Abstract
Tumor nekrose faktor-lignende svak inducer av apoptose (tweak, TNFSF12) er et medlem av tumornekrosefaktor super. TWEAK aktiverer Fn14-reseptoren, og kan regulere celledød, overlevelse og proliferasjon i tumorceller. Det er imidlertid lite informasjon om den funksjon og regulering av dette systemet i prostata kreft. Fn14 uttrykk og finpusse handlinger ble studert i to menneskelige prostata kreft cellelinjer, androgen-uavhengig PC-tre cellelinje og androgen-sensitive LNCaP celler. I tillegg ble ekspresjon av Fn14 analysert i humane biopsier av prostatakreft. Fn14 uttrykk er økt i histologiske deler av menneskelige prostata adenokarsinom. Begge prostata kreft cellelinjer uttrykke konstitutivt Fn14, men, androgen-uavhengig cellelinje PC-3 viste høyere nivåer av Fn14 at LNCaP cellene. Fn14 ekspresjon ble oppregulert i PC-3 human prostatacancerceller i nærvær av inflammatoriske cytokiner (TNFa /IFNy), så vel som i nærvær av bovint føtalt serum. TWEAK indusert apoptotisk celledød i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler. Videre, i PC-3 celler, co-stimulering med TNFa /IFNy /TWEAK indusert en høyere rate av apoptose. Men, tweak eller TWEAK /TNFa /IFNy ikke indusere apoptose i nærvær av storfefosterserum. TWEAK-indusert celledød gjennom aktivering av Fn14 reseptoren. Apoptose ble forbundet med aktivering av caspase-3, frigjøring av mitokondrie cytokrom C og en økt Bax /BclxL forholdet. TWEAK /Fn14 sti aktivering fremmer apoptose i androgen-uavhengig PC-3 celler under visse dyrkningsforhold. Ytterligere karakterisering av det terapeutiske målet potensialet i TWEAK /Fn14 for human prostatakreft er hjemlet
Citation. Sanz AB, Sanchez-Niño MD, Carrasco S, Manzarbeitia F, Ruiz-Andres O, Selgas R, et al . (2012) inflammatoriske cytokiner og overlevelse faktorer fra Serum modulere Tweak apoptose i PC-3 prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (10): e47440. doi: 10,1371 /journal.pone.0047440
Redaktør: Daniel Sanchis, Universitat de Lleida – IRBLLEIDA, Spania
mottatt: 20 juni 2012; Godkjent: 17 september 2012; Publisert: 15 oktober 2012
Copyright: © Sanz et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte fra Fondo de Investigacion Sanitaria (FIS) PS09 /00 447, Instituto de Salud Carlos III-Redes Temáticas de INVESTIGACION Cooperativa en Salud (ISCIII-Retic-) REDinREN /RD06 /0016. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn [1]. De fleste tilfeller av prostatakreft tilstede som lokalisert sykdom, og kan herdes med kirurgi og strålebehandling. Men som er til stede med de fleste faste kreftformer, er utviklingen av metastatisk sykdom slutt dødelig. Til tross for aktiv systemisk behandling, vil metastatisk fenotype kjøre i utvikling av resistens og sykdomsutvikling. Videre systemiske behandlinger i prostata kreft er begrenset. Inntil nylig var det bare tre FDA-godkjente kjemoterapeutiske midler til bruk i kastrering resistent prostatakreft (estramustin, mitoksantron, og docetaxel) og to ekstra midler ble godkjent i 2010 (sipuleucel-T og cabazitaxel [2]. Men det er fremdeles et klart behov for å utvikle ytterligere systemisk behandling. veksten av normal prostata epitelceller er under streng kontroll av forskjellige vekstfaktorer, særlig androgener, medfører kastrering til apoptose av denne cellepopulasjon. androgen-uttømming har en lignende effekt på prostatakreft . Men følgende start regresjon svulster ofte tilbake på et androgen-uttømming uavhengig form som er ofte dødelig. Dermed er det av spesiell interesse for å søke etter midler i stand til å drepe androgen-uavhengig prostatakreftceller.
tumor nekrose faktor (TNF) ble opprinnelig beskrevet som en faktor giftig for tumorer [3], [4]. det ble senere vist å tilhøre TNF-superfamilien (TNFSF) av cytokiner [5], [6]. Mange TNFSF cytokiner regulere celledød og proliferasjon, samt betennelse, og kan ha en rolle i tumorbiologi, inkludert sykdomsutviklingen [7] – [9]. Som et eksempel, har nyere oppmerksomheten fokusert på anti-tumor aktivitet av TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) [10], [11]. Men in vivo prostatakreft uttrykke osteoprotegerin, en lokkedue reseptor for både TRAIL og aktivator av kjernefysiske faktor-kB ligand (RANKL) [12]. TNFSF cytokiner aktivere en familie av reseptorer (TNFRSF) hvorav mange bærer en død domene (DD) og fungere som dødsreseptorer. Aktivering av døds reseptorer i tumorceller ved cytotoksiske immunceller er hovedmekanismen ved hvilken immunsystemet eliminerer maligne celler [13].
