Abstract
XB130, en roman adapter protein, fremmer cellevekst ved å kontrollere uttrykket av mange beslektede gener. MicroRNAs (mirnas), som ofte er uoverensstemmende uttrykt i kreftceller, regulere ekspresjon av gener målrettede. I denne studien ønsket vi å utforske onkogene mekanisme XB130 gjennom miRNAs regulering. Vi analyserte miRNA ekspresjon i XB130 kort hårnål RNA (shRNA) stabilt transfekterte WRO thyroid kreft celler ved en miRNA matrise-analyse, og 16 mirnas var oppregulert og 22 mirnas ble nedregulert betydelig i disse cellene, sammenlignet med ikke-transfekterte eller negativ kontroll shRNA transfektert celler. Vi valgte tre av oppregulert mirnas (MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p) og validert dem ved real-time QRT-PCR. Ektopisk overekspresjon av XB130 trykt disse 3 mirnas i MRO celler, en cellelinje med svært lav uttrykk for XB130. Videre transfektert vi MIR etterligner av disse 3 mirnas inn WRO celler. De negativt regulert uttrykk for onkogener (MIR-33a: MYC, MIR-149: FOSL1, MIR-193a-3p: SLC7A5), ved å målrette sine 3 «ikke-translatert område, og redusert cellevekst. Våre resultater tyder på at XB130 kan fremme veksten av kreftceller ved å regulere uttrykk av tumor undertrykkende miRNAs og deres målrettede gener
Citation. Takeshita H, Shiozaki A, Bai XH, Iitaka D, Kim H, Yang BB, et al. (2013) XB130, en New Adaptor Protein, Regulerer Expression of Tumor Undertrykkende microRNAs i kreftceller. PLoS ONE 8 (3): e59057. doi: 10,1371 /journal.pone.0059057
Redaktør: Laszlo Buday, ungarske Academy of Sciences, Ungarn
mottatt: 6 oktober 2012; Godkjent: 11 februar 2013; Publisert: 19 mars 2013
Copyright: © 2013 Takeshita et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) driftstilskudd MOP-13270, MOP-42546 og MOP-119514. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Actin filament assosiert protein (AFAP) er en liten familie av adapter proteiner involvert i intracellulær signaltransduksjon, cytoskeletal organisasjon, cellemotilitet og andre cellulære funksjoner. Det inkluderer AFAP [1], AFAP1L1 (actin filament knytte protein 1 som 1) [2], og XB130 (også kjent som aktin filament tilknyttet protein 1-lignende 2, AFAP1L2) [3]. De er blitt vist å delta i reguleringen av ulike signalveier ved å danne protein-protein og /eller protein-lipid-kompleks [1], [4], og under visse omstendigheter disse adapter proteinene kan være involvert i tumordannelse [5], [ ,,,0],. 6]
XB130 er en tyrosin-kinase-substrat, som kan være tyrosin-fosforylert av Src og andre tyrosin-kinaser [7] – [9], og samhandle med Src gjennom dens N-terminale SH2 SH3 og domenebindingsmotiv og formidler Src relatert trans av SRE og AP-1 [7]. Den N-terminale ende av XB130 inneholder også en YxxM motiv som kan binde seg til den p85α subenheten av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) gjennom sine SH2-domener, og deretter aktivere Akt [2], [8]. XB130 medierer celle overlevelse og spredning gjennom flere signaler ned-stream fra Akt [9]. XB130 i human thyroid kreft celler regulerer tumorvekst som er vist i en dyremodell med nakne mus, ved fremming av celleproliferasjon og inhibering av apoptose. Videre knockdown av XB130 reduserer ekspresjon av mange gener relatert til cellevekst og /eller overlevelse [10]. XB130 er også involvert i regulering av cellevandring [11]. Endring av XB130 uttrykk har blitt bemerket i menneskelig skjoldbruskkjertelkreft [10], spiserørskreft [12], og magekreft [13]. Derfor er disse studiene krever videre undersøkelser på funksjonen til XB130 i tumorigenesis.
microRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA (ca. 22 nucleotide lengder), som spesifikt kan samhandle med 3′-uoversatt region (3’UTR) av målrettede mRNA, hemme mRNA oversettelse, eller føre til mRNA cleavage og degradering [14]. Antallet rapporterte menneskerettighets mirnas stiger 2000 (miRBase, Versjon 18 i Sanger Institute), og mirnas spiller viktige roller i å kontrollere biologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering, metabolisme og spredning [15] – [18]. Noen mirnas er ofte mis-uttrykt i kreftceller, og har nylig blitt identifisert som nye faktorer knyttet til onkogenese og tumorprogresjon [19] – [22]. Flere nyere studier fokuserer på regulering av miRNA ekspresjon og funksjon i kreft [23] – [26], inkludert skjoldbruskkjertelkreft [27] -. [29]
Selv om XB130 kan regulere ekspresjonen av mange gener relatert til celle spredning [10], og fremmer cellevekst og overlevelse via PI3K /Akt sti [9], er lite kjent om mekanismene bak sin regulering av genekspresjon. I denne studien, forsøkte vi å finne ut om XB130 kunne regulere uttrykk for noen av disse genene via nedregulering av tumor undertrykkende miRNAs. Vi undersøkte miRNA ekspresjonsnivået ved hjelp av XB130 kort hårnål RNA (shRNA) stabilt transfekterte WRO thyroid kreft celler, sammenlignet med ikke-transfekterte celler eller celler som er stabilt transfektert med negativ kontroll shRNA. På den annen side, transfektert vi MRO kreftceller som har meget lav ekspresjon av XB130 med XB130 plasmid for å forbedre dets ekspresjon. Tre kreft undertrykkende mirnas ble identifisert og videre studert, i form av uttrykk for deres målrettede gener, celleproliferasjon og apoptose.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneskelig skjoldbrusk karsinom WRO celler og MRO celler var fra Dr. S. Asa (University of Toronto, Toronto, Canada) [30], som fikk disse cellene fra Dr. J. Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA ). Celler ble opprettholdt i RPMI 1640, supplementert med 10% FBS, 1 mmol /l-pyruvat og ikke-essensielle aminosyrer (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA), og 1% penicillin-streptomycin. Vi har tidligere etablert WRO celler som er stabilt transfektert med shRNA plasmider for XB130. (C3-1 og C3-4 ble etablert fra vektor C3, C4-3 og C4-11 ble etablert fra vektor C4) og negativ kontroll shRNA plasmid (NC1, NC9 og NC12) ble etablert tidligere [10]. G418 (0,25 mg /ml) ble tilsatt til kulturmediet av transfekterte celler for å opprettholde det merkede. Cellene ble dyrket i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2.
Proteinstudier og Western blotting
Western blot ble utført i henhold til fremgangsmåter som beskrevet tidligere [ ,,,0],31], [32]. I korte trekk ble celler lysert med modifisert Radioimmun nedbør analysebuffer (50 mmol /liter Tris-HCl, pH 7,5, 150 mmol /l NaCl, 2 mmol /liter EGTA, 2 mmol /l EDTA, og 1% Triton X-100) inneholdende 10 ug /ml hver av aprotinin, leupeptin, pepstatin, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mmol /l Na
3VO
4 og 10 mmol /l NaF. Protein konsentrasjoner ble målt ved Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL, USA).
Cellelysater inneholder like mengder totale proteinene ble separert ved SDS-PAGE og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble deretter probet med de angitte antistoffer. Proteiner ble avslørt av SuperSignal West Dura Utvidet Varighet substrat (Thermo). Styrken på proteinbånd ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/).
monoklonale XB130 antistoff ble generert som beskrevet tidligere [7]. Antistoffer for β-aktin, MYC, CEBPG, FOSL1, SCL7A5, DECR1, SETD8 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Anti-PCNA antistoff kom fra Abcam (Toronto, ON, Canada). Anti-Ki-67 (klone Ki-S5) kom fra Cedarlane (Burlington, ON, Canada).
