Abstract
Innledning
Formålet med denne studien var å profilere glukoseavhengig og glutamin avhengig metabolisme i bukspyttkjertelkreft.
Metoder
Vi utførte Immunhistokjemisk farging av GLUT1, Caix, BNIP3, p62, LC3, GLUD1, og GOT1. På bakgrunn av ekspresjonen av metabolisme-relaterte proteiner, ble de metabolske fenotypene av tumorer klassifiseres i to kategorier, inkludert glukose og glutamin-avhengig metabolisme. Det var Warburg type, reversere Warburg type, blandet type, og null typen i glukose-avhengig metabolisme, og kanonisk type, ikke-kanoniske type, blandet type, null skriv inn glutamin-avhengig metabolisme.
Resultater
Lengre total overlevelse var assosiert med høy uttrykk for BNIP3 i tumor (p = 0,010). Kortere total overlevelse var assosiert med høy uttrykk for GLUT1 i tumor (P = 0,002) og GOT1 i tumor (p = 0,030). Warburg type glukoseavhengig metabolisme hadde en høyest prosentandel av tumorer med nerve infiltrasjon (P = 0,0003), UICC trinn (P = 0,0004), og aktivert autophagic status i tumor (P = 0,0167). Blandet type glukoseavhengig stoffskifte består den høyeste andelen av svulster med positiv marginal status (P 0,0001), lymfatisk invasjon (P 0,0001), og aktivert autophagic status i stroma (P = 0,0002). Blandet type og Warburg typen hadde en signifikant sammenheng med kortere total overlevelse (p = 0,018). Ikke-kanoniske type og blandet type glutamin-avhengig metabolisme omfattet den høyeste andelen av svulster med vaskulær invasjon (p = 0,0073), høyeste andelen aktivert autofagi i tumorer (P = 0,0034). Dessuten er disse to typer av glutamin-avhengig metabolisme var signifikant assosiert med kortere total overlevelse (P 0,001). Videre analyse antydet at de fleste tumorer var avhengig av både glukose og glutamin-avhengig metabolisme. Etter oppdelingen svulstene i henhold til antall metabolisme, fant vi at stadig flere metabolisme subtyper omvendt assosiert med overlevelse utfallet.
Konklusjon
Warburg typen, ikke-kanoniske type og blandede typer glukose og glutamin-avhengig metabolisme består av mer metabolsk aktive, biologisk aggressive og dårlige prognostiske svulster. Videre den økende undertyper og kategorier av metabolismen i hver svulst signifikant assosiert med dårlig prognose
Citation. Yu M, Zhou Q, Zhou Y, Fu Z, Tan L, Ye X, et al. (2015) Metabolsk fenotyper i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 10 (2): e0115153. doi: 10,1371 /journal.pone.0115153
Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 6 februar 2014; Godkjent: 18 november 2014; Publisert: 26 februar 2015
Copyright: © 2015 Yu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet ved National Natural Scientific Foundation of China (nr. 81000917 og nr. 81370059). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aberrant metabolisme er nå regnet som en av kjennetegnene til kreft [1]. Spesielt, tumorceller utviser høye nivåer av glykolyse selv under tilstrekkelig oksygentilførsel, et bemerkelsesverdig fenomen betegnes Warburg virkning. Den banebrytende arbeidet til Otto Warburg har vært støttet av rapporter i ulike krefttyper, og er nå utnyttet i klinikken for diagnostiske formål. Imidlertid er dette synet utfordret av nye bevis. I sin teori, Warburg antatt at kreftcellene hadde en tendens til å generere ATP via glykolyse i stedet for oksydativ phorsphorylation følge mitokondriell dysfunksjon [2]. Likevel, montering bevis indikerte at primære defekter i mitokondrie enzymer eller komplekser i oksidativt phorsphorylation ikke ble ofte observert i kreft [3]. Det relativt lave antallet metabolske hemmere ble innført i kreftbehandling og bare et fåtall av dem har skrevet klinisk utvikling [4], delvis som følge av heterogenitet og kompleksitet i tumor metabolisme. Videre studie utført av Zu og hans kollega viste at mengden av ATP avledet fra glykolysen ikke overstiger 50-60% av den totale ATP produksjon [5,6]. Et nytt paradigme som heter «reverse Warburg effekten» som aerob glykolyse fant sted i kreft-assosiert fibroblaster, snarere enn kreftceller, også dukket opp i brystkreft [7,8]. Nyere data har vist at kreft i bukspyttkjertelen celler utnytte glutamin på en uvanlig måte, som er avhengig av glutaminsyre-oksaloeddiksyre-transaminase i stedet for glutamat dehydrogenase [9]. Disse funnene legger stor vekt på betydelig heterogenitet i kreft metabolisme som tyder på at hver kreft har sine egne metabolske funksjoner, som må tas i betraktning før du utforsker nye mål i kreft metabolisme.
Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken av kreftrelaterte dødsfall i USA og Europa. Det er fortsatt en av de mest problematiske og dødelig sykdom på grunn av sin sent stadium når diagnosen, invasiv fenotype, motstandsdyktig mot nåværende behandlinger [10,11]. Målretting kreft metabolisme er en lovende strategi i å forbedre bukspyttkjertelkreft behandling. For å legge til rette for utvikling av stoffskifte terapeutiske behandlinger, metabolisme fenotyper i bukspyttkjertel kreft som trengs for å bli belyst. Til vår beste kunnskap, finnes det ingen studier som undersøker de metabolske fenotyper i bukspyttkjertelkreft. Derfor ble målet for vår nåværende studie utført for å profilere glukoseavhengig og glutamin-avhengig metabolisme, mitokondrie og autophagic status i bukspyttkjertelkreft.
Materialer og metoder
Pasient utvalg
Prøver av 106 kreft i bukspyttkjertelen vev ble hentet fra pasienter som gjennomgår radikale operasjoner i en retrospektiv studie kohort mellom januar 2000 og desember 2012 på Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen-universitetet og en prospektiv kohort fra juni 0,2012 til mai 2013 (registreringsnummer: ChiCTR-TRC-12002548). Denne studien holdt Helsinki-deklarasjonen og ble godkjent av Institutional Ethics Committee of Sun Yat-sen Memorial Hospital. Alle pasienter signert samtykkeerklæring som viser at de er villige til å delta, og deres forståelse av prosedyren og generelle Målet med studien. Alle de inkluderte patologiske og histologiske bekreftet pasienter med kreft i bukspyttkjertelen med følgende kriterier: ingen historie med en hvilken som helst annen ondartet svulst, uten neoadjuvant terapi før operasjonen. Ingen av dem døde under den perioperative perioden på grunn av postoperative komplikasjoner. Alle pasienter samtykke ble innhentet før innsamling av prøver, og alle studie prosedyrene ble godkjent av Ethic komiteen Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen-universitetet. Dataelementer ble hentet gjennom journalsystemet som følgende: alder, kjønn, status av glukosemetabolismen, tumorstørrelse, tumor beliggenhet, histologisk grad, marginal status, nerve infiltrasjon, vaskulær invasjon, UICC Stage (Tumor patologisk stadium ble klassifisert i henhold til EU for International Cancer Control (UICC)), og lymfatiske invasjon. Total overlevelse (OS) ble definert som tidsintervallet fra dato for operasjonen til død eller siste oppfølging i mai 2013.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk analyse ble gjennomført som følgende: Tissue prøvene ble fiksert i nøytral-bufret formalin, og deretter integrert med parafin. Endogen peroksidase ble stanset med 3% hydrogenperoksid i 30 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble deretter vasket i PBS og inkubert i 30 min ved 37 ° C med trypsin buffer. Etter tilstrekkelig vask i PBS, ble antigen gjenfinning av 5-mikrometer tykke seksjoner av 106 kreft i bukspyttkjertelen vev svis i citratbuffer (pH 6,0). Når objektglassene ble avkjølt til romtemperatur, ikke-spesifikk proteinbinding var blokk for 60min ved normalt geiteserum ved romtemperatur. Deretter ble primært antistoff (oppført i tabell 1 i S2 File) for immunhistokjemi brukt natten ved 4 ° C. Deretter ble