Tumor necrosis factor-like svak induktor av apoptose (TWEAK, Apo3L, TNFSF12) er en av de nyeste medlemmene av TNFSF som skal identifiseres [14], [15]. TWEAK ble opprinnelig beskrevet som induserer apoptose i tumorceller. I tillegg kan TWEAK regulere celleproliferasjon, celledød, cellemigrering, celledifferensiering, vev regenerering, neoangiogenesis og inflammasjon [16] – [24]. TWEAK aktiverer en enkelt reseptor, fibroblast vekstfaktor-induserbar-14 (Fn14, TWEAK-reseptoren, TNFRSF12A, CD266). TWEAK aktivering av Fn14 reseptoren resulterer i apoptotisk celledød av flere tumorcellelinjer [22], [25] – [29]. Faktisk, en fase I klinisk studie av en humanisert anti-TWEAK reseptor monoklonalt antistoff hos pasienter med langtkomne solide tumorer ble nylig avsluttet [30]. Imidlertid TWEAK-Fn14 oppregulerer VEGF ekspresjon for å fremme ovarian cancer cell metastase [31] og fremmer brystkreftcelle invasiv kapasitet [32]. Det er dokumentert at de forskjellige, selv motsatte, handlinger av TWEAK kunne bestemmes av mikromiljøet. I denne forbindelse induserer apoptose i TWEAK tubulære celler i et pro-inflammatorisk miljø, mens, det fremmer proliferasjon i nærvær av føtalt bovint serum [33], [34]. Prostata kreftceller er blitt vist å uttrykke Fn14 og høy ekspresjon av Fn14 var signifikant assosiert med høyere prostata-spesifikt antigen tilbakefall i pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi [35]. Fn14 ble sterkt uttrykt i androgen-uavhengig prostatakreft cellelinjer, DU145 og PC-3, mens uttrykk var svak i androgen-sensitive LNCaP celler. En rolle for Fn14 i migrasjon, invasjon og spredning ble beskrevet i PC-3 celler [35].
Vi har nå utforske manipulering av celledyrkningsforhold som et potensielt verktøy for å slå av TWEAK /Fn14 system mot de svulst. Vi rapporterer at de inflammatoriske cytokiner og overlevelsesfaktor fra serum modulere responsen fra PC-3 celler til å finpusse. I fravær av serum TWEAK /Fn14 sti aktivering fremmer apoptose i androgen-uavhengig PC-3-celler, men ikke i androgen-følsomme LNCaP-celler. En bedre forståelse av denne forskrift kan snu en potensiell fordel av tumorceller i en terapeutisk mulighet.
Prostata adenokarsinom Gleason score 7 (3 + 4). Original forstørrelse × 200. Fn14 farging er svært positiv i klasse 3 adenokarsinom (svarte piler) og mildt positive i en høyverdig PIN fokus (hvit pil). Ingen eller lite farging observert i normal kjertel (pilspisser). B) Detalj av adenokarcinomceller fra samme biopsi. Original forstørrelse × 400. C) Prostata adenokarsinom Gleason score 6 (3 + 3). Mild Fn14 flekker i høyverdig klasse PIN fokus (hvit pil), mens normalt vev er negativ (pilspiss). Original forstørrelse × 200. D) Fn14 farging er svært positiv i klasse 3 adenokarsinom (svarte piler), mens normalt vev er negative (pilspisser). Original forstørrelse × 200
Metoder
Cells og reagenser
To menneskelige prostata kreft cellelinjer ble brukt. Androgen-uavhengig PC-tre cellelinje og androgen -sensitive LNCaP-celler (ATCC, Rockville, MD, CRL 1435 og 1740, henholdsvis) [36], [37]. Celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) i 5% CO2 ved 37 ° C. RPMI-1640, penicillin, streptomycin og trypsin-EDTA var fra BioWhittaker (Waltham, MA) og FBS fra Gibco (Carlsbad, CA). For eksperimentene ble cellene i serum-utarmet i 24 timer, og deretter behandlet med forskjellige stimuli. Som positiv kontroll av Fn14 uttrykk menneskelig proksimale tubulære epitel (HK-2) celler (ATCC, CRL 2190) ble brukt [38].
