Abstract
Formålet med denne studien er å bestemme den genetiske hyppigheten av Gnas aktive mutasjoner i kolorektal kreft og den tilsvarende patologi Gnas muterte tumorer. Onkogene mutasjoner i Gnas er blitt beskrevet i et antall av neoplasmer, inkludert de av hypofysen, nyre, bukspyttkjertel, og, mer nylig, i tykktarmskreft. For å finne den frekvensen i tykktarmskreft vi ansatt en følsom pyrosekvensering plattform for mutasjon deteksjon av R201C og R201H Gnas hotspots i tumorprøver som representerer alle kliniske faser. Vi i tillegg analysert for KRAS og BRAF-mutasjoner som tidligere rapporter har vist at disse ofte co-skje med aktive Gnas mutasjoner. Av de 428 colontumorer analysert, mutasjoner i Gnas var til stede i 10 av prøvene (2,3%), noe som indikerer dette er en betydelig, om enn sjeldne, mutasjon i tykktarmssvulster. Ni Gnas mutant-tumorer (90%) næret samtidige aktiverende mutasjoner i enten KRAS eller BRAF onkogen, som var betydelig større enn den mutasjonsfrekvens av disse gener i tumor populasjonen (56%, p 0,0305). Alle ti av de Gnas muterte tumorer oppsto i den høyre (proksimale) colon (p 0,007), og 7 av 8 anmeldt tilfeller viste en markert villøse morfologi. Samlet utgjør disse dataene indikerer at Gnas mutant colontumorer vanligvis har synkrone mutasjoner i KRAS eller BRAF, er høyresidig på plass, og er forbundet med en villøse morfologi
Citation. Fecteau RE, Lutterbaugh J, Markowitz SD, Willis J, Guda K (2014) Gnas Mutasjoner identifisere et sett med Høyre-sidig, RAS Mutant, villøse tykktarm kreft. PLoS ONE 9 (1): e87966. doi: 10,1371 /journal.pone.0087966
Redaktør: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, USA
mottatt: 17 oktober 2013; Godkjent: 31 desember 2013; Publisert: 30 januar 2014
Copyright: © 2014 Fecteau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er støttet av PHS tilskudd 1P50CA150964 (SDM, JW, KG), CA148980 (KG), P30CA43703, T32GM007250 (NR) og CA059366 (NR) og ved gaver fra Marguerite Wilson Foundation (SDM), Leonard og Joan Horvitz Foundation (SDM ). Richard Horvitz og Erica Hartman-Horvitz Foundation (SDM), og National Colorectal Cancer Research Alliance (SDM) De bevilgende myndighet ikke hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal tumorigenesis er preget av en rekke genetiske avvik som forvandler den vanlige kolonepitelet inn en invasiv kreft [ ,,,0],1]. Vi har tidligere definert et sett med 140 gener som gjennomgår tilbakevendende somatisk mutasjon i tykk- og endetarmskreft (CRC), noe som tyder på dette er trolig førere av tumorprogresjon [2], [3]. En av disse genene var Gnas, der vi har funnet vendende mutasjoner i kodon 201, som forandret høyt konservert Arg
201 til enten cystein (R201C) eller histidin (R201H) [2], [3]. Gnas er en kjent onkogen som først ble beskrevet i vekst-hormon sekresjon hypofyse adenomer og har siden vist seg å være mutert i et antall av neoplasmer, hovedsakelig ved kodon 201 hotspot [4] – [7]. Gnas kodon 201 mutasjoner er spesielt hyppig i intrapapillary mucinkjertler neoplasier (IPMN) i bukspyttkjertelen, hvor 67% av tilfellene er mutant [8]. Hovedproduktet av Gnas locus, den Gsα subenheten av heterotrimeric G-proteiner, virker til å transdusere signaler fra G-protein koblet recptors (GPCR) til effektor enzym adenylatcyklase i G-stimulerende (Gs) vei, som fører til produksjonen av syklisk AMP (cAMP). Begge R201C og R201H mutasjoner føre til konstitutiv aktivering av Gsα og autonom cAMP produksjon [9], [10].
I IPMNs er Gnas mutasjoner ofte ledsaget av mutasjoner av KRAS, med 51% av Gnas mutante tilfeller også bærer mutasjoner i KRAS [8]. Aktivering mutasjoner i KRAS, og i mindre grad, dens nedstrøms effektor BRAF, er hyppige arrangementer i tykktarmskreft. Videre, full exome sekvensering av kolorektal kreft prøver av vår gruppe og samarbeidspartnere avslørt sammenfallende Gnas og KRAS mutasjoner i en liten kohort av tykktarmskreft, noe som indikerer Gnas mutasjoner i tykktarm kreft kan også ofte være ledsaget av mutasjoner i KRAS og /eller BRAF [2] .