Mikroskopi og Immunofluorescensanalyse
For immunfluorescens farging, celler ble dyrket på glass Dekk pre- behandlet med 50 ug /ml poly-L-lysin. Etter adhesjon ble cellene hurtig fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter og vasket med PBS. Celler ble permeabilisert med 0,1% Triton-X-100 i 10 minutter og blokkert med 1% BSA i 1 time. Objektglassene ble deretter inkubert med primært antistoff mot XB130 i 2 timer, etterfulgt av vasking og inkubering med sekundært antistoff konjugert med Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 1 time. Objektglassene ble også farget for F-aktin med Oregon Grønn 488 Phalloidin (Invitrogen) i 1 time og til kjernen med Hoechst fargestoff 33342 (Invitrogen) i 10 minutter. Dekk ble vasket med PBS og montert på glassplater ved hjelp av Dako fluorescens montering medium (Dako, Mississauga, ON, Canada). Fargingen ble visualisert ved hjelp av en Olympus IX81 mikroskop.
mikroRNA Array og dataanalyse
Fire XB130 shRNA stabilt transfekterte kloner (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) ble anvendt som XB130 knockdown celler. WRO celler og tre negative kontroll shRNA stabilt transfekterte kloner (NC1, NC9 og NC12) ble anvendt for sammenligning. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA). RNA integritet tall bestemt av den Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ble anvendt som et mål på kvaliteten av RNA. MiRNA uttrykket profilering ble utført ved hjelp av menneskelig Agilent miRNA microarray system (Agilent Technologies) med en SurePrint G3 8 × 60 K v16 plattform for 1.205 mennesker mirnas (miRBase slipper 16,0). Kort sagt ble 100 ng total-RNA som er merket med cyanin 3-PCP og hybridisert til oppstillingene ved 55 ° C i 20 timer. Lysbilder ble skannet med en Agilent Technologies Scanner G2505C, og de skannede bildene ble analysert ved hjelp av Agilent Feature Extraction versjon 10.7.3. Differensial uttrykk analyse og hierarkisk klyngeanalyse ble utført ved hjelp GeneSpring GX 11,5 (Agilent Technologies).
Target Prediksjon av miRNAs
TargetScan 6.0 (https://www.targetscan.org/), mikroRNA .org (https://www.microrna.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), og DIANA-mikrotiterplater v4 /TarBase 5.0 (http: //diana.cslab.ece. ntua.gr/DianaTools/) ble brukt til å søke etter forutsagte mål for mirnas.
real-Time Kvantitativ RT-PCR for XB130
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), og cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp av High Capacity cDNA RT kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ RT-PCR for XB130 ble utført ved hjelp av SYBR Grønn Jeg Master PCR kit på LightCycler480 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) i henhold til produsentens protokoll. SDHA ble anvendt som en intern referanse gen for analyser. PCR-primere for XB130 og SDHA er: XB130_forward 5′-AGCACAGCACTGGTGAAGAA-3 «, 5′-XB130_reverse GTTGCTTGTTGATGGTCACT-3′, 5»-SDHA_forward CGGCATTCCCACCAACTAC-3 «og 5′-SDHA_reverse GGCCGGGCACAATCTG-3». Uttrykk for XB130 ble normalisert ved hjelp av to-ΔΔCT metode i forhold til SDHA. Den ΔCt ble beregnet ved å trekke Ct-verdier på SDHA fra Ct verdier av XB130. Ganger endring i genet ble beregnet ved hjelp av ligningen 2-ΔCt [33]. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. Gjennomsnittet av uttrykk for XB130 /SDHA forholdet i WRO celler ble satt til 1, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik av fold av XB130 endringer.
Real-Time Kvantitativ RT-PCR for pri-mirnas og moden mirnas
for å kvantifisere uttrykk for pri-mirnas og modne mirnas, total RNA ble ekstrahert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion). Som for kvantifisering av pri-mirnas ble cDNA syntetisert ved hjelp av High Capacity cDNA RT kit (Applied Biosystems). Real-time PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av en TaqMan® Universal Master Mix II og TaqMan® pri-miRNA Analyser spesifikk for har-mir-33a, har-mir-149 og har-mir-193a-3p på en 7900 sanntid PCR system (Applied Biosystems).
