Abstract
Svulster mangelfull i uttrykket for transporter i forbindelse med antigen prosessering (TAP) vanligvis ikke klarer å indusere T-celle-mediert immunitet, og er motstandsdyktige mot T-cellelyse. Vi har imidlertid funnet at innføring av B7.1-gen inn i TAP-negative (TAP
-) eller TAP1-transfektert (TAP1
+) murin-lungekarsinom CMT.64 celler kan øke kapasiteten av cellene til indusere en beskyttende immunrespons mot villtype-tumorceller. Det ble ikke observert forskjeller i styrken på de beskyttende immunresponser mellom TAP
– og TAP1
+ B7.1 uttrykker CMT.64 celler avhengig av doser av γ-bestrålt celle immunisering. Mens mus immunisert med enten høy eller lav dose av B7.1-uttrykke TAP1
+ celler avvist TAP
– svulster, høy dose immunisering med B7.1-uttrykker TAP
– celler resulterte i tumor avvisning. Den induserte beskyttende immunitet ble T-celleavhengig som vist ved sterkt redusert antitumorimmunitet hos mus utarmet på CD8 eller CD4 celler. Økning av T-cellemediert immunrespons mot TAP
– tumorceller ble også observert i en virusinfiserte tumorcellesystem. Når mus ble immunisert med en høy dose av y-bestrålte CMT.64 celler infisert med vaccinia-virus som bærer B7.1 og /eller TAP1-gener, har vi funnet at cellene ko-uttrykker B7.1 og TAP1, men ikke de som uttrykker B7. 1 alene, indusert beskyttende immunitet mot CMT.64 celler. I tillegg inokulering med levende tumorceller transfektert med flere forskjellige gen (er) viste at bare B7.1- og TAP1-coexpressing tumorceller betydelig redusert tumorgenisitet. Disse resultatene indikerer at B7.1-provosert antitumor immunitet mot TAP
– kreft er tilrettelagt av TAP1-uttrykk, og dermed begge genene bør vurderes for kreftbehandling i fremtiden
Citation. Li XL, Liu YY, Knight D, Odaka Y, Mathis JM, Shi R, et al. (2009) Effekt av B7.1 kostimulering på T-Cell Basert Immunitet mot TAP-Negative Kreft kan forenkles ved TAP1 Expression. PLoS ONE 4 (7): e6385. doi: 10,1371 /journal.pone.0006385
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA
mottatt: 24 mars 2009; Godkjent: 18 juni 2009; Publisert: 24.07.2009
Copyright: © 2009 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Louisiana Board of Regents, Feist-WEILLER Cancer Center, Louisiana State Gene Therapy Program og Institutt for Cellular Biology Anatomy på LSU Health Sciences Senter-Shreveport. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Qian Jin Zhang eier aksjer fra TAPIMMUNE INC Xiao-Lin Li ble delvis støttet hennes lønn ved TAPImmune Inc gjennom university of British Columbia, Canada fire år siden, da hun jobbet i university of British Columbia, Canada. Nåværende arbeid har ingen støtte fra dette selskapet.
Innledning
En effektiv strategi mot kreft er dannelse av CD8
+ T-celle immunitet [1]. Imidlertid tumorer som mangler store histokompatibilitetskompleks klasse I (MHC-I) antigenpresentasjon ofte unngå immun-mediert ødeleggelse [2], [3],. Mangel på TAP uttrykk er ofte observert i menneskelige kreft [2], [3]. TAP er sammensatt av TAP1 og TAP2 subenheter hvis funksjon er å transportere cytosoliske generert peptider inn i lumen av det endoplasmatiske retikulum (ER) for MHC-I-binding, etterfulgt av transport av MHC-I /peptid-komplekser til celleoverflaten. Mangel på TAP ekspresjon (en eller begge subenheter) i tumorceller vanligvis inhiberer ekspresjon av TAP-avhengige peptidantigener på celleoverflaten, noe som resulterer i svikt av CD8
+ T-celle-gjenkjennelse.