Elivision Super DAB kit brukes som manufactory instruksjoner. Det primære antistoff inkubasjon ble utelatt som negative kontroller. Positive kontroller ble valgt som foreslått i antistoff instrukser eller tidligere data [12,13]: glukosetransportør 1 (GLUT1): esophageal carcinoma; karboanhydrase IX (Caix): nyrekreft; BCL2 /adenovirus E1B 19-kDa samspill protein 3 (BNIP3), nyrevevet; Beclin-1: bryst vev; mikrotubul-assosiert protein en lettkjede 3 (MAPLC3): nervevev i hver prøvestykker; p62: milt vev; glutamin-aminotransferase (GOT1): nyrevevet; glutamat dehydrogenase 1 (GLUD1): hjertevevet (figur A i S1-fil). Immunoreaktivitets-scoring (IRS) systemet ble ansatt for semikvantitativ analyse. I korte trekk, ble IRS score for hver prøve erholdt ved to uavhengige patologer, og middelverdien av resultatet var det sluttresultatet vi anvendt for ytterligere analyse. Uoverensstemmelser mellom patologer «data ble løst ved diskusjon med en tredje patolog til konsistensen ble nådd. Poeng for uttrykk av metabolismen relaterte proteiner ble evaluert i henhold til intensitet og proporsjon. Intensiteten ble bestemt poengsum som 0 (ingen farging), 1 (svakere enn farging positiv kontroll), 2 (lik farging som positiv kontroll) og 3 (sterkere farging enn positiv kontroll). Andelen resultatet ble bestemt som 0 (negativ), en ( 30% av tumorcellene) og 2 (≧ 30% av tumorceller). Intensiteten score og andel poengsum ble multiplisert sammen for en total poengsum. Totalt score ble kategorisert som følger: 0-1 (negativ) og 2-6 (positiv)
Klassifisering av tumor metabolske fenotyper
Vi klassifisert sakene til fenotyper i henhold til immunhistokjemisk farging for. disse stoffskifterelaterte proteiner som tidligere rapport [12,13]: glycosis typer: GLUT1- og /eller Caix-positive; nonglycolysis Type: GLUT1- og Caix-negative; dysfunksjonell mitokondrie Type: BNIP3-positive; funksjonell mitokondrie Type: BNIP3-negative; aktiverte autofagi typer: to eller flere autophagic markører fra Beclin1, LC3, p62; inaktivert autofagi Type: positivt for mindre enn to autophagic markører fra Beclin1, LC3, p62; kanoniske glutamin metabolisme Type: GLUD1-positive og GOT1 positiv; ikke-kanoniske glutamin metabolisme Type: GLUD1-negative og GOT1 positive. Metabolisme i bukspyttkjertelkreft ble delt inn i to hovedkategorier: glukose-avhengig metabolisme og glutamin avhengig stoffskifte [9,14]. Glukoseavhengig metabolisme fenotypen til individuell kreft i bukspyttkjertelen prøven er klassifisert som følger i henhold til tidligere rapporter [12,13]: Warburg Type: tumor (glykolyse type), stroma (ikke-glykolyse typen, oksidativ fosforylering); reversere Warburg Type: tumor (non-glykolyse type oksidativ fosforylering), stroma (glykolyse type); blandet type: tumor (glykolyse type), stroma (glykolyse); og null Type: tumor (non-glykolyse typen, oksidativ fosforylering), stroma (ikke-glykolyse typen, oksidativ fosforylering). Glutamin-avhengig metabolisme fenotypen til individuell kreft i bukspyttkjertelen prøven er klassifisert som følger: kanonisk type (GLUD1-positive og GOT1-negativ), ikke-kanonisk type (GOT1-positive og GLUD1-negativ), blandet type (GLUD1-positive og GOT1- positiv), null type (GLUD1-negative og GOT1-negative) av glutamin metabolisme.