Som for kvantifisering av de modne mirnas, analysene en TaqMan® mikroRNA RT Kit og TaqMan® mikroRNA spesifikk for HSA-MIR-33a, har-MIR-149 og har-speil 193a-3p (Applied Biosystems) ble anvendt for RT-reaksjoner. Real-time PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av en TaqMan® Universal Master Mix II og TaqMan® mikroRNA analyser på en 7900 Real-time PCR system (Applied Biosystems). I begge quantifications ble RUN6B (U6) vurdert som endogen kontroll, og resultatene ble normalisert ved hjelp av to-ΔΔCT metode samme som real-time QRT-PCR for XB130.
Cell Transfeksjon
Dannelse av plasmid av GFP-alene, GFP-merket XB130 (GFP-XB130) og dets N-terminale delesjonsmutant (GFP-XB130ΔN) ble tidligere beskrevet [11]. MRO celler ble transient transfektert bruker 60 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen) på en 100 mm skål som beskrevet i produsentens instruksjoner. Mediet inneholdende plasmid ble erstattet med friskt medium 24 timer etter transfeksjon, og GFP-positive celler ble isolert ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA) 48 timer etter transfeksjon. GFP positive celler ble deretter brukt for vestlige blotting og celleproliferasjonsprosesser analyser.
Mirvana ™ miRNA Mimic av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a og Mirvana ™ miRNA Mimic negativ kontroll # 1 ble oppnådd kommersielt (Ambion ). WRO-celler ble transfektert med 50 pmol MIR ligne anvendelse av 5 ul Lipofektamin 2000 (Invitrogen) på en 6-brønners plate i henhold til produsentens protokoll. Mediet inneholdende plasmid ble erstattet med friskt medium 24 timer etter transfeksjon og total RNA og protein, ble ekstrahert 48 timer etter transfeksjon.
Luciferase Assay Reporter
Seed sekvenser av MIR-33a, MIR -149 og MIR-193a-3p og sammenkobling 3’UTR sekvenser av MYC, FOSL1 og SLC7A5 ble spådd av TargetScan. 3’UTR sekvenser ble klonet nedstrøms til ildflue luciferase av pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor og verifisert ved sekvensering (Promega, Madison, WI, USA). Den pmirGLO konstruere og Mir etterligne eller kontroll Mir ligner ble ko-transfektert inn WRO celler dyrket i 96-brønners plater ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ildflue og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av en Dual luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega). Firefly luciferase ble normalisert til Renilla luciferase aktivitet. Middelverdien av luciferase-aktivitet av Firefly /Renilla-forholdet i WRO celler ko-transfektert med hver av de pmirGLO konstruere og styre MIR ligne ble satt til 1. Data ble uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik av fem uavhengige eksperimenter.
celleproliferasjon og apoptose Analyser
WRO celler ble sådd ut i firemannsrom brønner av 96-brønners mikrotiterplater (100 ul /brønn) i celle proliferasjonsanalyse, i 12-brønners mikrotiterplater (1 ml /brønn) i celle-telling analysen, og i 6-brønns mikrotiterplater (2 ml /brønn) i apoptose-analyse, ved 5 x 10
4 celler /ml og dyrket i 24 timer. Cellene ble så transfektert med miRNA ligne som beskrevet ovenfor.
Celleproliferasjon ble evaluert ved bruk CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) ved hvert tidspunkt (0, 24, 48, og 72 h) etter transfeksjon. Etter å ha erstattet med friskt medium, ble 20 ul av CellTiter 96® vandige løsning reagens tilsatt i hver brønn, og platene ble inkubert ved 37 ° C i 2 timer i en fuktet, 5% CO
2 atmosfære. Absorbansen av prøvene ble avlest ved 490 nm med en automatisk plateleser (Thermo). Bakgrunnen absorbans mellom alene ble trukket. Indeksen proliferasjon ble beregnet som den gjennomsnittlige absorbans av celler ved den angitte tidspunkt dividert med den gjennomsnittlige absorbans av celler ved 0 timer etter transfeksjon, og uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik. I celletall analysen ble cellene løsnet fra kolbene med en trypsin-EDTA-oppløsning og telt ved hjelp av et hemocytometer ved hvert tidspunkt. Celletallet ble uttrykt som middelverdi og standardavvik
I apoptose assay de transfekterte cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon og farget med fluorescein-isotiocyanat-konjugert annexin V og fosfatidylinositol (PI), ved hjelp av Annexin V. – FITC Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) i henhold til produsentens protokoller og analysert av BD AccuriTM C6 Flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, California).