Selv om presentasjon av TAP-avhengige peptid antigener er begrenset, TAP-mangel cellene er i stand til å presentere TAP-uavhengige antigener. For eksempel mus T-lymfom RMA-S-celler som uttrykker bare TAP1 [6] og menneskelige T- og B hybrid T2 celler som mangler både TAP1 og TAP2 gener [7] kan presentere noen MHC-I begrenset TAP-uavhengig antigener avledet fra proteiner lokalisert i eller utenfor ER lumen [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Ulike kapasiteter for antigen presentasjon er også observert mellom TAP-negative og TAP1-positive tumorceller. Gabathuler, R et al. rapporterer at innføringen av TAP1 genet i TAP-negative tumorceller, endres modusen for antigenpresentasjon til likne den som TAP1-positive RMA-S-celler, som angitt ved det faktum at et virusavledet antigen kan effektivt presentert på overflaten av TAP1-possitive men ikke TAP-negative tumorceller [14]. Selv om TAP-uavhengige antigener kan bli presentert av TAP1-positive eller TAP-negative tumorceller, unnlatelse av cellene til effektivt indusere en stor bestand av tumor-antigen spesifikke CD8
+ T-celle effektorer kan være en viktig grunn til å begrense effekten av antitumor immunitet. Slik antitumorimmunitet kan utvides ved å innføre en B7.1-gen inn i TAP-mangeltumorceller som rapporter indikert [13], [15].
B7.1 er et kostimulerende molekyl som interagerer med CD28 på T-lymfocytter og spiller en viktig rolle i immun induksjon. Svulster transdusert med B7.1 kan fremkalle CD8
+ T-celleavhengige responser antitumor [16], [17], [18]. Spesielt B7.1 transfektert TAP1-uttrykk RMA-S-celler kan fremkalle T-cellekloner som reagerer med TAP1 eller TAP2 mangelfull tumorceller, men ikke med TAP-kompetente tumorceller [13]. Et slikt T-celleklon gjenkjenner en ER-lokalisert-Lass5-protein-avledede antigen som er presentert utelukkende av RMA-S og andre TAP1 eller TAP2 manglende celler og beskytter mus fra RMA-S tumor utfordring [13]. Disse studiene gir nyttig informasjon om grunning av T-celle basert immunitet mot kreftimmunrømnings varianter i kreft immunterapi. Men i mange tilfeller, oppviser human cancer en TAP-negativ fenotype, og dermed er det uklart om B7.1-ekspresjon i disse tumorceller kan fremkalle beskyttende T-celle immunitet eller hvorvidt ekspresjon av både B7.1 og TAP1 gener er nødvendig for å generere en slik immunitet.
i denne studien vi brukte et murint lungekarsinom CMT.64-cellelinje som en modell cellesystem for å løse dette spørsmålet. De CMT.64 cellene er defekt i både TAP1 og TAP2 ved transkripsjonelle og translasjonelle nivåer og uttrykker lave nivåer av MHC-I molekyler [14], [19]. Vi transfekterte de CMT.64 celler med enten B7.1-gen alene eller B7.1 sammen med mus TAP1 gener, og fant at transfektanter indusert forskjellige antitumorimmunresponser. B7.1 og TAP1 co-uttrykk i tumorceller reduseres betraktelig deres tumorigenicity mens B7.1 uttrykk alene i cellene har ingen endring. Men begge B7.1-uttrykkende og B7.1 og TAP1 co-uttrykkende celler dramatisk økt kapasitet for generering av beskyttende immunitet ved den høye dose av tumor immunisering. Ved den lave dosen av tumor immuniseringen, bare B7.1 og TAP1 co-uttrykkende celler tilgjengelig beskyttende immunitet. Disse resultatene tyder på at B7.1 og TAP1 co-uttrykk i tumorceller er viktig for T-celle grunning.
Resultater
B7.1 og TAP1 uttrykk reduserer tumorigenicity av TAP-mangel CMT. 64 celler bare i T-celle kompetente mus
for å evaluere effekten av B7.1 uttrykk på TAP1-positive og TAP-negative tumorceller på antitumor immunitet, vi først analysert uttrykk av introduserte gener i CMT.64 transfektanter. CMT.64 /pp, CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p, CMT.TAP1 /B7.1 og CMT.TAP1,2 cl.21 celler ble transfektert med to tomme vektorer, B7.1 + tom vektor henholdsvis TAP1 + tom vektor, TAP1 + B7.1 eller TAP1 + TAP2, (se Materiale og Metoder for detaljer). Etter medikamentseleksjon, transfektantene uttrykte det relevante gen (e), bortsett fra en CMT.64 /pp-transfektant som ikke viser TAP1, TAP2 eller B7.1 uttrykket (Fig.1A og 1B). Genekspresjon var stabil i løpet av studietiden. K
b og d
b uttrykk i de fleste transfektantene var lik villtype CMT.64 celler, med unntak av CMT.TAP1,2 cl.21-celler som uttrykte K
b og d
b molekyler ved nivåer høyere enn det som uttrykkes i de andre (fig. 1C).