Rapporterte frekvenser av Gnas aktiverende mutasjoner i CRC har forskjellig blant ulike grupper, fra så lite som 0,5% til 9% [2], [11] – [13]. I denne studien benyttet vi en følsom pyrosekvensering plattform for å sekvensere kodon R201 mutasjons hotspot i en kohort av 428 sporadiske colontumorer å fastslå en mer presis frekvens i CRC. Vi har også analysert for mutasjoner i KRAS og BRAF å fastslå utbredelsen av sammenfallende Gnas /KRAS eller Gnas /BRAF mutasjoner i vår tumor kohort. Klinisk og patologisk data ble anmeldt for å fastslå om Gnas muterte tumorer er forbundet med noen unike kliniske eller morfologiske fenotyper. Her viser vi at Gnas mutant colontumorer båtplass gjentatte KRAS eller BRAF mutasjoner, målrette den anatomiske proksimale «rett-sided» kolon, og viser en villøse morfologi.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
tumorprøve opptjening protokoll med tittelen «CWRU 7296: Colon epitelvev Bank», ble godkjent av universitetssykehusene sak Medical Center Institutional Review Board for Menneskelig Investigation med det tildelte UH IRB nummer 03-94-105. Under denne protokollen, ble forkastet vev innhentet gjennom skriftlig informert samtykke fra pasienter for forskningsbruk.
vevsprøver
vevsprøver ble oppnådd fra en frossen arkiv som besto av 428 uselekterte kolorektal kreft uten rapporterte familie historie (heretter omtalt som sporadiske kolorektal adenokarsinomer) påløpt under ovenfor protokollen. Kliniske data ble innhentet og satt sammen gjennom individuelle patologi case rapporter for hver svulst. Mikroskopisk vurdering av tumor morfologi for utvalgte prøvene ble utført av en anatomisk patolog (J.W). Alle prøvene ble analysert for mutasjoner i Gnas kodon 201, KRAS kodon 12, 13, 61, og 146, og BRAF kodon 600 bruker både Sanger-sekvensering og pyrosekvensering.
DNA-ekstraksjon og MSI testing
genomisk DNA ekstraksjon fra tumorprøver ble utført ved hjelp av enten en standard guanidintiocyanat protokollen [14] eller DNeasy blod og vev (Qiagen). Testing for MSI status på genomisk loci BAT26 og BAT40 ble utført som tidligere beskrevet [15].
pyrosekvensering
ble utført pyrosekvensering analyse av Gnas kodon 201 på alle prøvene. Pyrosekvensering analysene ble utviklet ved hjelp av PSQ analysen Design programvare (Qiagen, Chatsworth, CA) som inkluderte Gnas kodon 201, KRAS kodon 12 og 13, KRAS kodon 61, KRAS kodon 146, og BRAF kodon 600. For hver analyse, en av PCR primere ble biotinylert ved 5′-enden og renset ved anvendelse av høyytelsesvæskekromatografi. Primersekvenser er som følger. Gnas: For: 5′-biotin-TTGGCTTTGGTGAGATCCATTG-3 «, Rev 5’CACCTGGAACTTGGTCTCAAAGAT-3», Seq 5’TTCCAGAAGTCAGGACA-3 «; KRAS kodoner 12 og 13: For 5»- TCGATGGAGGAGTTTGTAAATGA-3 «, 5′-biotin-Rev TTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3′, Seq 5»-CTTGTGGTAGTTGGAGC-3 «; KRAS kodon 61: For 5’CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCA-3 «, Rev 5’biotin-TCCTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3», Seq 5’ATATTCTCGACACAGCAG-3 «; KRAS kodon 146: For 5»-AGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTT-3 «, Rev 5′-biotin-GCCCTCTCAAGAGACAAAAACAT-3′, Seq 5»-AATTCCTTTTATTGAAACAT-3 «. BRAF kodon 600: For 5’TTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA-3 «, Rev 5’biotin-CCACAAAATGGATCCAGACA-3», Seq 5’TGATTTTGGTCTAGCTACA-3 «. Alle PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av Taq Faststart (Roche) og primer konsentrasjoner på 0,2 uM. Sykkelbetingelser inkludert en innledende denatureringstrinn ved 95 C i 4 minutter og 49 sykluser av 95 ° C i 15 s, 54 ° C i 30 s, og 72 C i 20 sek. Etter PCR, ble amplifiseringsprodukter sekvensert på en PyroMark MD pyrosekvensering instrument (QIAGEN) og mutasjonsanalyse ble gjennomført som tidligere beskrevet [16].