Resultater
Karakterisering av XB130 shRNA stabilt transfekterte WRO Cells
for å studere rollene til XB130 i regulering WRO celle aktiviteter, vi stabilt transfektert cellene med shRNA targeting XB130. Uttrykk for XB130 var betydelig lavere i disse kloner (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) enn at i ikke-transfekterte WRO celler og tre andre kloner stabilt transfektert med en negativ kontroll shRNA (NC1, NC9, NC12), som bestemt ved Western blot (fig. 1A), og ved sanntids kvantitativ RT-PCR (fig. 1B). Ekspresjon av SDHA mRNA ble anvendt som en husholdningsgenet for QRT-PCR (fig. 1B), fordi dets ekspresjon ikke endrer seg under forskjellige eksperimentelle betingelser [10], [34], [35]. Interessant, XB130 knockdown celler viste langstrakt morfologi når undersøkt med fasekontrastmikroskopi. I tillegg immunofluorecence farging viste at ekspresjonen av XB130 i C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11-celler var knapt synlig, og F-aktin-farging viste også langstrakte morfologi på enkeltcellenivå (fig. 1C, fig. S1)
følgende celler ble undersøkt. WRO celler (WRO), negativ kontroll shRNA transfektert WRO celler (NC1, NC9 og NC12) og XB130 shRNA transfektert WRO celler (C3-1, C3-4 , C4-3 og C4-11). (A) XB130 shRNA effektivt redusert XB130 protein nivåer. (B) Sanntids kvantitativ RT-PCR avslørte at ekspresjonen av XB130 mRNA i transfekterte XB130 shRNA WRO celler var vesentlig lavere enn WRO celler (* P 0,05). (C) WRO, NC9 og C3-1 var immun-farget med en XB130 antistoff og kontra for F-aktin og kjerner med Oregon Grønn 488 Phalloidin og Hoechst 33342. Uttrykket av XB130 protein i cytoplasma forsvant i XB130 shRNA transfekterte celler.
mikroRNA Expression profil i XB130 shRNA transfekterte celler
For å identifisere mirnas regulert av XB130, vi utførte miRNA uttrykket profil analysen, ved å sammenligne XB130 shRNA stabilt transfekterte WRO celler (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) med kontroller (WRO, NC1, NC9 og NC12) ved hjelp av en mikroRNA matrise analysen. GeneSpring GX analyse viste at 38 mirnas ble vesentlig endret ved stallen knockdown av XB130 i WRO celler (p-verdi 0,05), hvorav 16 var oppregulert (tabell 1) og 22 ble nedregulert (tabell S1) i XB130 shRNA transfekterte celler.
for å finne mekanismer som XB130 regulerer celleproliferasjon, fokuserte vi på mirnas trykt av XB130 og valgt MIR-33a, MIR-193a-3p og MIR-149 for videre analyse , som har blitt rapportert å vise tumorsupres funksjoner i forskjellige cancere [36] – [38]. Hvis du vil kontrollere effekten av XB130 på MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p, vi kvantifisert nivåer av disse 3 mirnas ved hjelp av real-time QRT-PCR. Både moden miRNA (Fig. 2A) og pri-miRNA (Fig. 2B) nivåer av disse tre mirnas i XB130 shRNA stabilt transfekterte WRO celler (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) var betydelig høyere enn de i de ikke-transfekterte WRO celler eller celler stabilt transfektert med negativ kontroll shRNA (NC1, NC9 og NC12).