TAP, B7.1, K
b og D
b uttrykk i CMT.64 transfektanter ble bestemt. A) TAP1 og TAP2 proteiner ble påvist i CMT.64 transfektanter og kontroll RMA celler ved Western blot som bruker henholdsvis anti-TAP1 og TAP2 polyklonale antistoffer (se Materiale og metode). Nivåer av ekspresjon av GAPDH-protein ble påvist i hver prøve som laste kontroll. B) B7.1-ekspresjon i CMT.B7.1 /p og CMT.TAP1 /B7.1-celler ble påvist ved FACS-analyser ved anvendelse av FITC-konjugert B7.1-spesifikke mAb 16-10A1. Kontroll er CMT.64 celler farget med mAb 16-10A1. C) K
b eller D
b uttrykk ble oppdaget av FACS analyser ved hjelp av primær mAbs Y-3 mot H-2K
b eller 28-14-8S mot H-2D
b fulgt av farging med et FITC-konjugert geite-anti-mus IgG sekundært Ab. CMT.64 celler farget med et primært mAb 15-5-5S (mot H-2D
k) etterfulgt av farging med en FITC-konjugert geit anti-mus IgG sekundært Ab ble anvendt som en negativ kontroll. a: negativ kontroll; b: CMT.64; c: CMT.64 /pp; d: CMT.B7.1 /p; e: CMT.TAP1 /p; f: CMT.TAP1 /B7.1; og g. CMT.TAP1,2 cl.21
For å vurdere om B7.1 uttrykk i tumorceller kan redusere tumorigenicity, ble C57BL /6 mus injisert med live CMT.64 celler eller transfektanter og overlevelse og /eller tider ble registrert. Resultatene er vist i fig. 2A. Alle mus injisert intraperitonealt med CMT.64 eller CMT.64 /pp celler (2 kontrollgrupper) døde før dag 27 etter tumorcelle vaksinasjon. I kontrast med to kontroller, CMT.TAP1 /B7.1 bærende mus viste en svært signifikant overlevelsesrate (P«0.05), selv sammenlignet med alle andre muse grupper (P«0.05). På dag 100, 30% av musene var fremdeles i live. Imidlertid CMT.B7.1 /p-bærende mus viste ingen signifikant forskjell, sammenlignet med to kontrollgrupper (P 0,05). CMT.TAP1 /p-bærende mus viste signifikant overlevelsestiden i forhold til de to kontrollene (P 0,05), men ingen forskjell fra CMT.B7.1 /p-bærende mus (P 0,05). Resultatene av dette eksperiment viser at en betydelig reduksjon i tumordannelse er mediert ved ekspresjon av B7.1 sammen med TAP1 molekyler i CMT.64 tumorceller.
Tiden for sykelighet ble registrert for mus (hver gruppe, n = 10) inokulert med levende tumorceller eller immunisert med y-bestrålte celler og etterfulgt av utfordring med CMT.64 celler. Statistikk for mus overlevelse ble oppnådd ved bruk av Kaplan-Meier log rank overlevelse test og forskjeller ble betraktet som signifikant ved P 0,05. A) tumordannelse ble påvist ved injeksjon av C57BL /6 mus i.p. med live CMT.64 celler eller deres transfektanter (5 × 10
4 celler per mus). B) Nakne mus ble benyttet for bestemmelse av tumorgenisitet med betingelsene for tumorinjeksjon den samme som vist i A), P 0,05 for alle sammenligninger. C) C57BL /6 mus ble immunisert i.p. med forskjellige y-bestrålte tumorceller eller PBS ved en høy dose (venstre, 5 x 10
6 celler per mus) eller en lav dose (til høyre, 5 x 10
5 celler per mus). Etter en 20-dagers immunisering ble musene utfordret i.p. med live CMT.64 tumorceller (2,5 × 10
5 celler per mus). Ulike overlevelse og /eller tider ble observert.
For å finne ut om redusert tumorigenicity av CMT.TAP1 /B7.1 celler ble mediert av T-celler, nakne mus ble inokulert med CMT.64 celler eller transfektanter og overlevelse ble bestemt. Figur 2B viser at alle musene døde i 25-27 dager, noe som tyder på at T-cellene spilt en vesentlig rolle i immunresponsen mot CMT.TAP1 /B7.1-celler, noe som resulterer i en reduksjon i tumorgenisitet.