Kvantitativ real-time Reverse Transcription-PCR-analyse
Vi vurderte mRNA uttrykk av målgener med QRT -PCR. Total RNA ble isolert fra vev og cellelinjer ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen), og konsentrasjonene ble målt med et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies). Den første kjede av cDNA ble syntetisert med PrimeScript® første Strand cDNA Synthesis Kit (Takara). QRT-PCR ble brukt i henhold til produsentens anvisninger. QRT-PCR ble deretter utført ved 95 ° C i 10 minutter, ved 95 ° C i 15 sekunder, og ved 60 ° C i 15 sekunder, med et totalt 40 sykluser. Hver reaksjon ble utført in triplo og alle primerne anvendt var oppført i tilleggsdata. -Primere ble utformet basert på sekvensen til hvert gen ved hjelp av Premier 5,0. De mRNA-nivåer ble normalisert til beta-aktin mRNA i henhold til følgende formel: [2 – (C
T
Target – C
T
Actin)] x 100%, hvor C
T er terskelen syklus.
Statistiske analyser
data ble analysert ved hjelp av SPSS for Windows versjon 16.0 programvare (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Kategoriske variabler ble sammenliknet med Fisher eksakt test. De mediane overlevelsestider ble evaluert ved Kaplan Meier-overlevelseskurver, og forskjellene ble videre analysert med log-rank test. Når P-verdien var mindre enn 0,05, signifikans ble antatt mindre markert. Når P-verdien var mindre enn 0,1 i univariat analyse og disse variablene ble videre analysert i multivariat analyse gjennom Cox-modeller.
Resultater
Clinicopathological kjennetegn inkluderte pasienter
kohorten besto av 106 pasienter, inkludert 57 menn og 49 kvinner. Gjennomsnittlig alder ved operasjon var 60.42 år, med en median alder på 61.00 år, og et område fra 31 år til 77 år. På tidspunktet for siste klinisk oppfølging (mai 2013), 29 (27,4%) av pasientene var i live. Median total overlevelse av de 106 pasientene var 21,9 måneder, med 1-, 3- og 5-års overlevelse på 56,8%, 13,2% og 6,2%, henholdsvis. Flertallet av pasientene (80,2%) hadde svulster som ligger innerst i bukspyttkjertelen, og størrelser av de fleste svulster (80,2%) var mer enn 20 mm i største diameter. De fleste tumorer ble moderat differensierte (37,7%), etterfulgt av godt differensiert (35,9%), og dårlig differensiert (26,4%). Tjuetre (21,7%) av pasientene fikk en positiv margin. Nerve infiltrasjon ble presentert i 84 pasienter (79,2%), vaskulær invasjon i 82 (77,4%) pasienter, og lymfatisk invasjon i 68 (64,2%) pasienter. De fleste pasienter (73,6%) presenteres med Union for International Cancer Control (UICC) stadium IIB sykdom, og de resterende (26,4%) pasienter presenteres med UICC stadium IA, IB og IIA sykdom. Ingen pasienter presenteres med UICC stadium III og IV sykdom.
Sammenheng mellom uttrykket av stoffskifterelaterte proteiner og clinicopathological parametre
Sammenhengen mellom stoffskifterelaterte proteiner og clinicopathological parametere ble oppsummert i tabell 1 Tabell 4. Vi fant at økt tumor uttrykk for GLUT1 var assosiert med nerve infiltrasjon (P = 0,0180), lymfatisk invasjon (P 0,0001), UICC scenen (P = 0,0044), mens stromal uttrykk for GLUT1 var assosiert med tumor dedifferentiation ( P = 0,0155), positiv marginal status (P = 0,0063), nerve infiltrasjon (P = 0,0005), lymfatisk invasjon (P = 0,0065) og UICC trinnet (P = 0,0010) (tabell 1). Tumor ekspresjon av GLUD1 var forbundet med større tumorstørrelse (P = 0,0086). Tumor uttrykk for GOT1 var signifikant forbundet med tumor differensiering (P = 0,0238), vaskulær invasjon (P = 0,0384), lymfatisk invasjon (P = 0,0367). Det var en signifikant sammenheng mellom stromal ekspresjon av GOT1 og nerve infiltrasjon (P = 0,0087) (tabell 2). Tumor ekspresjon av BNIP3 var assosiert med tumor dedifferentiation (P = 0,0155), mens stromal ekspresjon av BNIP3 var assosiert med positiv marginal status (P = 0,0010) (tabell 3). Cytoplasmisk p62-ekspresjon i tumor var assosiert med positiv marginal status (P = 0,0132), mens kjerne p62-ekspresjon i stroma var forbundet med større tumorstørrelse (P = 0,0173) (tabell 3). Tumor uttrykk for LC3 ble knyttet til nedsatt glukosemetabolismen (P = 0,0205), større tumorstørrelse (P = 0,0453), tumor dedifferentiation (P = 0,0040), vaskulær invasjon (P = 0,0044), lymfatisk invasjon (P = 0,0385), mens stromal ekspresjon av LC3 assosiert med tumor dedifferentiation (P 0,0001), positiv marginal status (P = 0,0010), negativ vaskulær invasjon (P = 0,0015) (tabell 4). Det var en signifikant sammenheng mellom cytoplasmisk ekspresjon av Beclin-1 i tumor invasjon og lymfatiske (P = 0,0175), mens kjerne Beclin-1-ekspresjon i stroma var assosiert med positiv marginal status (P = 0,0379) (tabell 4).