de modne former (A) og primær transkripsjoner (B) av MIR-33a, speil 149 og MIR-193a-3p er betydelig høyere i XB130 shRNA transfektert WRO celler (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) enn i WRO (* P 0,05)
Ektopisk XB130 Expression Trykt Primære og Eldre Former MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p
for ytterligere å bekrefte de regulatoriske virkningene av XB130 på uttrykk for MIR-33a, MIR-149, og MIR-193a-3p, vi utførte en «redde» studie på MRO celler, som har svært lav XB130 uttrykk som bestemmes av western blotting. Vi transfektert MRO celler med plasmider som uttrykker GFP-alone, GFP-XB130 eller dets N-terminale sletting mutant, GFP-XB130ΔN. GFP-positive celler ble samlet ved FACS, og ekspresjon av GFP-XB130 og GFP-XB130ΔN proteiner i transfekterte MRO-celler ble påvist ved western blotting (fig. 3A). I motsetning til WRO celler, MRO celler viste signifikant høyere uttrykk nivåer av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p, både modne og ubearbeidde former. XB130-GFP overekspresjon resulterte i en betydelig nedregulering av både modne miRNAs og pri-mirnas, mens overekspresjon av GFP-XB130ΔN ikke lokke fram slike effekter (Fig. 3B og C). Siden den N-terminale ende av XB130 inneholder funksjonelle motivene som kan interagere med Src [7] og p85α subenhet av PI3K [8], er mangelen på effekter av denne mutanten indikerer at den «redde» virkninger av GFP-XB130 kan være relatert til Src og /eller PI3K relaterte mekanismer. Det faktum at både modne og pri-miRNA nivåer ble regulert på lignende måte ved XB130 antydet at XB130 påvirkes disse tre mirnas i det minste delvis på transkripsjonsnivået.
MRO-celler ble transfektert med GFP-vektoren alene, eller GFP-XB130 , GFP-XB130ΔN (XB130 N-terminale sletting mutant). GFP-positive celler ble samlet ved FACS. (A) Western blotting viste at MRO celler uttrykker meget lav XB130. Transfeksjon av GFP-XB130 (MRO-XB130) eller GFP-XB130ΔN (MRO-XB130ΔN) viste XB130 uttrykk i MRO celler. De modne former (B) og primær transkripsjoner (C) av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p ble undersøkt ved real-time kvantitativ RT-PCR. Disse mirnas og pri-mirnas i MRO cellene var betydelig høyere enn den i WRO celler, og betydelig redusert ved overekspresjon av GFP-XB130, men ikke av GFP-XB130ΔN. * P. 0,05 sammenlignet med WRO celler
overekspresjon av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p Redusert nedstrøms Målrettet Proteiner Relatert til Cell Proliferation
tidligere rapportert at i XB130 shRNA stabilt transfektert WRO celler, ble 57 gener knyttet til celleproliferasjon eller overlevelse vesentlig endret, og de fleste av disse genene ble nedregulert av XB130 shRNA [10]. Vi spekulert at blant disse genene, noen er målene for MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p. Ved hjelp TargetScan 6.0, microRNA.org, PicTar, og DIANA-mikrotiterplater v4 /TarBase 5.0, identifiserte vi MYC og CEBPG som kandidater av målgener for MIR-33a, CEBPG og FOSL1 for MIR-149, SLC7A5, DECR1 og SETD8 for speil 193a-3p. For å vurdere hvorvidt disse mirnas faktisk regulerer uttrykket av kandidatens mål, transfektert vi MIR ligne inn WRO celler. Transfeksjon av disse tre mir ligner betydelig økte nivåer av respektive mirnas (fig. 4A), men påvirket ikke XB130 proteinnivåer (Fig. 4B). I sammenligning med WRO celler, proteinnivåer MYC, FOSL1 og SLC7A5 var lavere i XB130 shRNA stabilt transfekterte celler (C3-1 som et eksempel) (Fig. 4C-E). Overekspresjon av MIR-33a resulterte i en reduksjon av MYC protein nivåer (fig. 4C). Tilsvarende overekspresjon av MIR-149 nedregulert FOSL1 protein nivåer (fig. 4D), og overekspresjon av MIR-193-3p nedregulert SCL7A5 protein nivåer (fig. 4E). Den negative kontrollen ligne (Cont-m) påvirket ikke disse tre proteiner (fig. 4C-E). Protein nivåer av CEBPG, DECR1 og SETD8 ble ikke endret ved overekspresjon av disse MIR ligner (data ikke vist).