CMT. B7.1 /p-immunisering ved høy dose induserer en immunrespons så effektiv som CMTTAP1 /B7.1-immunisering men er mindre effektiv med en lav dose
Antitumor immunresponser kan utvides ved B7.1- uttrykkende tumorcelle immunisering [16], [17], [18]. For å vurdere om beskyttende immunitet mot TAP-negative tumorceller kan genereres ved immunisering med enten TAP1-uttrykke CMT.TAP1 /B7.1 celler eller TAP-negative CMT.B7.1 /p celler, ble C57BL /6 mus immunisert med forskjellig mengder av y-bestrålte celler, etterfulgt av utfordring med CMT.64 celler. Kontroll mus ble immunisert med y-bestrålte CMT.64 /pp-celler. Resultatene tyder på en doseavhengig beskyttelse. Ved høy dose av immunisering (5 × 10
6 celler per mus), både CMT.TAP1 /B7.1-vaksinert og CMT.B7.1 /p-immuniserte mus ble godt beskyttet fra levende svulst angrep (fig. 2C venstre panel). De to musegruppene viste en meget signifikant overlevelse (100% overlevende), sammenlignet med CMT.TAP1 /p-immuniserte mus gruppe (60% overlevende, p 0,05). Den siste gruppen viste en overlevelse betydelig høyere enn en kontrollgruppe immunisert med TAP-negative CMT.64 /pp celler (P«0.05). Men ved lav dose av immunisering (5 × 10
5 celler per mus), CMT.TAP1 /B7.1-immuniserte mus hadde en overlevelsesrate høyere enn CMT.B7.1 /p-immuniserte mus (Fig. 2C høyre panel, P 0,05). Det ble ikke observert forskjell i overlevelse mellom CMT.B7.1 /p-vaksinert og CMT.TAP1 /p-immuniserte mus (P 0,05). Resultatene tyder på at ved høy dose av immunisering, B7.1 og TAP1 co-uttrykk eller B7.1 uttrykk alene gjør kreftceller potente immunogener, mens ved lav dose vaksiner, krever potent immunogenisitet tumorceller co-uttrykker både TAP1 og B7.1 molekyler.
CD8
+ T-celler spiller en viktig rolle i musebeskyttelses
For å finne ut om økt beskyttelse etter B7.1-uttrykke svulst immunisering ble formidlet av en T-celle basert immunrespons, brukte vi mAbs å utarme CD8
+ eller CD4
+ T-celler i C57BL /6 mus før immunisering og tumorcelle utfordring. Mus injisert intraperitonealt med relevant mAb annenhver dag den første uken ble analysert ved FACS analyser for CD8
+ eller CD4
+ T-cellepopulasjonen i blod. Resultatene viste at behandling dramatisk redusert CD8
+ T-celle eller CD4
+ T-cellepopulasjon (Fig. 3A). Anti-CD8 mAb spesifikk behandling redusert CD8
+ T-celler fra 17,66% til 0,65%, og anti-CD4-mAb spesifikk behandling redusert CD4
+ T-celler fra 19,22% til 0,11%. T-celle-subpopulasjon utarmet mus ble injisert med y-bestrålte CMT.64 transfektanter, etterfulgt av utfordring med levende CMT.64 celler. Overlevelses Resultatene er vist i fig. 3B. Den anti-CD8 mAb spesifikk behandling signifikant redusert overlevelse av tumorbærende mus. Det var ingen biologisk signifikant forskjell mellom hver testet-gruppe og kontrollgruppen (CMT.64 /pp-immuniserte mus). I tillegg er anti-CD4-mAb spesifikk behandling delvis redusert overlevelse av hver testet-gruppe, sammenlignet med kontrollgruppen (P«0.05). Resultatene indikerer at beskyttelse av mus fra utfordring tumor fullstendig avhengig av CD8
+ T-celler og delvis avhengig av CD4
+ T-celler.
Mus (hver gruppe, n = 10) ble injisert i.p. med mAbs GK1.5 for CD4
+ T-celler eller 2,43 for CD8
+ T-celler (0,1 ml per mus) annenhver dag den første uken og en gang per uke etterpå for å utarme relevant T-celle sub-populasjon . A) Før γ-bestrålte tumorcelle immunisering, fjerning av CD8
+ eller CD4
+ T-celleundersett ble vurdert i blod ved FACS-analyser ved anvendelse av FITC-konjugert anti-mus CD8a (5H1-1) eller FITC-konjugert anti-mus CD4 (RM4-4) sammen med PE /Cy5-konjugert anti-muse-CD3 (145-2C11). Frekvenser av CD8
+ eller CD4
+ T-celler ble oppdaget før mAb behandling (angitt som vanlig), og etter første uke mAb behandling og før γ-bestrålte tumorcelle immunisering (angitt som mAb-behandling). B) Etter en 20-dagers immunisering med y-bestrålte tumorceller (5 × 10
6 celler per mus) ble musene utfordret i.p. med live CMT.64 tumorceller (2,5 × 10
5 celler per mus). Tidspunktet for sykelighet ble registrert.