A) Analyse av Fn14 og TWEAK mRNA uttrykk av kvantitativ RT-PCR. Midlere (± SEM) fra tre uavhengige eksperimenter; * P 0,05 vs LNCaP celler. B) Analyse av Fn14 proteinekspresjon ved western blot i humane prostata kreftceller dyrket med eller uten 10% FBS i 24 timer. Gjennomsnittlig (± SEM) fra tre uavhengige eksperimenter * p. 0,02 vs LNCaP celler.
† p 0,05 vs. 0% FBS PC-3 celler. HK2 celler er vist som positiv kontroll. C) Analyse av celleoverflate-ekspresjon av Fn14 ved strømningscytometri. Representant eksperiment. Cellene ble farget med en isotype-matchet antistoff (hvitt område) eller anti-Fn14 antistoff (svart område).
Rekombinant human TWEAK (Millipore, Billerica, MA), med mindre annet er spesifisert, ble brukt på 100 ng /ml. SAK-2 nøytraliserende anti-Fn14 antistoff (eBioscience, San Diego, CA), nøytraliserende anti-TWEAK antistoff (BioLegend, San Diego, California) og nøytraliserende anti-TNF-antistoff (BioLegend) tilsatt en time før stimuli. Human TNFa (PrePotech, London, UK) ved 30 ng /ml, og human interferon-γ (IFNy) (PrePotech) 30 U /ml, ble anvendt i noen eksperimenter. Alle disse konsentrasjoner er basert på tidligere doseresponsstudier utført i vårt laboratorium [33], [34]. Benzyloksykarbonyl-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone (zVAD-FMK) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) ble oppløst i DMSO og tilsatt 1 time før stimuli. Sluttkonsentrasjonen av DMSO i kultur ikke modulerer celledød. Bax inhibitor peptid, P5, ble oppløst i vann og ble tilsatt en time før stimuli (Tocris, Bristol, UK) [38].
PC3 og LNCaP-celler ble stimulert med 100 ng /mL TWEAK for den indikerte punkter, og Fn14 og MCP-1 mRNA-nivåer ble målt ved hjelp av RT-PCR. Begge cellelinjer svare på tweak, men PC-tre svar er mer varig enn LNCaP celler. Gjennomsnittlig (± SEM) fra tre uavhengige eksperimenter * p .. 0,05 vs kontroll
Cell Surface Fn14 Expression
Celler ble sådd ut i en tetthet på 8 x 10
4 celler i tolv-brønners plater. Etter stimulering ble de frittliggende med 2 mM EDTA /1% BSA i PBS, vasket og resuspendert i PBS /1% BSA og blokkert i 4 min. Da celler ble inkubert med 1 pg /ml anti-Fn14 ITEM4 antistoff (eBioscience, San Diego, CA), eller et isotype-matchet kontrollantistoff i 30 minutter på is. Cellene ble vasket to ganger, blokkert i 4 minutter og inkubert med Alexa488-merket geit anti-mus IgG-antistoff (1/300, Invitrogen, Carlsbad, CA) i 45 minutter på is i mørket. Etter ytterligere to vasker med PBS /1% BSA ble cellene resuspendert i 1% filtrert paraformaldehyde i PBS og analysert ved flowcytometri å bruke BD Cellquest programvare (BD Biosciences, San Jose, California) [39].
PC -3 prostatakreftceller ble dyrket med 0% eller 5% FBS i 3 eller 24 timer. Fn14 mRNA-ekspresjon ble målt med kvantitativ RT-PCR (A) og Fn14 protein-ekspresjon ble undersøkt ved Western blot (B). Midlere (± SEM) fra fire uavhengige eksperimenter. * P 0,03 versus 0% FBS 3t; # P 0,003 vs 0% FBS 24 timer. C, D) Analyse av Fn14 mRNA ekspresjon (C), og Fn14 protein uttrykk (D) i PC-3-celler behandlet med TNFa (30 ng /ml) /IFNy (30 U /ml) i 3 eller 24 timer. Gjennomsnittlig (± SEM.) Av fire uavhengige forsøk. # P 0,03 vs kontroll 24 timer. E) Representant Western blot av Fn14 i PC-3 celler dyrket med 0% FBS, 5% FBS eller TNF-alfa /IFNy for 3 og 24 timer.
RNA Utvinning og Real-Time Polymerase Chain Reaction
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved TRI Reagens metode (Sigma) og 1 mikrogram av RNA ble revers transkribert med høy kapasitet cDNA Arkiv Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Pre-utviklet primer og sonde analyser for Fn14, og GAPDH (human) var fra Applied (Applied Biosystems). Kvantitativ PCR ble utført av 7500 Real Time PCR System med Prism 7000 System SDS programvare (Applied Biosystems) og RNA uttrykk for ulike gener ble korrigert for GAPDH [40].
Celledød ble vurdert ved flowcytometri av DNA innhold. Hypodiploid celler ble ansett apoptotiske. A) PC-3-celler, dyrket med eller uten 10% FBS, ble stimulert med TWEAK (100 ng /ml) alene eller i nærvær av TNFa (30 ng /ml) /IFNy (30 U /ml) i 24 timer. Mean (± SD) av fire uavhengige forsøk. * P 0,002 vs kontroll; # P 0,001 vs TWEAK alene; † p 0,002 vs. 0% FBS med stimuli. B) LNCaP-celler dyrket uten FBS, ble stimulert med TWEAK alene eller i kombinasjon med TNFa /IFNy i 24 timer. Mean (± SD) av tre uavhengige forsøk. C) TWEAK, alene eller i kombinasjon med TNFa /IFNy, induserer apoptose i PC-3-celler på en doseavhengig måte. Mean (± SD) av tre uavhengige forsøk. * P 0,002 vs kontroll; # P 0,0001 vs kontroll. D) Tids løpet av TWEAK-indusert apoptose i PC-3-celler, alene eller i kombinasjon med TNFa /IFNy. Mean (± SD) av tre uavhengige forsøk. * P 0,002 vs kontroll; # P 0,0001 vs kontroll
Western Blot
Celleprøver ble homogenisert i lyseringsbuffer (50 mM TrisHCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,2%. Triton X-100, 0,3% NP-40, 0,1 mM PMSF og 1 ug /ml pepstatin A) og deretter separert ved 12% SDS-PAGE under reduserende betingelser. Etter elektroforese, ble prøver overført til PVDF-membraner (Millipore), blokkert med 5% skummet melk i PBS /0,5% volum /volum Tween 20 i 1 time, vasket med PBS /Tween og inkubert med kanin polyklonalt anti-Fn14 (1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA), mus monoklonalt anti-BclxL (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin polyklonale anti-Bax (1:500, Santa Cruz Biotechnology), eller kanin polyklonale anti- kløyvet aktiv caspase 3 (1:500, Cell Signaling). Anti-Fn14 ble fortynnet i 5% BSA og de andre antistoffer ble fortynnet i 5% melk PBS /Tween. Blottene ble vasket med PBS /Tween og inkubert med passende pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:2000, Amersham, Aylesbury, UK). Etter vasking med PBS /Tween Blottene ble utviklet med det kjemiluminescens-metoden (ECL) (Amersham). Blottene ble deretter undersøkt med monoklonalt anti-α-tubulin antistoff (1:2000, Sigma) og nivåer av uttrykk ble korrigert for mindre forskjeller i lasting [41].
Celledød ble vurdert ved flowcytometri av DNA innhold. A) PC-3-celler ble forbehandlet med anti-TWEAK-nøytraliserende antistoff (10 ug /ml), ITEM2 anti-Fn14 antistoff (10 ug /ml), eller anti-TNFa-nøytraliserende antistoff (10 ug /ml), tilsatt 1 time før TWEAK. Celledød ble vurdert til 24 timer. Mean (± SD) av tre uavhengige forsøk. * P 0,02 vs kontroll; # P 0,0001 vs TWEAK alene. B), C) PC-3-celler ble for-behandlet med anti-TWEAK-nøytraliserende antistoff (B) eller med ITEM2 anti-Fn14 antistoff (C), tilsatt 1 time før TWEAK /TNFa /IFNy. Celledød ble vurdert til 24 timer. Mean (± SD) av tre uavhengige forsøk. * P 0,02 vs kontroll; # P. 0,0001 vs TWEAK /TNFa /IFNy alene
apoptose og celledød
10000 celler ble sådd i 12-brønners plater (Costar, Cambridge, MA) i 10% FCS RPMI over natten. I noen tilfeller ble de hvilte i serumfritt medium for 24 timer. Deretter stimuli ble tilsatt til Subkonfluente celler. Apoptose ble preget av morfologiske og funksjonelle kriterier. Nuclei fra formalin-fikserte celler ble farvet med DAPI (Sigma) for å observere de typiske morfologiske endringer, som tidligere beskrevet [33], [42]. For vurdering av apoptose ved flowcytometri adherente celler ble slått sammen med spontant frittliggende celler og inkubert i 100 ug /ml propidiumjodid (PI), 0,05% NP-40, 10 ug /ml RNase A i PBS ved 4 ° C i 1 time. Denne analysen permeabilizes cellene, og dermed PI flekker både levende og døde celler. Prosentandelen av apoptotiske celler med redusert DNA-farging (hypodiploid celler) ble tellet ved hjelp av strømningscytometri BD Cellquest-programvare (BD Biosciences) [33], [34], [42].
Strømningscytometri av DNA-innhold. Merk hypodiploid, apoptotiske celler (