(A) Transfeksjon av MIR ligner (33a-m, 149 m og 193a-m) signifikant økt respektive miRNA uttrykket, mens kontroll MIR ligne (forts-m) hadde ingen slik effekt, som kvantifisert ved real-time kvantitativ RT-PCR. (B) Western blotting viser at transfeksjon av MIR ligner ikke endret XB130 protein nivåer. (C-E) MYC, FOSL1 og SCL7A5 er spådd målet på MIR-33a, MIR-149 og MIR-193-3p, henholdsvis. Øvre panel viser eksempler på at ekspresjon av det antatte mål-protein ble redusert med respektive MIR ligne trans som bestemt ved Western blotting. Nedre panel viser kvantifisering av uttrykket nivåer av densitometry.
Siden over-uttrykk for GFP-XB130 i MRO celler trykkes uttrykk for MIR-33a, MIR-149, og MIR-193a-3p ( fig. 3A-3B), har vi også testet om det kan senere påvirke deres nedstrøms målrettede proteiner. Western blot viste at sammenlignet med GFP-alone transfekterte MRO celler, GFP-XB130 transfekterte celler viste høyere MYC, FOSL1 og SLC7A5. I sammenligning med GFP-XB130ΔN transfekterte celler, nivået FOSL1 og SLC7A5 var også klart høyere i GFP-XB130 transfekterte celler (fig. S2). Resultatene støttet miRNA etterligne data i WRO celler.
MiR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p direkte rettet bindingssete i 3’UTR av MYC, FOSL1 og SLC7A5, Henholdsvis
Vi brukte deretter pmirGLO Dual-luciferase reporter system for å avgjøre om reduksjon i MYC, FOSL1 og SLC7A5 nivåer ved overekspresjon av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p MIR ligne var gjennom 3’UTR av deres målrettede mRNA. En betydelig komplementaritet ble identifisert ved hjelp av algoritmer i TargetScan mellom sekvenser innenfor frøet regioner av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p og sekvenser i 3’UTR av MYC, FOSL1 og SLC7A5 henholdsvis (fig. 5A ). De pmirGLO konstruksjoner som inneholder et luciferase reporter og 3’UTR av hver av disse 3 genene ble samlet. WRO celler ble ko-transfektert med pmirGLO konstruerer og hver av de MIR etterligner eller en negativ kontroll MIR. Overekspresjon av MIR-33a betydelig redusert luciferase-aktivitet av pmirGLO konstruere med klonede 3’UTR sekvenser av MYC (Fig. 5B). Tilsvarende overekspresjon av MIR-149 og MIR-193-3p betydelig redusert luciferase-aktivitet når cellene ble transfektert med luciferase-konstruksjon inneholdende de 3’UTRs av FOSL1 og SCL7A5 (Fig. 5C og D). Resultatene indikerte at disse 3 mirnas kan påvirke uttrykket av relaterte målgener ved binding til sine 3’UTRs.
(A) Seed sekvenser av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p og sammenkobling 3’UTRs sekvens av MYC, FOSL1 og SLC7A5 som spådd av TargetScan vises. Den pmirGLO konstruere med klonede 3’UTR sekvenser (luc-MYC, luc-FOSL1 og luc-SLC7A5) og Mir etterligne (33a-m, 149 m og 193a-m) eller kontrollere Mir etterligner (forts-m) var ko-transfektert inn i WRO celler. (B) Overuttrykte MIR-33a betydelig redusert luciferase aktivitet av pmirGLO konstruere med klonede 3’UTR sekvenser av MYC (luc-MYC). Tilsvarende overekspresjon av MIR-149 og MIR-193-3p betydelig redusert luciferase aktivitet av luc-FOSL1 (C) og luc-SCL7A5 (D), henholdsvis.
Redusert Cell Proliferation av Overuttrykte av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p
MYC, FOSL1 og SLC7A5 er kjent for å delta i regulering av celledeling. Etter transfeksjon av hver av disse MIR etterligner nedregulert respektive målrettede proteiner, vi deretter undersøkt effekten av disse MIR etterligner på celleproliferasjon. Spredning av WRO celler ble redusert med transfeksjon av MIR ligner av MIR-33a, MIR-149 eller MIR-193a-3p, som bestemmes av MTT analysen (fig. 6A), eller ved celletelling (Fig. 6B), i sammenligning med kontroll MIR ligne transfekterte celler 72 timer etter celle seeding. I tillegg, ekspresjon av celleproliferasjon markører, Ki-67 og PCNA, ble redusert ved hver av disse tre mir etterligner sammenlignet med ikke-transfekterte WRO celler eller celler transfektert med kontroll etterligner (Fig. 6C). På den annen side, overekspresjon av GFP-XB130, og til mindre forlenge av GFP-XB130ΔN øket Ki67 ekspresjon i MRO-celler (fig. S2).
Antallet levedyktige celler ble bestemt ved MTS-analyse (A) og celle-telling (B) ved 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon av styreetterligner (forts-m) og spesifikk MIR etterligner (33a-m, 149-m og 193a-m). Overekspresjon av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p ført til reduksjon i celleproliferasjon. (C) celleproliferasjon markører, Ki-67 og PCNA nivåer, ble også redusert i Mir ligne behandlede celler (33a-m, 149-m og 193a-3p). (D) Apoptose ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av PI /annexin V dobbeltfarging. Overekspresjon av MIR-193a-3A betydelig indusert både tidlig apoptose (annexin V positive /PI negative) og sen apoptose (annexin V /PI dobbel positiv) i WRO celler. *: P 0,05
For å finne ut om det reduserte celle nummer skyldtes apoptose, vi utført flowcytometri med PI /Annexin V dobbel farging.. Annexin V-positive celler representere begynnelsen av apoptose, mens annexin V og PI doble positive celler representerer slutten av apoptose [10]. Overekspresjon av MIR-193a-3a (men ikke andre to mirnas) betydelig fremkalt både tidlig og sent apoptose i WRO celler (fig. 6D). Disse resultatene tyder på at de reduserte celle tall i MIR-33a og Mir-149 etterligner er hovedsakelig på grunn av hemming av celleproliferasjon, mens MIR-193a-3p kan redusere celleproliferasjon og indusere apoptose.
Diskusjoner
i vår forrige undersøkelse, microarray analyse identifisert 246 gener betydelig endret av stabilt slå ned på XB130 i WRO skjoldbruskkjertelen kreftceller. Spesielt, 57 ut av de 246 gener som er beslektet til celleproliferasjon eller overlevelse, inkludert mange transkripsjons regulatorer [10]. Det har blitt anslått at ca 30% av alle humane gener kan reguleres ved mirnas [39]. De endringer i miRNA behandling bidrar til tumorgenese [40]. Derfor hypotese vi at XB130 kan regulere uttrykk for vekstrelaterte mirnas og deretter kontrollere gener relatert til celle spredning og overlevelse. For å vurdere denne hypotesen, analyserte vi miRNA uttrykket i XB130 knockdown WRO celler. MikroRNA rekke analyse av data viste at 38 mirnas ble annerledes uttrykt i XB130 knockdown celler. Blant dem, har vi fokusert på MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p som har blitt rapportert som svulst undertrykkende mirnas i ulike kreftformer. MiR-33a bremser celleproliferasjon virker gjennom hemming av proto-onkogen Pim-1 i lymfom og tykktarm kreft celler [36]. MIR-149 uttrykk har en direkte sammenheng med KCNMA1 og LOX onkogener i klarcellet nyrecellekarsinom [37]. På samme måte er rettet mot MIR-193-3p JNK1 og hemmer cellesyklus progresjon og spredning av brystkreft [38]. Vi validert oppregulering av MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p i XB130 knockdown celler ved real-time QRT-PCR.
I mikroRNA uttrykk prosesser, RNA polymerase II produserer lange primære miRNA transkripsjoner kalt pri-mirnas, som er beskåret og spaltet av en multi-proteinkompleks inkludert drosha og DICER1 å produsere modne funksjonelle mirnas [41]. Hvordan miRNA uttrykket er regulert er fortsatt uklart, men ulike mekanismer har blitt foreslått. Det er vist at p53 var ansvarlig for post-transcriptional modning av MIR-16-1, MIR-143 og MIR-145, mens uttrykk for relaterte pri-mirnas ikke var påvirket av p53 [25]. Som rapportert i fig.
