Abstract
Administrasjon av ineffektiv kreftbehandling er forbundet med unødvendig toksisitet og utvikling av resistente kloner. Cancer stilk-lignende celler (CSLCs) motstå kjemoterapi, og dermed forårsaker tilbakefall av sykdommen. Dermed utvikling av en test som identifiserer den mest effektive cellegiftbehandling gir store løftet for individualiserte kreft behandlinger. Vi har utviklet en ex vivo-kjemoterapi sensitivitetsanalyse (ChemoID), som måler følsomheten av CSLCs samt hoveddelen av tumorceller til en rekke kjemoterapeutika. To pasienter, en 21-år gammel mann (pasient 1) og en 5-måneders kvinnelige (pasient 2), påvirket av anaplastisk WHO klasse-III ependymoma ble undersøkt ved hjelp av ChemoID analysen. Pasient 1 ble funnet følsomme for kombinasjonen av irinotecan og bevacizumab, noe som resulterte i et langvarig sykdomsprogresjon periode på 18 måneder. Etter gjentakelse, ble en kombinasjon av forskjellige cytostatika testet på nytt med ChemoID analysen. Vi fant ut at benzylisotiocyanat (BITC) betydelig økt kjemosensitivitet av ependymoma cellene til kombinasjonen av irinotecan og bevacizumab. Etter at pasientens en ble behandlet i to måneder med irinotecan, bevacizumab og tilskudd av cruciferous vegetabilske ekstrakter som inneholder BITC, observerte vi over 50% tumor regresjon i forhold til pre-ChemoID skanne som gjenspeiles av MRI. Pasient 2 ble funnet å være resistent til alle behandlinger ble testet og følgende 6 sykluser av vinkristin, karboplatin, cyklofosfamid, etoposid, og cisplatin i forskjellige kombinasjoner, tumor av denne pasient hurtig forløp og protonstråle behandling ble anbefalt. Som forventet dyrestudier utført med pasient avledet xenografter behandlet med ChemoID skjermet narkotika rekapitulert klinisk observasjon. Denne analyse viser at pasienter med den samme histologiske stadium og grad av kreft kan variere betydelig i deres kliniske respons, noe som antyder at ChemoID testing som måler følsomheten CSLCs samt hoveddelen av tumorceller til en rekke kjemoterapeutiske midler kan føre til mer effektive og tilpassede kreft behandlinger i fremtiden
Citation. Mathis SE, Alberico A, Nande R, Neto W, Lawrence L, McCallister DR, et al. (2014) Chemo-Predictive analyse for målretting Cancer Stem-lignende celler hos pasienter som lider av hjernesvulster. PLoS ONE 9 (8): e105710. doi: 10,1371 /journal.pone.0105710
Redaktør: Caterina Cinti, Institutt for klinisk fysiologi, c /o Toscana biovitenskap Foundation, Italia
mottatt: May 27, 2014; Godkjent: 23 juli 2014; Publisert: 21 august 2014
Copyright: © 2014 Mathis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. De foreliggende studiene ble støttet delvis av Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, National Institutes of Health, gjennom stipend nummer UL1TR000117 fra National Center for Forskningsressurser (NCRR), og 5P20RR020180 fra National Cancer Institute, WV-INBRE 5P20RR016477, og delvis av en Marshall University Translasjonell Award, og en pris fra Marshall University Institutt for nevromedisin (til PPC). Innholdet i dette manuskriptet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av NCRR og NIH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv ependymomas er den tredje vanligste typen hjernesvulst hos barn (etter astrocytom og medulloblastoma), de er relativt sjeldne, med ca 200 tilfeller diagnostisert i USA hvert år [1], [2]. De står for 60% av alle intramedullære svulster og 50% oppstå i filum terminale [3].
Behandling av ependymomas kan være utfordrende. Den innledende standard behandling for ependymoma blir kirurgi ofte etterfulgt av strålebehandling og kjemoterapi. Selv om kjemoterapi har blitt brukt i stor utstrekning i barn med ependymomas, er det lite kliniske bevis på at kjemoterapi forbedrer overlevelse av barn med denne type tumor. Kjemoterapi er ofte forbeholdt pasienter med resttumor etter kirurgi og for barn yngre enn 3 år i et forsøk på å forsinke strålebehandling [4].
Det er ikke helt klart hvorfor det ikke er en forbedret overlevelse med kjemoterapi, men det er kjent at motstanden mot en rekke vanlig anvendte kjemoterapeutiske midler som er vanlig i ependymoma [5]. Derfor etterforskning og utvikling av nye strategier og integrert behandling er nødvendig for å finne mer effektive behandlinger for denne type svulst.
Pasienter med samme scenen og karakteren av kreft kan variere betydelig i deres klinisk respons og toleranse for kjemoterapi. Ineffektiv anticancerterapi kan resultere i unødvendig toksisitet og utvikling av resistente kloner. De overlevende kreftceller er ofte mer resistente mot terapi. Mange forsøk har blitt gjort gjennom årene for å utvikle en
ex-vivo
anti-kreft test som kan hjelpe skjelne de beste behandlingsalternativene for hver enkelt pasient mens toksisitet minimeres.
Animal xenograft modeller har vist at bare et delsett av kreftceller innenfor hver tumor er i stand til å initiere tumorvekst. Denne evne har vært vist flere typer av kreft hos mennesker, til å inkludere ependymomas [6]. Dette bassenget av kreftceller er operasjonelt definert som «Cancer Stem-Like Cell» (CSLC) undergruppe. Ifølge «kreft stilk-lignende celle» teori, svulster er en kompleks, voksende befolkning av unormale celler som stammer fra et mindretall av CSLCs. Disse cellene opprettholde stilk-lignende egenskaper ved at de sprer meget langsomt og har en iboende evne til å fornye seg selv og differensieres til fenotypisk heterogene, avvikende avkom [7] – [10]. I motsetning til mesteparten av kreftceller, CSLCs motstå kjemoterapi og strålebehandling, og er ansvarlig for svulst tilbakefall og metastase [9], [10].
Noen ependymomas uttrykke ulike markører for stemness, inkludert CD133. I tillegg tilbakefall svulster viser en genuttrykk signatur bestående av oppregulert gener involvert i kinetochore (ASPM, KIF11) eller i neural utvikling (CD133, Wnt og Notch trasé) [11].
Targeting CSLCs i tillegg til hoveddelen av andre kreftceller i en tumor er en ny paradigme i behandling av kreft. Våre nyere studier viser at en Hydrodynamisk Fokusering bioreaktor (HFB) (Celdyne, Houston TX) selektivt beriker CSLCs fra kreftcellelinjer som kan brukes i en kjemosensitivitet analyse [8]. Videre, ved hjelp av denne strategien vi optimal anriking av CSLCs fra tumor-biopsier, og har utviklet ChemoID kjemoterapi følsomhet assay som måler responsen av CSLCs og hoveddelen av tumorceller til kjemoterapi for å bestemme den mest effektive kombinasjon av anticancermedikamenter til ondartede svulster nervesystemet.
i denne studien vi rapportere, for første gang, vår undersøkelse ved hjelp av ChemoID assay for å måle følsomheten og motstanden av CSLCs og hoveddelen av tumorceller dyrket fra 2 biopsier av human ependymoma utfordret med flere kjemoterapi agenter som ble også korrelert til responsen av dyre xenotransplantater behandlet med den anslåtte legemidler og til klinisk respons av de behandlede pasientene.
Materialer og metoder
Reagenser
Benzyl isothiocyanate (BITC) ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Bevacizumab (Avastin), cisplatin, oksaliplatin, arabinosid-C, VP-16, Irinotecan (Camptosar, CPT-11), busulfan, metotreksat, ble kjøpt som kliniske grade kjemoterapi.
Pasienter
case 1 er en 21 år gammel mannlig pasient diagnostisert med intradural, intramedullær, og ekstramedullær anaplastic diffuse rygg ependymoma, WHO grad III. Sak 2 er en fem måneder gammel kvinnelig pasient diagnostisert med anaplastisk WHO-grad III ependymoma.
ChemoID Analysen ble utført etter å ha innhentet pasientens skriftlig informert samtykke i samsvar med de etiske standarder for Helsinki-deklarasjonen (1964, endret sist i 2008) av World Medical Association. All informasjon, inkludert illustrasjoner, er blitt anonymisert. Marshall University Institutional Review Board (IRB) har godkjent denne forskningen under protokollen # 326290. Deltakerne eller foresatte på deltaker (i tilfelle av et barn deltaker) gitt sitt skriftlige samtykke på IRB-godkjent informert samtykkeskjema til å delta i denne studien etter å ha blitt utdannet om forskningsprotokollen. Etikkomiteer /IRB på Marshall University godkjent samtykket prosedyren. For barn deltakere til studien, ble skriftlig informert samtykke innhentes fra pårørende, vaktmestere, eller foresatte på vegne av mindreårige /barn som deltok i studien.
enkelt cellesuspensjon og Primær Cell Culture
Single-cellesuspensjoner fra ependymoma biopsier ble utarbeidet etter den gentleMACS Dissociator (Miltenyi, Auburn, CA), og C Tubes ved hjelp av en standardisert, semi-automatisert protokoll basert på en kombinasjon av mekanisk vev avbrudd og inkubasjon med en 50% løsnings 0,025% trypsin og Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA). Celler ble serielt sådd ut i 24-brønners, 12-brønners, 6-brønners, 10-cm behandlet retter og dyrket til subconfluence i RPMI-1640 medium supplementert med 5% bestrålt, varmeinaktivert, definert føtalt bovint serum (Thermofisher /Hyclone), og 50 U av penicillin og 5 mikrogram streptomycin /ml medium (Thermofisher /Mediatech).
tredimensjonale bioreaktor CSLCs Kultur
En hydrodynamisk fokusering bioreaktor (HFB) (Celdyne, Houston TX ) ble anvendt som tidligere beskrevet for selektivt å proliferere CD133 (+) cancer stilk-lignende celler [8]. Kulturmedier, oksygenering, hastighet, temperatur og CO
2 ble holdt konstant gjennomgående i ti dager.
Cellene ble tellet og 1 x 10∧6-celler ble plassert i det roterende kar satt til 25 opm med luftstrøm settes til 20%. Cellene ble deretter fjernet og telles på nytt ved hjelp av trypanblått-utelukkelse for å bestemme cellulær levedyktighet og celle nummer og sådd ut i 96-brønner for kjemosensitivitet testing. Cellene ble også inkubert med fluorescerende antistoffer for fenotypiske karakter [8].
Cell Sorting
Opp til 1 × 10∧7 celler ble sortert av en magnetisk aktivert celle sortering (MACS) system , som består av magnetiske kuler konjugert til et antistoff mot CD133 (Miltenyi, Auburn, CA). I korte trekk ble cellene høstet ved hjelp av 0,25% trypsin, pelletert og merket med CD133 /1 biotin og CD133 /2-PE. Cellene ble vasket og merket med anti-biotin magnetiske kuler, og deretter ført gjennom en magnetisk kolonne hvor CD133 (+) celler ble opprettholdt, mens umerkede celler ført gjennom kolonnen. Den CD133 (+) beholdt celler ble eluert fra kolonnene etter fjerning fra magneten. Positive og negative celler ble deretter analysert ved FACS for renhet.
flowcytometrisystemer studier
Celler ble analysert av de antigene kriteriene som bruker anti-CD34 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD38 ( Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD44 (BD Biovitenskap, Sparks, MD), -CD117 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD133 /2 (prominin1) (Milteny Biotech, Auburn, CA), -Oct3 /4 (BD Biovitenskap, Sparks, MD), og -Nanog (BD Biovitenskap, Sparks, MD). I korthet ble cellene frittliggende ved hjelp av 0,02% EDTA i PBS og pelletert (10 minutter ved 1.000 rpm), ble vasket i 0,1% BSA i 1 x PBS ved 4 ° C og inkubert i en oppløsning av 1 mg antistoff 9 ml 0,1% BSA i 1 x PBS. Cellene ble vasket i samme løsning en gang og ble analysert ved hjelp av en C6 Accuri flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, California).
ChemoID analysen
Følsomhet for kjemoterapi ble vurdert ved hjelp av en levedyktighet analysen (WST8) på 1 x 10∧3-celler sådd ut i 5 gjennomkjøringer i 96-brønners plater. I korthet likt antall hoveddelen av tumorceller dyrket i monolayer og CSLCs dyrket i bioreaktoren, ble tellet og sådd separat i 96-brønners skåler og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Cellene ble deretter utfordret for en 1-timers puls med et panel av kreftmedisiner som er valgt av onkolog å etterligne den gjennomsnittlige klinisk kjemoterapi infusjonsplan.
For å studere effekten av BITC på chemosensitization av kreftceller til kjemoterapi narkotika, ble cellene behandlet med en time puls 5-30 uM BITC etterfulgt av en time av de forskjellige anticancer legemidler. Hvert anticancer medikament ble testet i en rekke doser, inkludert klinisk relevante doser.
A WST8 Analysen ble utført 48 timer etter kjemoterapi behandling for å vurdere cellelevedyktighet som tidligere beskrevet [12]. En doserespons diagrammet ble utviklet der prøvene ble scoret som responsive (0-30% celle overlevelse), middels (30-60% celle overlevelse), og ikke-responsive (60-100% celle overlevelse).
begrensende fortynning Svulst analysen i immunmangelfull mus
En rekke 1 × 10∧2, 1 × 10∧3, 1 × 10∧4, og 1 x 10∧5 ependymoma celler fra Pasient 1 ble injisert subkutant i 5 atymiske immunodeficient naken
nu /nu mus per gruppe. I korte trekk et likt antall av foreldrehoveddelen av tumorceller dyrket i monolayer 2D, CD133 (+) tredimensjonalt dyrket i hydrofocusing bioreaktor, og CD133 (+) MACSorted CSLCs ble injisert med 100 ul av Matrigel i flanken av NOD-
SCID
mus og sammenlignet med veksten av CD133 negative celler i 3 måneder.
Kjemoterapi Animal Study
Alle dyrestudier har vært gjennomført etter godkjennelse fra Marshall University IACUC, protokoll # 373017. Virkningene av kjemoterapier vist in vitro ved ChemoID analysen ble testet på humane tumor biopsier som var xenopodet i flanken av en NOD-
SCID
musemodell. 1 × 10∧6 ependymoma celler ble blandet til 100 ul matrigel (BD Biosciences, San Jose, California) injisert subkutant i flanken av 10 atymiske, NOD.Cg-Prkdc
SCID
ll2rgtm1wjl /SzJ immunsvikt mus ( NOD-
SCID
) /gruppe og ble dyrket i 10 uker eller inntil 100 mm∧3. Mus ble randomisert i forskjellige behandlings- og kontrollgruppene og kjemoterapi ble administrert ved intraperitoneal (i.p.) injeksjoner på 200 ul er som følger i en periode på 4 uker: 1) Gruppe # 1, Kontrollgruppe med primære tumorceller injisert inn flanke og motta i.p. sterile saltvannsinjeksjoner. Group # 2, eksperimentell gruppe injisert intraperitonealt med den minst effektive kjemoterapi som bestemmes av
in vitro
ChemoID analysen. Group # 3, eksperimentell gruppe injisert intraperitonealt med den mest effektive kjemoterapi som bestemmes av
in vitro
ChemoID analysen. Group # 4, eksperimentell gruppe injisert intraperitonealt med den nest mest effektive kjemoterapi som bestemmes av
in vitro
ChemoID analysen. Group # 5, eksperimentell gruppe injisert intraperitonealt med den mest effektive kombinatoriske kjemoterapi som bestemmes av
in vitro
ChemoID analysen.
Kjemoterapi muse doser ble beregnet ved hjelp av en kroppsoverflate (BSA) normalisering metoden [13] fra klinisk dose og verifisert i henhold til doser som tidligere bestemt av et litteratursøk.
Avlivning
Dyrene ble avlivet etter gjeldende retningslinjer fastsatt av den nyeste rapporten fra AVMA Panel on Avliving med CO2 innånding og kvelning fulgt av livmorhals forvridning.
Statistical Analysis
statistisk analyse ble utført ved hjelp av IBM SPSS statistisk programvare. Resultatene for hver variant i de forskjellige eksperimentelle design representerer et gjennomsnitt av 3 forskjellige eksperimenter. Dataene i 5-målinger ble beregnet; variasjonskoeffisienten mellom disse verdiene aldri oversteg 10%. Gjennomsnittsverdier og standardfeil ble beregnet for hvert punkt fra de sammenslåtte normalisert til å kontrollere data. Statistisk analyse av betydningen av resultatene ble utført med en en-veis ANOVA.
p
verdier på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Pasient 1 Historie og utvelgelse av kjemoterapi med ChemoID analysen
En fysisk aktiv 17 -åring mann presenterte i oktober 2005 med parestesier i føttene og en ganske alvorlig observant tap. Dette ble gradvis verre i desember 2005 går opp bena med ganske alvorlig nummenhet i høyre ben og smerter i det venstre beinet, fra midten av låret ned til midten av kalv medialt. Ved undersøkelse hadde han ingen fokus svakhet i hele hans øvre og nedre ekstremiteter. Han hadde hypoalgesia med delvis sensorisk nivå i den øvre thorax ryggraden ned. Han hadde også alvorlig propriosepsjon tap i føttene og tærne. Magnetic resonance imaging (MRI) av cervicalcolumna viste tilstedeværelse av en unormal forbedrende masse, som strakte seg fra midten av C5 til dårligere C7 (4,5 i lengde × 1,0 × 2,0 i cephalocaudal og anteroposteriore dimensjon) som forårsaket medullakompresjon (figur 1A). MR av thorax ryggraden viste en lesjon på T2-3 (1,5 i lengde × 0,6 × 0,6 cm i anteroposterior og dimensjon) med flere andre mindre nodulær massene, beste sett på T2 vektet sekvens, som utvidet hele thorax nivå til T11 (figur 1B).
A) Magnetic Resonance Imaging (MRI) av nakkesøylen viser tilstedeværelse av en styrke masse, som strekker seg fra midten av C5 til dårligere C7 (4,5 i lengde × 1,0 × 2,0 i cephalocaudal og anteroposteriore dimensjon) og forårsaker margkompresjon. B) MR av thorax ryggraden viser en lesjon på T2-3 (1,5 i lengde × 0,6 × 0,6 cm i anteroposterior og dimensjon) med flere andre mindre nodulær massene, best sett på T2 vektet sekvens, som strakte seg over hele thorax nivå til T11. C) Hematoxylin og Eosin farging av en tumor snitt som viser en generell overveiende tett cellulær komponent, med primitive kjernefysiske egenskaper, mitotisk aktivitet, nekrose og vaskulær proliferasjon. Tilstedeværelsen av velformede, åpen perivaskulær pseudorosettes (med vasocentric mønster, perivaskulær atomfrie soner, og klassiske tynne glia prosesser som stråler til /fra åreveggen) ble funnet støttende for diagnostisering av intradural, ekstramedullær anaplastic diffuse rygg ependymoma, WHO grad III.
pasienten fikk laminektomi i desember 2005 på C5, C6 og C7 med delvis reseksjon av svulsten etter mikroskopet med mikrokirurgisk teknikk. Etter operasjonen ble pasienten behandlet med stråling og temozolomid
Morfologisk analyse av histologi seksjoner farget med Hematoxylin Eosin viste en samlet dominerende tett cellulær komponent, med primitive og pleomorphic kjerner, økt mitotisk hastighet og apoptose, og foci med mikrovaskulær spredning. Tilstedeværelsen av velformede, åpen perivaskulære pseudorosettes (med vasocentric mønster, perivaskulære atomfrie soner, og klassiske tynne glial prosesser som går ut til /fra karveggen) ble funnet til å understøtte diagnostisering av anaplastisk diffus spinal ependymom, WHO grad III. Figur 1C viser hematoxylin og eosin farging av en svulst seksjon ved diagnose i 2005.
Deler av svulsten ble evaluert av immunoperoxidase teknikker med passende flekker kontrollseksjoner. Svulsten viste positiv farging med antistoffer mot Neuron enolase, vimentin, S-100, og GFAP. Svak farging forekom med antistoffene mot aktin. Focal farging skjedde med antistoffer mot epitelial membranantigen, cytokeratin AE1 /AE3, og synaptophysin. Svulsten var negativ for leukocytter felles antigen, desmin, og myogenin. I tillegg er en seksjon farget med PAS viste en fokal PAS-positiv fibrillar materiale. Profiler og tumor blokken ble også sendt til Biopathology Senter (BPC) av Barnas Oncology Group (COG) var to neuropathologists uavhengig vurdert saken og bekreftet diagnosen anaplastisk ependymoma, WHO grad III.
Etter tilbakefall og progresjon, fikk pasienten kompleks kjemoterapiregime i januar 2006 og mars 2006 med cyklofosfamid, thalidomid, celekoksib fulgt av etoposid, thalidomid og celekoksib. Kjemoterapi behandling ble avsluttet i september 2006, men i august 2007 pasient hadde svulst gjenvekst på T7-T8 som han gjennomgikk robot radiosurgery behandling. Pasienten hadde en annen debulking kirurgi i april 2008, men senere hadde han progressiv nummenhet i bena sammen med ryggsmerter med MR viser tilbakefall i det kirurgiske området (figur 2A) samt lumbalcolumna i desember 2008. Han ble deretter behandlet på nytt med temozolomid, men hadde ingen respons på behandling.
A) 2009 MR av cervicalcolumna viser tilbakefall i det kirurgiske området. B) 2009 MR av thorax ryggraden som viser progresjon av hoved lesjonen som måler 23,9 mm, og fremkomsten av flere mindre lesjoner. C og D) 2010 MR av cervical og thorax ryggraden viser tumor regresjon etter en behandling med irinotecan og bevacizumab.
I mars 2009 på grunn av progresjon av sykdommen han hadde en thorax laminektomi og reseksjon av intradural intramedullært svulst. Han hadde alvorlig spinal kompresjon og begynte å ha svakhet i bena. På grunn av ytterligere tilbakefall, pasienten hadde da en annen debulking kirurgi i juli 2009. Han fikk også oksaliplatin og etoposid behandling i juli og august 2009, men svulsten kommet enda mer (figur 2B).
Passende informert samtykke ble signert og på den tiden av debulking kirurgi av juli 2009, ble en steril biopsi tatt å vurdere følsomheten av tumorceller (mesteparten av svulsten og CSLCs) mot standard-of-care kjemoterapi narkotika ved hjelp av vår ChemoID analysen. Biopsi ble plassert i RPMI-1640 sterile medier og vev ble dissosiert i vårt laboratorium i en enkelcellesuspensjon ved bruk av en GentleMACS vev dissociator (Miltenyi, Aubourn, CA). Den enkeltcellesuspensjon ependymoma ble sådd ut i RPMI-1640 i nærvær av 5% bestrålt, varmeinaktivert, definert kalvefosterserum, streptomycin og penicillin, og cellene ble dyrket som et monolag i 15 dager. Celler ble immunophenotyped ved flowcytometeret hjelp antistoffer mot CD34, CD38, CD44, CD117, CD133, OCT3 /4, og Nanog.
ependymoma celler ble funnet positive til OCT3 /4 (2,73%), Nanog (0,95 %), CD133 (49,93%), CD117 (36,81%) og CD44 (20,39%) sammenlignet med en isotype kontrollantistoff (figur S1 AE). En dobbel farging av CD34 og CD38 viste tilstedeværelse av 1,88% av cellene CD34 + /CD38 +, og 78,4% CD34 + /CD38- celler (figur S1 F).
Å utvide CSLC befolkning på CD133 + celler fra ependymoma primær kultur, ependymom cellene ble dyrket som tidligere beskrevet [8]. 1 × 10∧6 av ependymoma celler fra et monolag primærkultur ble dyrket i ti dager med Hydrodynamisk Fokusering bioreaktor (HFB) (Celdyne, Houston, TX) [8]. De ependymoma celler dyrket i bioreaktor dannet cellegruppene (figur 3A) som ble utvidet 14,7 ganger (tabell 1) og syntes å være 95,93% CD133 positiv etter 10 dager med kultur i bioreaktor (Figur S1 C, beriket CSLCs).
A) Contrast fase bilde av en klynge av beriket CSLCs etter 7 dager med kultur i en hydrofocusing bioreaktor. B) immunsvikt nakne mus (nu /nu) injiseres med 1 x 10∧2 ependymom celler MacSorted CD133 (+) celler eller CD133 (+) ependymom celler dyrket i hydrofocusing bioreaktor, ved hjelp av 100 ul av Matrigel i flanken dannet en svulst innen 3 måneder sammenlignet med CD133 (-) celler
Hvis du vil kontrollere svulsten initiere kapasiteten til HFB vokst celler, injisert vi fem immunmangel hårløse mus /gruppe en rekke 1. × 10∧2, 1 × 10∧3, 1 × 10∧4, og 1 x 10∧5 celler dyrket i HFB (~96% CD133 +) og sammenlignet deres vekst til et likt antall CD133 (+) MACsorted celler og CD133 (-) celler for 3 måneder. Vi observerte at både 1 × 10∧2 MacSorted CD133 (+) celler eller CD133 (+) fra bioreaktor vokste i alle immunmangelfulle mus injisert og dannet en håndgripelig svulst innen 12 uker (Figur 3B).
for å utføre analysen ChemoID et tilsvarende antall celler (1 x 10∧5) delen av tumorceller dyrket som et monolag 2D og CSLCs anriket i bioreaktoren [8] ble separat sådd ut i 96 brønn plater (n-5) og kopier ble behandlet i en time med en rekke anticancer legemidler ved en rekke konsentrasjoner, inkludert klinisk relevant dosering (tabell 2). ChemoID Analysen ble utført ved hjelp av et panel av legemidler som består av cisplatin, oksaliplatin, arabinosid-C, VP-16, busulfan, metotreksat, irinotecan, og bevacizumab som er valgt av den behandlende onkolog.
Følsomhet for kjemoterapi ble vurdert til 48 timer etter WST8 levedyktighet analysen. Det ble kategorisert som følger basert på prosentandelen av ikke-levedyktige celler: responsive (0-40% celle overlevelse), middels (40-70% celle overlevelse), og ikke-responsive (70-100% celle overlevelse). Den WST8 Analysen ble gjennomført tre ganger med n-5 vel kopier /stoffet /dose hver gang.
ChemoID analysen viste at ependymoma celler dyrket i mono og utgjør størsteparten av kreftceller var følsomme for klinisk relevante doser av cisplatin, irinotecan, busulfan, og en kombinasjon av irinotecan og bevacizumab i en statistisk signifikant måte (p 0,05). Interessant, CSLCs var følsomme for en kombinasjon av irinotecan og bevacizumab (p 0,05), intermediært følsom overfor cisplatin, og irinotecan, men ikke følsom for busulfan. På den annen side, både CSLCs og hoveddelen av tumorceller som ikke var responsive overfor metotreksat, oksaliplatin, arabinosid-C, og VP-16 (figur 4).
1 x 10∧3 hoveddelen av tumorceller eller CSLCs belagt i 5 kopier i 96-brønners plater ble utfordret for en 1-timers puls med et panel av kreftmedisiner som er anbefalt av onkolog. En WST-8 Analysen ble utført 48 timer etter kjemoterapi for å vurdere celle levedyktighet. Data blir plottet i søylediagram som responsive (0-40% celleviabilitet), moderat responsive (40-70% celleviabilitet), og ikke-responsive (70-100% celleviabilitet). Lysegrå linje representerer følsomheten CSLCs til kjemoterapi med hensyn til negative ubehandlede kontrollceller. Mørk grå linjen representerer følsomheten parten av kreftceller til kjemoterapi med hensyn til negative ubehandlede kontrollceller. Antikreftmidler som ble testet er angitt nederst i diagrammet. Statistisk analyse av betydningen av resultatene ble utført med en en-veis ANOVA. Stjernene viser
p
verdier på mindre enn 0,05.
På grunn av mangel på svar på en oksaliplatin og etoposid forvaltning gitt i august 2009 (figur 2B) (som ble startet før mottar resultatene fra ChemoID assay), pasienten gjennomgikk i oktober 2009 en behandling med bevacizumab og irinotecan, som ble administrert annenhver uke i 6 måneder. I en oppfølgings MR mai 2010 pasienten viste innledende sykdom regresjon værende fri fra sykdom progresjon i 18 måneder (figur 2 C og D). Dette samsvarer med lengste sykdomsprogresjon periode observert i denne pasient uten store de-bulking kirurgi.
Tilbakefall av tumorvekst etter 18 måneder med sykdom gratis progresjon ledet oss til å utforske nye terapeutiske tilnærminger for behandling av denne pasienten kreft. I denne forbindelse, ble kombinert kjemoterapi undersøkt for å identifisere naturlige forbindelser som kan øke den kliniske effekten av anticancermedikamenter.
BITC har blitt vist i andre laboratorier [14], [15] for å øke den kjemosensitivitet av cancer celler. Vi har nylig observert i vårt laboratorium (data ikke vist) at benzylisotiocyanat (BITC) øker spesifikt kjemosensitivitet av CD133 positive cancerceller. Fordi de primære ependymoma cellene i vår pasient viste en høy andel av cellene positive til CD133, ønsket vi å teste hypotesen om at BITC kunne øke sin kjemosensitivitet til irinotecan og bevacizumab. Vi har funnet med ChemoID analysen at økende konsentrasjoner av BITC som strekker seg fra 2,5 uM til 20 uM redusert levedyktighet av CD133 (+) ependymom celler fra pasient 1 fra 90% til 62% i en statistisk signifikant måte (figur 5A). ChemoID assay også fastslått at kombinasjonen av irinotecan, og en ikke-toksisk konsentrasjon på 10 uM BITC redusert levedyktighet av ependymoma cellene fra 60% til 40% (over 40% mer kjemosensitiv sammenlignet med ikke BITC behandlede celler) (figur 5 B) . Dessuten er kombinasjonen av irinotecan og bevacizumab med BITC reduseres ytterligere levedyktigheten av de ependymoma celler til 30% (figur 5 B). Pasienten ble behandlet med irinotecan og bevacizumab, men denne gangen med en kombinasjon av 2 kapsler /dag i en Triple Action Cruciferous vegetabilsk ekstrakt inneholder høy konsentrasjon av BITC (LifeExtension, https://www.lef.org), for to måneder. Etter kombinasjonsbehandling av irinotecan, bevacizumab og tilskudd av cruciferous grønnsaker, har vi observert en 4 cm regresjon (som tilsvarer en 50% regresjon) av lesjoner i thorax og livmorhalsen området [sammenligne figur 5C (ved tilbakefall) til Figur 5D (etter behandling)]. I tillegg har vi rapportere at pasienten var i stand til å tåle hele løpet av irinotecan og bevacizumab kjemoterapi med mindre tretthet og toleranse for kulde.
A) 1 × 10∧3 CSLCs belagt i 5 kopier i 96-brønn platene ble utfordret for en 1-timers puls med 2,5, 10 og 20 mikrometer BITC. En WST-8-analysen ble utført 48 timer etter behandling for å vurdere cellelevedyktighet. B) 1 × 10∧3 CSLCs belagt i 5 kopier i 96-brønners plater ble utfordret for en 1-timers puls med 10 mm BITC etterfulgt av en 1-timers puls med 0,5 mM CPT-11. En WST-8 Analysen ble utført 48 timer etter cellegiftbehandling for å vurdere celle levedyktighet. Data blir plottet i søylediagram som responsive (0-40% celleviabilitet), moderat responsive (40-70% celleviabilitet), og ikke-responsive (70-100% celleviabilitet). Lysegrå linje representerer følsomheten CSLCs til kjemoterapi med hensyn til negative ubehandlede kontrollceller. Mørk grå linjen representerer følsomheten parten av kreftceller til kjemoterapi med hensyn til negative ubehandlede kontrollceller. Statistisk analyse av betydningen av resultatene ble utført med en en-veis ANOVA. Stjernene indikerer
p
verdier på mindre enn 0,05. C) 2012 MR av cervical og thorax ryggraden viser tilbakefall etter en 18 måneders progresjonsfri perioden. D) 2012 MR av cervicalcolumna viser merket tumor regresjon av thorax ryggraden lesjon etter kombinasjonsbehandling med irinotecan (CPT11), bevacizumab (Avastin), og BITC tilskudd.
Effekten av kjemoterapi vist i vitro ved ChemoID analysen ble testet på ependymoma cellene i pasient~~POS=TRUNC en som var xenopodet i en NOD-
SCID
musemodell (figur 6 A og B).