Sanger-sekvense
Sanger-sekvensering ble brukt til å bekrefte alle mutasjoner oppdaget av pyrosekvensering analyse. Isolert genomisk DNA fra tumorprøver ble anvendt for PCR-amplifikasjon av regioner som omfatter kodon 201 fra Gnas, kodon 12, 13, 61, og 146 av KRAS, og kodon 600 i BRAF. Forover og revers primere anvendt for PCR-amplifikasjon ble merket med en 5 «M13 forover (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3») og 5 «M13 revers (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3») universal primer sekvens, respektivt. Primersekvensene var som følger. Gnas: For 5’GTTGGCAAATTGATGTGAGC-3 «, Rev 5’CCCTGATCCCTAACAACACAG-3′; KRAS kodon 12 og 13: For 5»-TGGTGGAGTATTTGATAGTGTA-3 «, Rev 5’CATGAAAATGGTCAGAGAA-3»; KRAS kodon 61: For 5’TCCAGACTGTGTTTCTCCCT-3 «, Rev 5’AACCCACCTATAATGGTGAATATCT-3′; KRAS kodon 146: For 5»-AGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3 «, Rev 5′-GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3» BRAF kodon 600: For 5’TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3 «, Rev 5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3». Alle reaksjoner ble utført under anvendelse av 0,4 uM konsentrasjon av hver primer og Faststart Taq-polymerase (Roche, Indianapolis, IN). Sykling forhold for alle primerpar bestod av en initiell denaturering ved 95 C i 4 minutter, etterfulgt av 39 sykluser av 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s, og en endelig forlengelse ved 72 C i 3 minutter .
Statistical Analysis
Fishers eksakte test ble brukt for å vurdere forskjeller i andelen Gnas muterte tumorer mellom klasser av kjønn, etnisitet, KRAS /BRAF status, mikro stabilitet status, klinisk stadium, og svulst plassering. En tosidig p-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Frekvens av Gnas Hotspot Mutasjoner i tykktarmskreft
pyrosekvensering oppdaget aktiverende mutasjoner i Gnas kodon 201 i ti av de 428 (2,3%) kolorektal adenokarsinomer (tabell 1). Hver av disse mutasjoner ble også bekreftet ved bruk av Sanger-sekvensering (fig. 1). Av de ti Gnas kodon 201 mutasjoner oppdaget, identifiserte vi syv p.R201H og tre p.R201C aminosyresubstitusjoner, som alle var gjensidig utelukkende (tabell 2). Sju av disse mutasjonene oppdages oppsto blant de 377 mikro stabile svulster som ble testet (1,9%), og tre oppsto blant de 41 svulster med mikro ustabilitet (7,7%). Den økte frekvensen av Gnas mutasjoner i mikro ustabile svulster var av border statistisk signifikans (p = 0,065). Mutasjonen frekvens ved kodon 201 på 0,0063 pr diploid basepar er betydelig høyere enn bakgrunnsmutasjonshastighet på 1,2 x 10
-6 mutasjoner per basepar som kjennetegner mikro stabil coloncancere (P = 3E (-36)) [3- ].
Representative kromatogrammene (til venstre) og pyrograms (til høyre) av Gnas villtype, Gnas R201C, og Gnas R201H mutasjoner påvises i tykktarmskreft. Piler i kromatogrammene viser mutant, heterozygote topper. Boxed topper i pyrograms markere mutante alleler. Prosenter indikerer allelfrekvenser beregnet fra pyrogram peak intensiteter.
Gnas mutasjoner er forbundet med en villøse morfologi
Patologi gjennomgang av Gnas muterte tumorer avdekket en fremtredende villøse morfologi i syv av åtte (88%) tilfeller tilgjengelig for gjennomgang. I fem av disse tilfellene Gnas mutant kreft oppsto i en sammenhengende villøse adenom. I to av disse tilfellene, kreft selv viste en høyst uvanlig villøse arkitektur (figur 2). Villous adenomer er en undertype av adenomatøs polypp, og står for ca 5-15% av adenomer [17]. Villous kreft, men er foreløpig ikke anerkjent som en bestemt sub-klassifisering av CRC, men studier tyder på at villous adenokarsinomer kan utgjøre ca 9% av CRC tilfeller [18], [19]. Våre resultater indikerer at Gnas mutante svulster nær utelukkende oppstår i forbindelse med villøse morfologi stede i enten kreft eller forutgående adenom
H . E Mikroskopbilde av en Gnas mutant, villøse adenokarsinom. Svulsten har typisk villøse morfologi med utstående papiller inneholder en fibrovascular kjerne og foret med adenomatøs epitel.
En fersk studie av Yamada og kolleger oppdaget Gnas kodon 201 hotspot mutasjoner i 83% villous adenom i kolon og endetarm hos japanske pasienter [13]. