Abstract
Bakgrunn og Mål
GLI1, som en uunnværlig Transkripsjonsfaktor av Hedgehog signalveien, spiller en viktig rolle i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen (PC). DNA metyltransferaser (DNMTs) megle metylering av mengden av kreftrelaterte gener. Vår studie forsøkte å utforske forholdet mellom GLI1 og DNMTs.
Metoder
Uttrykk for GLI1 og DNMTs ble oppdaget i svulsten og nærliggende normalt vev av PC pasienter ved immunhistokjemi (IHC). PANC-1 celler ble behandlet av cyclopamine og GLI1-siRNA, mens BxPC-3-celler ble transfektert med overekspresjon-GLI1 lentiviral vektor. Deretter GLI1 og DNMTs uttrykk ble analysert ved QRT-PCR og western blot (WB). Så tok vi kromatin immunoprecipitation (chip) til å demonstrere GLI1 binder seg til DNMT1. Endelig nestet MSP ble tatt til å vurdere de metylering nivåer av APC og hMLH1, når GLI1 uttrykk endres.
Resultater
IHC resultat foreslo uttrykk for GLI1, DNMT1 og DNMT3a i PC vev var alle høyere enn i tilstøtende normale vev (p 0,05). Etter GLI1 uttrykk trykt av cyclopamine i mRNA og proteinnivå (nedregule 88,1 ± 2,2%, 86,4 ± 2,2%, henholdsvis), DNMT1 og DNMT3a mRNA og proteinnivå ble redusert med 91,6% ± 2,2% og 83,8 ± 4,8%, 87,4 ± 2,7% og 84,4 ± 1,3%, henholdsvis. Når ytterligere slått ned uttrykket av GLI1 av siRNA
(
mRNA redusert med 88,6 ± 2,1%, protein redusert med 63,5 ± 4,5%), redusert DNMT1 og DNMT3a mRNA ved 80,9 ± 2,3% og 78,6 ± 3,8% og protein er redusert med 64,8 ± 2,8% og 67,5 ± 5,6%, henholdsvis. Over-uttrykk for GLI1 av GLI1 genet transfeksjon (mRNA økt med 655,5 ± 85,9%, og protein økt med 272,3 ± 14,4%.), DNMT1 og DNMT3a mRNA og protein økt med 293,0 ± 14,8% og 578,3 ± 58,5%, 143,5 ± 17,4 % og 214,0 ± 18,9%, respektivt. Chip-analyser viste GLI1 proteinbundet til DNMT1 men ikke til DNMT3a. Resultater av nestet MSP demonstrert GLI1 uttrykk påvirket DNA metylering nivået av APC, men ikke hMLH1 i PC.
Konklusjon
DNMT1 og DNMT3a reguleres av GLI1 i PC, og DNMT1 er dens direkte mål genet .
Citation: Han s, Wang F, Yang L, Guo C, Wan R, Ke A, et al. (2011) Uttrykk for DNMT1 og DNMT3a reguleres av GLI1 i Human kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (11): e27684. doi: 10,1371 /journal.pone.0027684
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 5 juli 2011; Godkjent: 21 oktober 2011; Publisert: 14.11.2011
Copyright: © 2011 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Natural Foundation Science of China (81072005, 81172312) og Shanghai Science and Technology Committee (08411963000, 09JC1412200). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en svært dødelig sykdom, som vanligvis er diagnostisert i en avansert tilstand der det er lite eller ingen effektiv behandling. Det har den verste prognosen av noen store malignitet (3% 5-års overlevelse) og er den fjerde vanligste årsaken til kreftdød årlig i flere land. Til tross for fremskritt innen medisinsk og kirurgisk behandling, har liten effekt blitt gjort på dødeligheten av denne sykdommen. En av de store kjennetegnene til kreft i bukspyttkjertelen er dens omfattende lokal tumorinvasjon og tidlig systemisk spredning. Så det er et presserende behov for å avdekke de underliggende mekanismene som kreft i bukspyttkjertelen celler blir invaderende og metastatisk.
Hedgehog signalkaskade er abnormt aktivert i en rekke humane tumorer inkludert kreft i bukspyttkjertelen (PC) [1]. Aktivering av Hh veien krever binding av Hh ligander som Shh, Ihh og DHH, til Hh reseptor Lappet (ptch), og dermed frigjøre Hh signaliserer molekyl glattet (Smo) fra ptch-indusert hemming. Smo igjen initierer utgivelsen av transkripsjonsfaktoren GLI fra cytoskjelettet av et kompleks av proteiner, letter dermed sitt atomtrans, GLI aktivatorer deretter binde til GACCACCCA-lignende motiv for transkripsjonsregulering av Hedgehog målgener som er involvert i regulering av celleproliferasjon, celle skjebne besluttsomhet, cellular overlevelse, og epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og etc. En membran glykoprotein Menneskelig Hedgehog Samhandle Protein (HHIP) kan binde seg til alle tre Hh ligander og funksjoner til negativt regulere aktiviteten til Hh signalveien [2], [3].
DNA metylering endringen er en viktig bidragsyter til menneskelig onkogenese [4]. I humane kreftceller, er det normale somatiske mønster av DNA-metylering endret. Disse endringene inkluderer økt CpG island metylering, som formidler tumorsuppressorgenet stanse [4], og genomisk DNA hypometylering, noe som kan føre til genomisk ustabilitet [5], [6]. Cytosine DNA metylering katalyseres og regulert av en liten familie av DNA metyltransferaser (DNMTs), inkludert DNMT1, DNMT3a, DNMT3b og DNMT3L [7]. Selv om kreftspesifikke mutasjoner av DNMTs ikke er rapportert, flere studier antyder at DNMT gener er overuttrykt i human kreft, og i løpet av cellulær transformasjon [8] – [11]. Flere mekanismer synes å utgjøre DNMTs over-uttrykk, inkludert avvikende cellesykluskontroll, økt mRNA og protein stabilitet, og E2F-mediert DNMTs promoter aktivering [11] -. [14]
Selv om bevisene ovenfor indikerer at DNMTs og aktiv Hh signalveien er begge involvert i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen, er lite kjent om sammenhengen mellom DNMTs og medlemmer av Hh veien. Her ble denne studien gjennomført for å undersøke uttrykket av GLI1 og DNMTs, og korrelasjonen mellom dem i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
vev kreft i bukspyttkjertelen og tilsvarende ikke-kreft bukspyttkjertelen ble hentet fra Shanghai tiende Folkets sykehus, hvor vi har fått etikk godkjenning fra Medicine and Life Sciences etikkomiteen.
Cellekulturer kulturer~~POS=HEADCOMP og medikamentell behandling
Menneskelig kreft i bukspyttkjertelen cellelinje PANC-1 og BxPC-3 ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), streptomycin 100 ug /ml, og penicillin 100 U /ml ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft -humidified kuvøse. BxPC-3-celler ble dyrket i lentiviral transfeksjon av overekspresjon-GLI1 lentiviral vektor. PANC-1 celler ble platet ved en tetthet på 4 x 10
4 celler /cm
2 i en seks-brønns plate, Cyclopamine (Sigma, St. Louis, MO) ble oppløst i 100% etanol og deretter fortynnet fersk på testdagen for cellekultureksperimenter. PANC-1-cellene ble behandlet med sluttkonsentrasjonen av Cyclopamine ved 10 uM i 24 timer.
Immunhistokjemi (IHC)
Tyve par av PC og tilsvarende ikke-kreft pankreas vev ble oppnådd fra Shanghai tiende Folkets sykehus. Pankreas pasientens tumorsnitt ble de-paraffinised, rehydrert, behandlet med 10 mM citrat-buffer ved 95 ° C for å hente antigener, blokkert med 5% BSA og inkubert med mus anti-GLI1 (1:100), kanin-anti-DNMT1 ( 1:100) eller kanin-anti-DNMT3a antistoff (1:100; alle fra Santa Cruz Biotech) over natten. De vevssnitt ble deretter inkubert med sekundære antistoffer og DAB reagens (Gene Tech, Shanghai, Kina). Seksjonene ble deretter kontra med hematoksylin, da var dehydrert og visualisert med 3,3-diaminobenzidin (Gene Tech, Shanghai, Kina). Negative kontroller ble gjennomført i hvert tilfelle ved å erstatte det primære antistoff med PBS.
RT-PCR og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra PANC-1-celler bruker Trizol reagens (Invitrogen, California, USA), en mikrogram RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Shiga, Japan). For å bestemme mengden av mRNA, ble cDNA forsterket av real-time PCR med SYBR Premiks Ex Taq RT-PCR kit (Takara Bio, Shiga, Japan), og husholdningsgenet β-actin ble brukt som intern kontroll. De SYBR grønn analyser ble utført i tre eksemplarer på en 7900HT sanntidsinstrument (Applied Biosystems, CA, USA). Primere som brukes for QRT-PCR ble notert (tabell 1). De relative uttrykk nivåer ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT
metode.
Western Blot (WB)
Totalt cellelysat ble utarbeidet i en 1 x natriumdodecylsulfat buffer. Proteiner i den samme mengde ble separert ved 6% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Etter inkubasjon med antistoffer som er spesifikke for DNMT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) eller DNMT3a (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) eller GLI1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) eller β-aktin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), de blotter ble inkubert med geit anti-kanin eller anti-mus sekundære antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) og visualisert med forbedret chemiluminescence.
Små interfering RNA-mediert hemming av GLI1 uttrykk
Stealth liten forstyrrelse RNA (siRNA) sekvenser for GLI1 ble utformet og syntetisert av GenePharma å målrette GLI1 mRNA. Den kodende tråd for GLI1 siRNA var 5′-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3 «. En urelatert siRNA-sekvens ble anvendt som en kontroll. I dette eksperimentet, ble cellene inkubert i 12 timer og transfektert ved omtrent 60% konfluens med 50 nm siRNA duplekser ved hjelp av Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Alle forsøkene ble utført 72 timer etter transfeksjon.
Lentiviral Transfeksjon av Overuttrykte-GLI1 Lentiviral Vector
Lentiviral transfeksjon av overekspresjon-GLI1 lentiviral vektor PGC-FU-GLI1 ble utført som vi rapporterte tidligere [ ,,,0],15]. Menneskelig GLI1 cDNA ble kjøpt fra Open-Biosystem (USA). Den komplette cDNA sekvens av GLI1 ble generert av PCR, og settes inn i PGC-FU-3FLAG Vector (GeneChem Company, Shanghai, Kina) som ble linearisert med
Age I
og
Nhe I
( fig. S1, S2). Det resulterende 3320 bp-fragmentet ble bekreftet ved sekvensering (fig. S3). Lentiviral vektor ble produsert av co-transfektert inn 293T celler med hjelperen konstruere. Titre av 2-5 × 10
7 TU /ml ble rutinemessig oppnådd. BxPC-3 celler ble transfektert med lentiviral vektor og GLI1 uttrykk ble etablert av real-time PCR og Western blot analyse.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
DNA-GLI1-protein immunkomplekser var preparated som vi tidligere har rapportert [15], etter revers tverrbundet, DNA ble ekstrahert med fenol /kloroform og utfelt. Nærværet av DNMT1 og DNMT3a promoter domene som inneholder GLI1 motivene i immunopresipitert-DNA ble identifisert ved PCR ved anvendelse av primere (tabell 2). PCR-betingelsene for DNMT1 og DNMT3a promoter region var: denaturering i 30 sekunder ved 94 ° C, annealing 30 s, forlengelse 1 minutt ved 72 ° C. Annealing temperaturer ble oppført i tabell 2. forsterkning av DNMT1 og DNMT3a promoter-regionen ble analysert etter 40 sykluser. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
DNA forberedelse
DNA ble ekstrahert ved TIANamp Genomisk DNA Kit (Tiangen, Beijing, Kina). Omtrent 500 ng hentet DNA var bisulfite samtalte og kolonne-renset ved EZ DNA Metylering-Gold ™ Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) for å lage 10 mL prøve.
Nøstet MSP
DNA-metylering status på promotorområdene av APC (adenomatøs polypose coli) og hMLH1 (human mutl homolog 1) ble bestemt ved metoden til MSP ytterligere modifisert som en nestet to-trinns metode med primerne beskrevet tidligere [16], [17 ]. I trinn en av de nestede MSP, ble primere laget for å forsterke både denaturert og unmethylated genomiske regioner. Produktene ble likt fortynnet 1:100 og utsettes for trinn to i den nestede MSP med primere utformet for å gjenkjenne bisulfitt-indusert sekvensforskjeller mellom denaturert og unmethylated genomiske regioner. PCR-betingelsene for trinn en var som følger: 95 ° C varm start x 5 min, deretter 40 gjentatte sykluser med denaturering (95 ° C x 30 s), annealing (56 ° C x 30 s), forlengelse (72 ° C x 30 s), etterfulgt av en endelig 5 min forlengelse ved 72 ° C. Og at det for trinn to var: 95 ° C varm start x 5 min, deretter 30 gjentatte sykluser med denaturering (95 ° C x 30 s), annealing (59 ° C x 30 sekunder for APC, 60 ° C x 30 sekunder for hMLH1 ), forlengelse (72 ° C x 30 sekunder), etterfulgt av en endelig 5 min forlengelse ved 72 ° C. MSP-produkter ble separert elektroforetisk på 2% agarosegeler.
Statistical Analysis
Kvantitative data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Real-time PCR data ble analysert i henhold til forskjellene i mål genuttrykk ved paret t-test og var 2
-ΔΔCT
transformert før analyse. IHC data ble analysert ved anvendelse av Chi-kvadrat-test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
GLI1, DNMT1 og DNMT3a var oppregulert i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen vev
For å bekrefte roller av GLI1 og DNMTs i utviklingen av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen, vi først undersøkt om deres uttrykk ble endret i kreftvevet. Derfor studerte vi GLI1, DNMT1 og DNMT3a uttrykk i 20 sammenkoblede biopsi vev av PC pasienter med IHC. Vi fant ut at GLI1, DNMT1 og DNMT3a uttrykk var høyere i de fleste PC sammenlignet med normalt vev (14/20 versus 5/20, p = 0,004; 15/20 versus 6/20, p = 0,004; 13/20 versus 5 /20, p = 0,011, henholdsvis figur 1). 14 av 20 PC tilfeller hadde høyere uttrykk av GLI1 protein, hvorav 12 saker uttrykt høyere nivåer av DNMT1 protein (p = 0,004) og 11 tilfeller uttrykt høyere nivåer av DNMT3a protein (p = 0,012).
Immunhistokjemisk undersøkelse for GLI1, DNMT1, ble DNMT3a protein utført i 20 par PC og tilstøtende normalt vev. Representative bildene vises. Tilstøtende normalt vev viste ingen eller svak farging for GLI1, DNMT1 og DNMT3a imidlertid forekomsten av alle de tre proteinene atom immunoreaktivitets var mye høyere i PC-vev. Alle photomicrographs ble oppnådd ved × 200 forstørrelse.
Cyclopamine og GLI1 siRNA både hemmet DNMT1 og DNMT3a uttrykk
For å avgjøre om Hh aktivitet påvirket uttrykk for DNMTs, brukte vi cyclopamine, en klassisk inhibitor av Hh signalveien, for å redusere ekspresjon av GLI1. PANC-1-celler, som tidligere er rapportert for å uttrykke et høyt nivå av GLI1 [15], ble behandlet med 10 uM cyclopamine i 24 timer. Etterpå ble QRT-PCR og WB tatt å analysere uttrykk for GLI1 og DNMTs. DNMT1 og DNMT3a mRNA redusert med 91.6.0 ± 2,2% og 83,8 ± 4,8%, henholdsvis, når GLI1 mRNA redusert med 88,1 ± 2,2%. DNMT1 og DNMT3a protein redusert med 87,4 ± 2,7% og 84,4 ± 1,3% når GLI1 protein redusert med 86,4 ± 2,2% (figur 2).
PANC-1 celler ble behandlet med 10 mm cyclopamine i 24 timer, deretter relative uttrykk for GLI1, DNMT1 og DNMT3a mRNA ble bestemt ved QRT-PCR (A, B, C), mens ekspresjonen av GLI1, DNMT1 og DNMT3a protein ble analysert ved hjelp av Western blot (D). Det innfelte viser en betydelig nedgang i GLI1, DNMT1 og DNMT3a uttrykk. Resultatene ble normalisert til den av β-aktin ekspresjon. Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Vi videre designet og syntetisert GLI1 siRNA, deretter transfektert inn PANC-en cellelinje. PANC-1-celler transfektert med et ubeslektet siRNA-sekvens ble anvendt som en negativ kontroll [18], og PANC-1-pasienter behandlet med Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) bare ble anvendt som blindprøve. 72 timer etter transfeksjon, ble QRT-PCR og WB tatt for å bestemme ekspresjon av GLI1 og DNMTs. DNMT1 og DNMT3a mRNA redusert med 80,9 ± 2,3% og 78,6 ± 3,8%, henholdsvis, når GLI1 mRNA redusert med 88,6 ± 2,1%. DNMT1 og DNMT3a protein redusert med 64,8 ± 2,8% og 67,5 ± 5,6% når GLI1 protein redusert med 63,5 ± 4,5% (figur 3).
Panc-1 celler ble transfektert med GLI1 siRNA, 72 timer etter transfeksjon, relative uttrykk for GLI1, DNMT1 og DNMT3a mRNA ble bestemt ved QRT-PCR (A, B, C), mens ekspresjonen av GLI1, DNMT1 og DNMT3a protein ble analysert ved hjelp av Western blot (D). Det innfelte viser en betydelig nedgang i DNMT1 og DNMT3a uttrykk etter GLI1 forstyrrelser. Resultatene ble normalisert til den av β-aktin ekspresjon. Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Den uttrykk for DNMT1 og DNMT3a ble oppregulert med GLI1 overekspresjon
For ytterligere å bekrefte reguleringen av DNMT1 og DNMT3a av GLI1, har vi designet og konstruert et lentivirus vektor som uttrykt GLI1, og transfektert den inn BxPC-3 med lavest GLI1 uttrykk i PC cellelinjer som vi tidligere rapportert [15]. Celler transfektert med tom vektor lentivirus ble anvendt som negative kontroller, mens celler uten transfeksjon ble anvendt som kontroller tomme. 48 timer etter transfeksjon, ble QRT-PCR og WB tatt for å bestemme ekspresjon av GLI1 og DNMTs i de tre cellelinjer. DNMT1 og DNMT3a mRNA økt med 293,0 ± 14,8% og 578,3 ± 58,5%, henholdsvis, når GLI1 mRNA økt med 655,5 ± 85,9%. DNMT1 og DNMT3a protein økt med 143,5 ± 17,4% og 214,0 ± 18,9%, henholdsvis, når GLI1 protein økt med 272,3 ± 14,4% (figur 4).
BxPC-3-celler ble transfektert med PGC-FU-GLI1 , relative uttrykk for GLI1, DNMT1 og DNMT3a mRNA ble bestemt ved QRT-PCR (A, B, C), mens ekspresjonen av GLI1, DNMT1 og DNMT3a protein ble analysert ved hjelp av Western blot (D). Det innfelte viste en betydelig økning i DNMT1 og DNMT3a uttrykk etter GLI1 over-uttrykk. Resultatene ble normalisert til den av β-aktin ekspresjon. Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Bekreftelse på GLI1 proteinbundet til promoter-regionen i DNMT1 genet
Vi har så langt vist seg rollen GLI1 i DNMT1 og DNMT3 uttrykk. Imidlertid fortsatt mekanismen bak en slik regulering ikke klarlagt. For å undersøke om DNMTs er direkte regulert av GLI1 eller ikke, vi søkte på DNMT1 og DNMT3a promoter for potensielle GLI1 bindingssteder til DNA konsensus sekvensen 5′-GACCACCCA-3 «[19] eller 5′-TGGGTGGTC-3′ [20] og fem høye-scoring kandidatwebområder av GLI1 mål ble funnet i DNMT1 sin promoter og seks i DNMT3a tallet. Hvert område har bare to nukleotid er forskjell i sammenligne med 5»-GACCACCCA-3 «eller 5′-TGGGTGGTC-3» (figur 5). Brikken ble tatt for å bekrefte markerings forholdet mellom Telenor protein og DNMT1 /3a genet. DNA ekstrahert fra PANC-1-cellene ble ultralydbehandlet i 100-1000 bp (Fig. S4) og som chip-PCR-templat. Resultatet av DNA elektroforese viste spådd DNA bandet i INPUT, GLI1-Ab, og postive kontrollgrupper ved hjelp av menneskelig DNMT1 primer-C, og ikke i IgG og negative kontrollgruppene (figur 6). Bare INPUT og den positive kontroll viste det forutsagte båndet ved hjelp av human DNMT1 primer-A, C-E og DNMT3a primer A-E, men ikke i GLI-Ab, IgG, og negative grupper (data ikke vist). Som positiv produkt amplifisert ved DNMT1 primer-C inneholder kandidaten GLI1 bindingssetet 2 og 3 (tabell 2 og figur 5), mens produkt amplifisert ved DNMT1 primer-B inneholder kandidaten GLI1 bindingssetet 2 var negativ, og resultatene av sekvensanalyse viste at den sekvensene var de samme som for den DNMT1 genpromoteren av området 3 (fig. S5), foreslo at GLI1 ble bundet til DNMT1 genpromoteren av området 3 (GGCCTCCCA).
to parallelle linjer på toppen av figuren representert DNMT1 eller DNMT3a DNA, henholdsvis (A, B), i hvilket grå rammer representert eksoner, hvite rammer representert introner, og sorte rammer representert promotor. I promoteren, små grå rammer merket med nummer 1 til 5 (A) eller 1 til 6 (B) er representert potensialet GLI1 bindingsseter, som har kun to nukleotider forskjell (understreket) fra GLI1 konsensus bindingssekvens, GACCACCCA. Primere ble konstruert for å amplifisere DNMT1 (A) eller DNMT3a (B) promoter region inneholdende den antatte GLI1-bindingssete. Posisjonen og lengden av produkter amplificated av hver primer ble vist.
Lysates fra PANC-1 celler ble utsatt for Chromatin immunoutfelling med anti-GLI1 antistoff. Ultralydbehandlet kromatin ble brukt som input DNA-kontroll (INPUT). RNA polymerase II ble anvendt som positiv kontroll (PC). IgG ble anvendt som tilfeldig kontroll (IgG) og β-aktin Ab ble anvendt som negativ kontroll (NC). Bandet chip-PCR produktene forsterkes av DNMT1 Primer-C (i) og ved DNMT1 Primer-B (ii) ble vist.
De DNA metylering nivåer av APC, men ikke hMLH1 promoter regioner endret med GLI1 uttrykk
Antall kreftrelaterte gener ble funnet å bli brakt til taushet av DNA metylering i PC, inkludert APC (adenomatøs polypose coli) og hMLH1 (human mutl homolog 1). For å få tilgang enten hemme eller øke uttrykket av GLI1 kunne også føre til hypo- eller hyper-metylering av APC og hMLH1 i PC, brukte vi nestet MSP å evaluere metylering status for PANC-en med eller uten GLI1 knockdown og BxPC-3 med eller uten GLI1 over-uttrykk, henholdsvis. Resultatene viste at APC DNA-metylering nivå økes i BxPC-3-celler transfektert med Overekspresjon-GLI1 Lentiviral vektor sammenlignet med den negative kontroll, og ble hemmet i PANC-1-celler transfektert med GLI1-siRNA sammenlignet med den negative kontroll. Imidlertid DNA-metylering nivået av hMLH1 promoter-regionen ble ikke vesentlig endret etter transfeksjon (figur 7). Dette trolig fordi DNA metylering koordineres av en familie av DNMTs bestående DNMT1, 3a, -3b og -3L, kanskje uttrykket endring av bare DNMT1 og 3a regulert av GLI1 var ikke tilstrekkelig til å påvirke DNA metylering nivåer av hver tumor- relaterte gener [21].