Sammenheng mellom svulst metabolske fenotyper og clinicopathological parametere, mitokondriefunksjon og autophagic status
Klassifisering av svulst metabolske fenotyper ble oppsummert i henhold til tidligere rapporter (tabell 2 i S2 fil) og representative immunohistokjemisk merking profiler er vist i fig. 1 [13,14]. Warburg typen refererer til en fenotype hvor bare tumorceller viser økt glykolyse og glykolyse finner sted i stroma ikke tumor i revers Warburg type. Både tumorceller og stromale celler er glykolytisk i blandet type og nonglycolytic i null type. Korrelasjonene mellom de metabolske fenotypene av kreft i bukspyttkjertelen og clinicopathological parametere ble oppsummert i tabell 5. Den totale 106 tumorprøver ble delt inn i følgende fire typer i henhold til deres glykolyse-relaterte proteiner uttrykk: Warburg type (n = 46, 43,4%), revers Warburg type (n = 15, 14,2%), blandet type (n = 16, 15,1%), null type (n = 29, 27,3%). Warburg type glukoseavhengig stoffskifte hadde høyest prosentandel av svulster med nerve infiltrasjon (P = 0,0003), UICC scenen (P = 0,0004). Blandet type glukoseavhengig stoffskifte består den høyeste andelen av svulster som ligger i kroppen /hale (P = 0,0041), med positiv marginal status (P 0,0001), og med lymfatisk invasjon (P 0,0001). Omvendt Warburg typen hadde en høyeste andelen svulster som ligger i hodet (P = 0,0041), med fravær av nerve infiltrasjon (P = 0,0003). Null type glukoseavhengig stoffskifte består høyeste andelen av svulster med negativ marginal status (P 0,0001) og fravær av lymfatisk invasjon (P 0,0001).
Bilder
De totale 106 tumorprøver var også delt inn i fire undergrupper av glutamin-avhengig metabolisme, inkludert kanonisk type (n = 18, 17,0%), ikke-kanonisk type (n = 74, 69,8%), blandet type (n = 5, 4,7%) og null typen ( n = 9, 8,5%) (Tabell 5). Den kanoniske typen refererer til en fenotype som tumorer er avhengige av glutamat dehydrogenase (GLUD1) for glutamin utnyttelse; mens ikke-kanonisk typen refererer til en fenotype hvor tumoren er avhengige av aspartat-transaminase (GOT1) for glutamin utnyttelse [9,15]. Den blandede type glutamin-avhengig metabolisme refererer til en fenotype som tumorer forbrenne glutamin gjennom GLUD1 og GOT1, og null typen refererer til en fenotype som tumorer forbrenne glutamin ved verken GLUD1 eller GOT1. Canonical typen hadde en høyest andel av svulster med negativ marginal status (P 0,0001), mens blandet type glutamin-avhengig metabolisme omfattet den høyeste andelen av svulster med positiv marginal status (P 0,0001), vaskulær invasjon (p = 0,0073). En signifikant sammenheng ble funnet mellom null type glutamin-avhengig metabolisme og svulster med større størrelse ( 2.0cm) (p = 0,0163). Videre svulster i ikke-kanoniske type og blandet hadde en betydelig aktivert autophagic status i tumor (p = 0,0034), og ikke-kanoniske typen består den høyeste andelen av stroma med funksjonell mitokondriestatus (P = 0,0046) (Tabell 6).
Impact of clinicopathological parametere og metabolisme relaterte proteiner på pasientens prognose
Univariat analyse ble utført for å undersøke forholdet av clinicopathological parametre /stoffskifterelaterte proteiner og generelle overlevelse (tabell 7 og Figur B i S1 File). Høyere histologisk grad (P = 0,041) var signifikant assosiert med kortere total overlevelse. Lengre total overlevelse var assosiert med høy uttrykk for BNIP3 i tumor (p = 0,010). Kortere total overlevelse var assosiert med høy ekspresjon av GLUT1 i tumor (P = 0,002), GOT1 i tumor (p = 0,030), og LC3 i tumor (p = 0,009). Det var border signifikante forskjeller i nerve infiltrasjon med hensyn til total overlevelse (p = 0,075).
Effekt av metabolisme fenotyper på pasientens prognose
Resultatene av univariat analyse ved bruk av log-rank tester av metabolismen fenotyper i forhold til total overlevelse er presentert i tabell 8. Glukose-avhengig metabolisme status var signifikant assosiert med total overlevelse (p = 0,018) (fig. 2A). Deretter utførte vi parvis sammenligning mellom glukoseavhengige metabolisme subtyper, og funnet ut at Warburg typen og blandet type av glukose-avhengig metabolisme var signifikant assosiert med kortere total overlevelse (Warburg typen vs. omvendt Warburg-type, P = 0,0340; Warburg typen vs. null type, P = 0,0480; blandet vs. omvendt Warburg type, P = 0,0060; blandet type vs null type, P = 0,0350). Det var ingen forskjell mellom andre par (Warburg typen vs. blandet type, P = 0,4880; Omvendt Warburg typen vs. null-type, P = 0,648) (tabell 3 i S2-fil). Vi fant også at glutamin-avhengig metabolisme status ble signifikant assosiert med total overlevelse (P 0,001) (fig 2B og tabell 8.). Etter parvise testen ble utført, fant vi at kanoniske typen ble signifikant assosiert med lengre total overlevelse (Canonical typen kontra ikke-kanoniske type, p = 0,009; Canonical typen vs. blandet type, P 0,001). Ikke-kanoniske typen ble signifikant assosiert med lengre total overlevelse enn blandet type (P 0,001), men kortere enn null type (P = 0,028) og den kanoniske type (P = 0,0009). Den blandede type glutamin-avhengig metabolisme var signifikant assosiert med kortere total overlevelse enn null type (P 0,001). Det var ingen forskjell mellom kanoniske type og null type (P = 0,453) (tabell 4 i S2 File) (Fig. 3).
Vi antok at blandede typer består av to hovedtyper innen glukose og glutamin avhengig metabolisme (dvs. Warburg effekten og revers Warburg effekten, Canonical type og ikke-kanoniske type), og null typene ble ikke satt sammen av noen av de to hovedtypene i glukose og glutamin-avhengig metabolisme (dvs. verken Warburg effekten eller omvendt Warburg effekt, verken Canonical typen eller ikke-kanoniske type.
En solid tråd med pil betyr metabolske kategorier eller undertyper har den høyeste andelen av de konkrete tilhørende parametere.
for å kunne sammenligne de to kategoriene av metabolismen i parallell, vi klassifisert svulstene i følgende grupper i henhold til de to kategoriene av metabolismen: glukoseavhengig type (svulster bare stole på glukoseavhengig stoffskifte og har ingen tegn til glutamin-avhengige metabolisme), glutamin-avhengige tumorer Type (bare stole på glutamin-avhengig metabolisme og viser ingen tegn til glukoseavhengig metabolisme), blandet type (tumorer er avhengig av både glukose og glutamin-avhengig metabolisme), og null type (svulster viser ingen tegn på glukose- eller glutamin-avhengig metabolisme) (Tabell 8). De fleste (n = 71, 67,0%) av de inkluderte tumorer i foreliggende studie var blandet, etterfulgt av glutamin-avhengig metabolisme (n = 26, 24,5%), glukose-avhengig metabolisme (n = 6, 5,7%), og null skriver (n = 3, 2,8%). Det foreslått at de fleste tumorer benyttes både glukose og glutamin-avhengig metabolisme for å overleve under mangel på næringsstoffer og oksygen. Deretter gjennomførte vi Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse og funnet at kategorier av metabolismen var signifikant assosiert med total overlevelse av pasienter (P = 0,021) (Fig. 2C). Men etter parvis test ble gjort, bare null typen signifikant sammenheng med lengre total overlevelse enn glutamin og glukose-avhengig metabolisme. Spesielt var det ingen signifikant forskjell i total overlevelse mellom glukoseavhengig metabolisme og glutamin-avhengig metabolisme (P = 0,279). Imidlertid bør nøye vurdering gis til disse resultatene på grunn av manglende data i null type og glukoseavhengig type (tabell 5 i S2 File). Vi antok at tumoren med blandet type eller Warburg type glukoseavhengig metabolismen er meget glykolytisk, og tumorer med ikke-kanonisk type og blandet type av glutamin-avhengig metabolisme er meget glutaminolytic. Vi fant at høyt glykolytiske svulster var også mer avhengig av glutamin-avhengig metabolisme og vice versa (P 0,0001).
Deretter hypotese vi at blandede typer var sammensatt av to hovedtyper hos glukose og glutamin-avhengige metabolismen (dvs. Warburg type og Reverse Warburg type, Canonical type og ikke-kanoniske type), og null typene ble ikke satt sammen av noen av de to hovedtypene i glukose og glutamin-avhengig metabolisme (dvs. verken Warburg typen eller omvendt Warburg typen verken Canonical typen eller ikke-kanoniske type). Derfor, basert på de typer av glukoseavhengig og glutamin-avhengig metabolisme, klassifisert vi pasientene i 4 grupper: null type (n = 3, 2,8%), en type (n = 31, 29,2%), to typer (n = 53, 50,0%), tre typer (n = 18, 17,0%), fire typer (n = 1, 0,9%) (Tabell 8). Som angitt i Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse for total overlevelse av en-type gruppe var signifikant lenger enn to-type gruppe (P = 0,039) og tre-type gruppe (p = 0.005) (Fig. 2D). Videre to-type gruppe viser en relativt lengre total overlevelse enn tre-type-gruppen (P = 0,024). Statistisk analyse sammenligne null type eller fire type og andre typer ble også utført, men resultatene som trengs for å bli tatt nøye vurdering på grunn av lite antall pasienter. For å oppsummere, det økende antall av metabolismen typer robust preget av store forskjeller i overlevelse utfallet (Tabell 8 og Tabell 6 i S2 File).
multivariat analyse av sammenhengen mellom prognostiske faktorer og pasientens overlevelse
Endelig multivariat analyse ble også utført når P-verdi i univariat analyse var mindre enn 0,1. Prognostiske faktorer, inkludert svulst differensiering, nerve infiltrasjon, uttrykk for GLUT1 i tumor, GOT1 i tumor, uttrykk for LC3 i tumor, uttrykk for BNIP3 i tumor, glukose-avhengig metabolisme, glutamin-avhengig metabolisme, kategorier av metabolisme og antall metabolisme typer i tumor ble analysert i Multivariate modeller ved hjelp av Cox analyse. Resultatene viste at uavhengige faktorer for total overlevelse var høyere histologisk grad (hazard rasjon 1,734, p = 0,015), GLUT1 i tumor (hazard rasjon 1,781, p = 0,003), GOT1 i tumor (hazard rasjon 1,982, p = 0,001), LC3 i tumor (hazard rasjon 3,321, p = 0,001), glutamin-avhengig metabolisme (hazard rasjon 1,471, p = 0,041), glukose-avhengig metabolisme (hazard rasjon 1,689, p = 0,022), antall metabolisme type (hasardratio 1,806, P – = 0,031). Men uttrykk for BNIP3 i tumor ble signifikant assosiert med bedre prognose (hazard rasjon 0,049, P = 0,008) (Tabell 9).
Avskrift nivå av stoffskifterelaterte gener i svulsten etter svulst fenotype
for ytterligere å bekrefte resultatene fra IHC ovenfor, QRT-PCR ble utført for å undersøke ekspresjon av stoffskifterelaterte gener (tabell 7 i S2 Fil) i tumor i henhold til tumoren fenotype. Uttrykket av SLC2A1 (gen av GLUT1), BNIP3, BECN1 (gen av Beclin1) og MAP1LC3A (gen av LC3) var høyere i Warburg typer, mens uttrykk for GLUT1, Caix, BNIP3, BECN1, MAP1LC3A og SQSTM1 (genet p62 ) var høyere i blandet type av glukose-avhengig metabolisme enn i kontrollene. Uttrykket av GLUD1 var høyere i kanonisk type enn kontrollene, og uttrykk for GOT1 var høyere hos ikke-kanoniske type og blandet type (Figur C i S1 File).
Diskusjoner
Prognosen for bukspyttkjertelcancerpasienter er fremdeles sturen, og sykdommen er åpenbart resistent overfor pågående terapi [16]. Det er derfor et økende behov for nye strategier for å forbedre antitumoreffekten av gemcitabin i kreft i bukspyttkjertelen, som er standard kjemoterapeutiske middel i bukspyttkjertelkreft. Nylig har det vært en økende interesse for å forstå kreft endret metabolisme og målretting kreft stoffskifte har en lovende strategi for kreftbehandling [4,9,17-19]. Før slike effektive metabolske narkotika kommet i bruk, metabolisme fenotyper i enkelte pasient med kreft i bukspyttkjertelen må være klart identifisert på grunn av åpen heterogenitet i bukspyttkjertelkreft [20,21]. Men lite er kjent om metabolske funksjoner i bukspyttkjertelkreft.
Derfor denne studien ble gjennomført for å profilere glukoseavhengig og glutamin-avhengig metabolisme hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Til vår beste kunnskap, vår studie var den første studien som fokuserte på profilering metabolisme fenotyper i bukspyttkjertelkreft. For å identifisere metabolismen fenotypen av individuelle tumor prøven, vi først undersøkt den differensielle ekspresjonen av stoffskifterelaterte protein markører, ikke bare i tumorceller, men også i stromale celler. Dessuten har vi også undersøke autophagic status gjennom p62, LC3, Beclin1 uttrykk og mitokondrienes funksjon av BNIP3 uttrykk. Det ble rapportert at p62 er skytteltrafikk mellom kjernen og cytosol kontinuerlig. p62 er nødvendig for å rekruttere det store phosphoinositide-bindende protein Alfy (autofagi bundet FYVE protein, også kjent som WDFY3), som hovedsakelig er plassert på kjernefysisk, til cytoplasmiske P62 organer. Alfy, så vel som p62, er nødvendig for dannelse og autophagic nedbrytning av cytoplasmiske ubiquitin-positive inklusjoner [22,23]. BNIP3 er en pro-apoptotisk medlem av Bcl-2-familien induseres under hypoksi og ble benyttet for å vurdere mitokondriefunksjonen. Det ble nylig vist at BNIP3 formidler mitokondriell dysfunksjon gjennom aktivering av Bax eller Bak, og indusert mitokondrie permeabilitet overgang via sin karboksyterminal hale. Derfor overekspresjon av BNIP3 indikerer dysfunksjonelle mitokondrier [24,25]. Av notatet, stromale celler forbrenne gjennom glykolyse skyldes dysfunksjonelle mitokondrier og forbedret autofagi, mens kreftceller forbrenne gjennom oksidativ fosforylering i henhold til teorien om omvendt Warburg effekten [7,26,27]. Så det er ingen data rapportering motsatt Warburg effekten i kreft i bukspyttkjertelen, ble denne undersøkelsen gjennomført for å bekrefte eksistensen av omvendt Warburg effekten i bukspyttkjertelkreft i mellomtiden. Vi fant at økt tumor uttrykk for GLUT1 var assosiert med nerve infiltrasjon, lymfatisk invasjon, UICC scenen, mens stomi uttrykk for GLUT1 var forbundet med svulst dedifferentiation, positiv marginal status, nerve infiltrasjon, lymfatisk invasjon og UICC scenen.