Presentasjon av TAP-uavhengig Lass5 antigen av TAP-mangeltumorceller
Det faktum at TAP-mangel B7.1-uttrykke tumorceller kan generere en CD8
+ T-cellemediert immunrespons mot TAP-negative tumorceller tyder på at tumorceller foreliggende TAP-uavhengig antigen (er) for T-celle-grunning. For å finne ut om dette er sant, vi fokusert på D
b-begrenset Lass5 epitop MCLRMTAVM, et antigen presentert av mange TAP-mangel celler [13]. CMT.64 og CMT.TAP1,2 cl.21 celler uttrykker Lass5 genet som indikert av real-time PCR (Fig. 4A venstre). Men TAP-negative og TAP1-transfektert CMT.64 celler, men ikke TAP-kompetent CMT.TAP1,2 cl.21 celler ble drept av en T-cellepopulasjon som genereres av immunisering med Lass5 peptid pulsert RMA-S /B7.1 celler som bestemt ved en langvarig (12-16 timer)
51Cr-frigjøringsanalyse (fig. 4A til høyre). De TAP-kompetent CMT.TAP1,2 cl.21 celler ble drept bare når de ble pulset med Lass5 peptid (fig. 4A til høyre), noe som tyder på at cellene ikke effektivt presentere denne epitop.
A) Venstre : RT-PCR ble utført for å påvise to skjøtes (lang og kort) Lass5 genet transkripsjoner [13] i CMT.64, CMT.TAP1,2, cl.2 og RMA-S-celler. Bare den lange transkriptet koder for en epitop Lass5 [13]. A) Høyre: Lass5 epitop presentasjon av TAP-mangelfulle og TAP-dyktig CMT.64 celler ble oppdaget av 12-16 timer
51 Cr-release analyser. Lass5 spesifikke T-celler ble generert ved immunisering i.p. med y-bestrålt RMA-S /B7.1 celler pulsert med fem mikrometer Lass5 peptid. De immuniserte Splenocyttene ble re-stimulert
in vitro
med Lass5 peptid-pulset y-bestrålt RMA-S /B7.1-celler i 5 dager. Ett av tre eksperimenter er vist. B) Venstre: 12-16 h
51 Cr-release analyser ble utført for å bekrefte at en NP
366-374 eptitope spesifikk T-cellepopulasjonen generert ved immunisering med y-bestrålt RMA-S /B7.1 celler pulset med fem mikrometer NP
366-374 peptid inneholdt ikke T-celle subpopulasjoner erkjenner TAP-uavhengig epitoper som presenteres av CMT.64 og dens transfektanter. De
51 Cr-stemplet mål ble vist i figur 4B. B) Høyre: Standard
51 Cr-release analyser ble utført for å bekrefte at TAP-mangel CMT.64 transfektanter ikke til stede TAP avhengig NP
366-374 epitop når cellene ble infisert over natten med VV bærer NP
366-374 minigenet ved multiplisitet av infeksjon (MOI) på 3.
51Cr-stemplet mål ble vist i figur 4B. NP
366-374 epitop spesifikke T-celler ble generert ved immunisering med y-bestrålt RMA-S /B7.1 celler pulsert med fem mikrometer NP
366-374 peptid og re-stimulert med 5 mikrometer NP
366-374 peptid in vitro. C) En ELISPOT analyse ble utført for å påvise Lass5 spesifikke IFN-y-sekresjon forløpere. Mus ble immunisert med γ-bestrålte CMT.64 /pp, CMT.TAP1,2, CMT.B7.1 /p og CMT.TAP1 /B7.1 tumorceller. De immuniserte splenocytter ble stimulert med eller uten Lass5 peptid. Antallet Lass5 antigen-spesifikke, IFN-y-sekresjon forløpere ble bestemt. Forløper frekvens er rapportert som IFN-γ-utsondrende celler pr 10
6 splenocytter (IFN-γ-SC /10
6 splenocytter).
Siden T-cellepopulasjonen ble generert av RMA-S /B7.1 celler pulsert med Lass5 peptid, kan vi ikke utelukke at T-cellepopulasjonen inneholder under bestander av andre epitop-spesifikke T-celler som dreper TAP-mangeltumorceller. Dette er fordi RMA-S /B7.1 celler som anvendes for immunisering har blitt rapportert å være i stand til å generere mange forskjellige K
b og d
b begrensede T-cellekloner [13]. For å eliminere denne muligheten, vi generert en D
b-begrenset influensa NP
366-374 (ASNENMDTM) epitop spesifikk T-cellepopulasjon ved immunisering med RMA-S /B7.1 cellene pulset med NP
366 -374 peptid som bruker lignende betingelser som for Lass5 spesifikk T-celle generasjon. Tumorceller uttrykker ikke influensa NP
366-374 epitop og dermed NP
366-374 epitop spesifikke T-celler bør ikke gjenkjenne kreftceller. Dersom T-cellepopulasjon inneholder NP
366-374 epitop irrelevante T-celler, kan en slik T-cellepopulasjon enten drepe TAP-manglende tumorceller eller mislykkes i å drepe cellene. Hvis T-celler dreper kreftceller dette tyder på at TAP-uavhengig epitop spesifikke T-celler, annet enn NP
366-374 epitop kan være co-generert ved immunisering med RMA-S /B7.1 celler pulset med NP
366-374 peptid. Dersom T-cellene ikke drepe svulstcellene Dette tyder på at peptid-pulset RMA-S /B7.1-celler generere en T-cellepopulasjon inneholdende T-celler som fortrinnsvis gjenkjenner peptidepitopen benyttet for immunisering. Resultatene viser at de genererte T-cellene ikke kan drepe enten TAP-mangelfulle eller TAP-kompetent tumorceller unntatt CMT.64 celler pulsert med NP
366-374 peptid (Fig. 4B venstre). Dermed våre resultater bekrefter at TAP-mangeltumorceller til stede Lass5 epitop for T-celle anerkjennelse. I motsetning til TAP-uavhengig Lass5 epitop presentasjon, TAP-mangelkreftceller ikke var i stand til å presentere TAP-avhengig og D
b-begrenset NP
366-374 epitop når cellene ble infisert med VV bærer NP
366-374 minigenet (fig.4 B til høyre).
For å finne ut om CMT.TAP1 /B7.1, CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p og CMT.64 /pp celler er i stand til å utløse Lass5 spesifikke T-celler, ble cellene injisert ip inn i C57BL /6 mus, og IFN-γ utskillende splenocytter ble kvantifisert ved anvendelse av en ELISPOT-analyse. Som vist på fig. 4C, en stor økning i antall Lass5 spesifikk IFN-y-utskillende splenocytter ble observert hos mus immunisert med enten CMT.TAP1 /B7.1 eller CMT.B7.1 /p-celler sammenlignet med mus immunisert med CMT.TAP1 /p eller CMT.64 /pp celler. Disse resultatene indikerer at TAP-negative og TAP1-uttrykkende tumorceller kan presentere TAP uavhengige antigener, inkludert Lass5 antigen, og at B7.1-ekspresjon i tumorcellene gir bedre T-celle-grunning.
Immunisering med CMT. 64 celler infisert med både VV-B7.1 og VV-TAP1 øker beskyttelse av mus fra utfordring tumor
en potensiell metode for mer pålitelig cancer immunoterapi er bruk av en viral-baserte gen-bærende vektor for å infisere celler for immunisering. Etter immunisering med en høy dose av B7.1 eller B7.1 + TAP1 transfekterte celler dramatisk beskyttet mus fra utfordring tumor (fig. 2C venstre), vi bestemt om immunisering av mus med y-bestrålte CMT.64 celler infisert med VV-B7 0,1 + VV-CR19 (villtypevirus) eller VV-B7.1 + VV-TAP1 ha beskyttelse i likhet med mus immunisert med gen-transfekterte tumorceller. Vi først analysert B7.1 og TAP1 uttrykk i CMT.64 celler infisert over natten med VV-B7.1 + VV-CR19 eller VV-B7.1 + VV-TAP1. Vi har observert at B7.1 og TAP1 ble sterkt uttrykt i celler som var infisert med relevante VVS (Fig. 5A).
CMT.64-celler ble infisert natten over med en kombinasjon av to VVS ved MOI på 3 for hvert VV . A) B7.1-ekspresjon ble påvist ved FACS-analyse ved bruk av FITC-konjugert B7.1-spesifikke mAb 16-10A1. CMT.64 celler uten viral infeksjon ble anvendt som en negativ kontroll. TAP1 ekspresjon ble påvist ved Western blot ved anvendelse av et geite-anti-mus polyklonalt TAP1 Ab. RMA-S-celler ble anvendt som en kontroll. B) Standard
51 Cr-release analyser ble utført for å oppdage om virusinfiserte tumorceller påvirkes presentasjon av endogene tumorantigener. CMT.64 tumorceller ble smittet over natten med VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, eller VV-B7.1 + VV-TAP1, og brukt som målceller. Kontrollcellelinjer var CMT.64, CMT.B7.1 /p og CMT.TAP1 /B7.1. Tumor antigen-spesifikke T-celler ble generert ved immunisering med y-bestrålte CMT.B7.1 /p-celler. Target og effektor ratio ble brukt på 1:100. a: CMT.64; b: CMT.B7.1 /p; c: CMT.TAP1 /B7.1; d: CMT.64 + VV-GFP + VV-GFP; e: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-GFP og f: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-TAP1. ** Indikerer statistisk signifikans (P«0.05) ved hjelp av ANOVA analyse.
Wild-type VV-infeksjon kan hemme antigen presentasjon i dendrittiske celler [20] og redusere infisert celle levedyktighet. For å unngå disse effekter, anvendte vi et rekombinant VV-GFP for å erstatte villtype VV-CR19 for virusbasert celle infeksjon og immunisering. -Mus ble immunisert i.p. med CMT.64 celler (5 × 10
6 celler /mus) infisert med VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, eller VV-B7.1 + VV-TAP1, etterfulgt av utfordringen med live CMT.64 celler og overlevelse ble bestemt. Resultatene er vist i tabell 1. Mus immunisert med VV-B7.1 + VV-infiserte TAP1 CMT.64 celler viste en signifikant økning i overlevelse sammenlignet med mus immunisert med celler infisert med VV-GFP + VV-GFP (kontrollmus ; P 0,05), mens ingen forskjell ble observert mellom kontroll mus og mus immunisert med cellene infisert med VV-B7.1 + VV-GFP (P 0,05). Disse resultatene indikerer at etter immunisering med et viralt infiserte cellesystem, er nødvendig for ko-ekspresjon av B7.1 og TAP1 i celler for å forsterke beskyttende antitumorimmunitet.
Etter immunisering med celler som uttrykker B7. 1 alene viste forskjellige beskyttende T-cellemediert immunrespons mellom en viralt infisert celle system og en gen-transfektert cellesystem ved en dose på 5 x 10
6 celler per mus immunisering, vi spekulert i at viralt avledede antigener påvirke presentasjonen av TAP -Uavhengig iboende tumorantigener, og dermed redusere kapasiteten av tumorceller til T-celle-grunning. For å vurdere denne muligheten, ble standard
51 Cr-release analyser utført ved bruk av cytolytiske T-celler som genereres av immunisering med y-bestrålte CMT.B7.1 /p celler (5 × 10
6 celler /mus). CMT.64 celler infisert med VV-B7.1 + VV-TAP1, VV-B7.1 + VV-GFP eller VV-GFP + VV-GFP natten ble brukt som mål og VV-infisert CMT.64, CMT.B7. 1 /p og CMT.TAP1 /B7.1-celler ble brukt som kontroller. Som vist på fig. 5B, anerkjennelse av de virusinfiserte celler ved T-celler ble betydelig redusert sammenlignet med relevante kontroller.
Tatt sammen, konkluderer vi at effektiv vaksinering med virusinfiserte TAP-negative celler krever både B7.1 og TAP1 co- uttrykk i tumorceller.
Diskusjoner
Denne studien viser at B7.1 og TAP1 co-uttrykk i TAP-negative CMT.64 celler gjør kreftceller potente immunogener stand til effektivt å indusere en CD8
+ T-cellemediert immunrespons mot TAP-negative tumorer. Indusert CD8
+ T-celler sannsynlig gjenkjenne TAP-uavhengige antigener presentert av TAP-mangeltumorceller. Tre viktige faktorer, TAP1, B7.1 og mengden av antigen (er) synes å bidra til CMT.64 tumorcelle priming av T-celler.
Våre resultater tyder på at med en lav dose av γ-bestrålte celle immunisering av TAP1 og B7.1 co-uttrykkende CMT.TAP1 /B7.1-celler generert et antitumorimmunrespons som er større enn den som fremkalles av den TAP-negative og B7.1 uttrykke CMT.B7.1 /p-celler (fig. 2C høyre). Dette indikerer at TAP1 uttrykk spiller en avgjørende rolle i å forbedre T-celle priming som tyder på at TAP1 uttrykk kan rette for effektiv presentasjon av TAP-uavhengig tumorantigener. Muligheten for effektiv presentasjon av antigenet (e) bæres av fig. 5B (kolonnene B og C) som viser at CMT.B7.1 /p-induserte T-celler drept CMT.TAP1 /B7.1 mål ved bedre enn CMT.B7.1 /p mål. En mulig mekanisme for økt antigenpresentasjon ved TAP1 er at dens expression «bærere» presentasjon av enkelte antigener (andre enn ER-lumen-avledede antigener som kan bli presentert av både TAP-negative og TAP1-postive celler) som er uttrykt på celle overflate for T-celle-gjenkjennelse og /eller T-celle-grunning. Denne mulighet er støttet av bevis for at en vesikulær stomatitis virus kjernekapselprotein avledet epitop VSV-Np
52-59 som dannes i cytoplasma kan presenteres ved TAP1 uttrykk CMT.64 celler mer effektivt enn TAP-negative celler CMT.64 [14]. Våre funn markere mangfold av immunresponser mot tumorer, som er innebygd i det cellulære immunsystem. Betydningen av disse funnene bør studeres videre, spesielt for identifisering av TAP-uavhengig epitoper som er godt presentert og for egenskapene til epitop spesifikke T-celler.
B7.1 uttrykk i tumorceller kan spille en rolle i redusere terskelen for antigen-spesifikk T-celle-priming [21], [22], [23]. Denne mulighet er støttet av vår observasjon at T-celle-mediert anti-CMT.64 tumorimmunitet kan utvides ved B7.1 uttrykkende tumorceller sammenlignet med B7.1 negative tumorceller (Fig. 2C venstre). Mekanismer involvert i grunning av T-celler mot CMT.64 svulster ved B7.1 uttrykker TAP-mangel celler kan være fortrinnsvis gjennom svulst direkte priming snarere enn dendrittiske cellen (DC) cross-grunning. Dette forklarer hvorfor immunisering med B7.1 uttrykker CMT.64 celler indusert en høy grad av anti-CMT.64-tumorimmunitet mens immunisering med B7.1-negative celler CMT.64 tilgjengelig betydelig mindre immunitet. Cross-priming krever profesjonell antigenpresenterende DCs å fange antigene proteiner fra apoptotiske celler og å behandle og presentere de genererte epitoper for T-celle priming i en TAP-avhengig måte [24]. Dermed kan TAP-uavhengig epitoper som uttrykkes på CMT.64 celler ikke bli presentert på DC overflate for T-celle grunning, fordi disse epitoper som ligner på peptider presentert på trykk-mangel RMA-S-celler [25] generelt vise lav muligheten for MHC-i-binding, og kan derfor ikke konkurrere med TAP-avhengige epitoper for MHC-i-binding og DC overflate uttrykk.
mengden av antigen (er) som benyttes for immunisering direkte påvirker styrken av generert antitumorimmunitet som bekreftes av våre resultater vedrørende doseavhengig immunisering med y-bestrålte celler (fig. 2C venstre og høyre). Med en høy dose celle immunisering ble svært beskyttende immunitet generert av både CMT.TAP1 /B7.1 og CMT.B7.1 /p celler. Dette tyder på at både y-bestrålt cellelinjer levert effektive mengder av TAP-uavhengige antigener for T-celle induksjon. Med en lav dose immunisering, TAP1-positive CMT.TAP1 /B7.1 celler stimulert immunsystemet til å generere beskyttende immunitet bedre enn TAP-negative CMT.B7.1 /p celler. Dette tyder på at TAP1 og B7.1 co-uttrykke CMT.TAP1 /B7.1 Celler gir TAP-uavhengige antigener for T-celle Sugende mer enn det som tilbys av B7.1 uttrykke CMT.B7.1 /p celler.
En fersk rapport illustrert at immunisering med B7.1-transfektert TAP1-uttrykke RMA-S-celler fremkalte T-celle basert beskyttende immunitet mot RMA-S-celler [13]. Våre resultater viser videre at immunisering med enten TAP1-uttrykke eller TAP-negative tumorceller som uttrykker B7.1 kan lokke fram en effektiv T-cellemediert immunrespons mot TAP-negativ svulst utfordring. I et slikt beskyttende immunitet, CD8
+ T-celler spilt en stor rolle i respons til TAP-negative kreftceller, mens CD4
+ T-celler hadde en betydelig rolle også. Siden CMT.64 celler ikke uttrykker MHC klasse II-molekyler, er en viktig funksjon av CD4
+ T-celler kan være å støtte CD8
+ T-celle responser på tumorceller [26], [27], [28