Resultater av nestet MSP av APC og hMLH1 i seks typer PC-celler henholdsvis ble vist. B representert BxPC-3 celler; B-G + representert BxPC-3 transfektert med PGC-FU-GLI1 å gjøre GLI1 over-uttrykk, og B-NC representerte sin negative kontroll; P representert PANC-1; P-G-si representert PANC-en transfektert med GLI1-siRNA og P-NC representerte sin negative kontroll. Positive band henhold M og U representerte metylert og unmethylated DNA av de tilsvarende gener i panelet til høyre, henholdsvis.
Diskusjoner
I denne studien fant vi at GLI1, DNMT1 og DNMT3a er over-uttrykt i PC vev sammenlignet med tilsvarende ikke-kreft bukspyttkjertelen vev, så vi viste at DNMT1 og DNMT3a uttrykk endres i henhold til GLI1 uttrykk i Panc-1 og BxPC-3 cellelinjer ved spesifikk GLI1 forstyrrelser og genet transfeksjon, samt farmakologiske metode
in vivo
. Enda viktigere, beviste vi utover rimelig tvil at GLI1 var i stand til å binde seg til DNMT1 genet formidler av nettstedet 3 (GGCCTCCCA) av chip eksperimenter. Til slutt brukte vi nestet MSP å vise at GLI1 uttrykk påvirket DNA metylering nivået av APC, men ikke hMLH1 i PC. Så langt vi kjenner til, er dette den første rapporten viste GLI1 som en transkripsjonsfaktor som er regulert DNMT1 og 3a uttrykk samt APC metylering nivå i PC, og DNMT1 er dens direkte mål genet.
GLI1, som en transkripsjonsfaktor Hh signalveien, er oppregulert i de fleste fordøyelses tumorer inkludert PC [22], [23]. Så langt har bare noen få nedstrøms mål for GLI1 blitt identifisert [24]. Nylig ble det rapportert å være involvert i PC-invasjon og metastase, og er blitt et nytt mål for behandling [25], [26]. Men lite var kjent om selve mekanismen forstått i sin promotering av invasjon og metastasering i PC. Videre har vi fokusert på å samle bevis som viser at karsinom i forskjellige organer, inkludert bukspyttkjertel, er assosiert med avvikende DNA-metylering, hvori DNMTs er nøkkelen katalysatoren signifikant assosiert med akkumulering av metylering av tumorrelaterte gener, hvorav noen var forbundet withcell spredning som APC, noen var i slekt med reparasjon av DNA-skader som hMLH1, noen var invasion- eller metastase-relatert, slik som TIMP-3, SPARK, og CDH1, eller celledød med arbeidet, som DAPK-en, og dermed spiller en viktig rolle i flertrinns kreftutvikling i bukspyttkjertelen fra tidlige forstadier stadier til ondartet progresjon [27]. Nylig ble det funnet at tumorbyrde reduseres betydelig med avtagende nivåer DNMT1
in vivo
, hvilket antyder at DNMTs mediert DNA-metylering er involvert i pankreas karsinogenese [28]. Basert på denne studien og tidligere rapporter over, er det mulig at GLI1-DNMTs kaskade hjelp til invasjon eller metastase gjennom å fremme den metylering av noen invasion- eller metastaserelaterte gener, og kan legge til rette for tumorvekst ved å fremme metylering av noen celledød relatert gener.
