket infiltrasjon av lymfocytter og granzyme ekspresjon i 7/15 og 12 /15 prøver, henholdsvis (figur 5A-D, tabell S2, S3).
Parafin-embedded sammenkoblede vevssnitt hentet fra sarkom pasienter (n = 15) før og etter bestråling ble analysert ved immunhistokjemi for (A) tilstedeværelsen av CD8
+, CD4
+ og granzyme
+ celler, (b) ekspresjon av CT7, NY-ESO-1 og CT10 og (C) MHC-i ekspresjon. CT-antigener ble scoret som den midlere prosentandelen av levende celler som uttrykker antigenet til det totale antall celler i fem høy strømfelt (40X objektiv). Infiltrasjon av lymfocytter ble tatt som middelverdien ved å telle antallet celler som uttrykker CD4, CD8 og granzyme i fem høye kraftfeltene, og MHC-I ble scoret på grunnlag av intensiteten av fargingen. (D) Representative snitt som viser ekspresjonen av CT-antigener og MHC-I og infiltrasjon av lymfocytter før og etter radioterapi ved immunohistokjemi. Avbildet er: pasient F for uttrykket av CT7, pasient A for CT10, tålmodig K for NY-ESO-1, pasient D for CD4 og MHC-I og pasient E for CD8 uttrykk. NR indikerer ikke-utstrålt og RAD indikerer korresponderende bestrålte deler. Pt: indikerer pasientnummer. Pasientinformasjon er oppført i supplerende tabell S2.
Andre former for stress har ingen innvirkning på uttrykk for CT-antigener eller MHC-I
in vitro
Stress og miljømessige endringer induserer endringer i den transkripsjonelle profil for å kunne takle disse angrep [25], [26], [27]. Som bestrålingen induserer DNA-skade, undersøkte vi hvorvidt den opp-regulert ekspresjon av MHC-I og CT-antigenene vil også oppstå etter eksponering av cellelinjer til andre behandlinger som induserer DNA-skade, for eksempel cisplatin, etoposid og den radiomime medikament bleomycin. MDA-MB-469 og SK-MEL-37-celler ble behandlet separat med hver av de DNA-skadende midler og RNA-nivåer ble overvåket ved forskjellige tidspunkter etter behandling. Våre resultater viser at ingen av disse midler oppregulert ekspresjonen av CT-antigener og MHC-I (figur S3b-D). Men Hallmark gener pS15-p53 og fanc-D2 var oppregulert etter behandling, noe som indikerer at disse midlene indusert stress på konsentrasjonen brukes (figur S3A). Videre har vi testet om andre typer kreft relatert stress, inkludert forhøyede temperaturer eller lavt oksygennivå, indusert økt uttrykk av CT-antigener og /eller MHC-I. Vi fant ut at ingen av disse behandlingene påvirket på uttrykk for CT-antigener og MHC-I mens signaturen genet CA9 ble oppregulert (figur S4A, S4B). Sammen tyder disse resultater på at den økte ekspresjon av CT-antigener og MHC-I ved cancercellelinjer er en spesifikk respons til y-stråling og ikke forekommer etter utstilling til andre induserer forskjellige stressrespons veier.
ATM og DNA-PK-signalveier er unnværlig for γ-strålingsinduserte ekspresjon av CT-antigener og MHC-i
aktivering av DNA-skadereparasjonssjekkpunkt trasé som en respons på gentoksisk fornærmelse bidrar til å opprettholde genomisk integritet i pattedyrceller [28]. DNA-skader utløser aktiveringen av forskjellige serin /treonin proteinkinaser, som utgjør de primære svingere i signalkaskade og av hvilke, ataksi telangiectasia mutated (ATM) og DNA-avhengige protein kinaser (DNA-PKCS) er av største viktighet [29] . Det ATM-proteinet kinase er et viktig mellomprodukt i en rekke cellulære responser til y-stråling og andre former for stress [30]. Vi har derfor undersøkt om oppregulering av CT-antigen og MHC-I ekspresjon som reaksjon på y-stråling avhenger av aktivering av ATM og /eller DNA-PKCS.