Vår studie viste at DNMT3a uttrykk er regulert av GLI1 i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen. Imidlertid er selve mekanismen i reguleringen av DNMT3a ved GLI1 fortsatt ukjent. De siste årene har mange manuskripter blitt rapportert at enkelte mikroRNA familier kunne målrette DNMTs i et mangfold av kreft hos mennesker [29] – [32]. På den annen side, ble det rapportert at noen mikroRNA slik som mikroRNA-29-familien ble transkripsjonen trykkes av c-Myc, pinnsvin og NF-kappaB [33]. Basert på bevis ovenfor, er det mulig at Hh-GLI kan regulere DNMT3a gjennom noen bestemte microRNAs som gjenstår å bli utforsket.
I vår studie, chip analyser viste GLI1 binder seg til DNMT1 men ikke DNMT3a. Vi har også lagt merke til at GLI1 forhøyet DNMT3a flere folder enn DNMT1. Vi trodde det var noen mulige bakenforliggende mekanismene som følger: Først GLI1 kan ikke regulere DNMT3a direkte, men gjennom en viss gen, som kan være en kinase eller activin, og via kaskade forsterkning slik som å lede et høyere regulerende effektiviteten av DNMT3a av GLI1. For det andre kan Hedghog-GLI1 direkte eller indirekte regulere flere gener som er involvert i forskjellige signalbaner, og to eller flere av disse genene regulerer også DNMT3a og har synergieffekter, slik at til tross for GLI1 ikke kan regulere DNMT3a direkte, men vil heve DNMT3a flere folder når det over-uttrykker. For å løse dette spørsmålet, er det nødvendig å utforske flere målgener av Hedgehog-GLI1, og å sondere inn i crosstalk mellom ulike signalveier. Vi trodde regulative forholdet mellom Hh-GLI1 og DNMTs ville være ikke så enkelt som vi allerede bekreftet. Videre studier er også nødvendig for å undersøke om det biologiske oppførsel av GLI1 i PC kan oppnås ved å regulere DNMTs.
Den nylig identifiserte GLI1 /DNMTs akse satt en bro mellom Hh signalveien og epigenetikk, som vil bidra til å belyse underling molekylære mekanismen i utviklingen av PC, og kan gi nye terapeutiske mål eller biomarkører for tidligere diagnose.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Identificaton av positive klone produkter i overekspresjon-GLI1 lentiviral vektor konstruksjon. De GLI1 cDNA produkter ble satt inn i linearisert PGC-FU-3FLAG vektor for å konstruere PGC-FU-GLI1 plasmid etter forsterket og renset, deretter forvandlet til Kompetente celler. Transformanter ble identifisert med PCR og elektroforese på 1,5% agarosegel, trans-1 og -4 var viste som et 731 bp band som viste seg å være positiv klon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s001
(TIF)
Figur S2.
Identifikasjon av GLI1 uttrykk i PGC-FU-GLI1 klone av WB. PGC-FU-GLI1 er konstruert som en lentivirus vektor uttrykt GLI1, som var ko-uttrykt med FLAG. (1) WB molekylvekt Marker, med tre-FLAG etikett, smeltet sammen med GFP-genet (48 kDa). (5-8) Prøve etter PGC-FU-GLI1 transfekterte 293T celler. (7) GLI1-FLAG fusjonsprotein (122 kd + 2 kd = 124 KDA), sertifisert GLI1 uttrykk i PGC-FU-GLI1 plasmid
doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Sequence analyse av positive klone produkter i GLI1-overekspresjon lentiviral vektor konstruksjon. Det resulterende 3320 bp-fragmentet ble bekreftet ved sekvensering som er det samme med sekvensen av det GLI1 genekspresjon region i GenBank (NM_005269.2)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s003 plakater (TIF )
Figur S4.
Electropheretogram av ultralydbehandlet kromatin løsning. Sonicated kromatin løsning i ulike forhold (100 W, 80 W og 60 W, henholdsvis) ble elektroforese på 1,5% agarosegel som inneholder ethidium bromied
doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Sequence analyse av chip-produkter som forsterket av DNMT1 primer-C. Resultatet viste at sekvensen amplifisert med DNMT1 primer-C er det samme som for DNMT1 genpromoteren region inneholdende GLI1-bindingssete 2 og 3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0027684.s005
(TIF )
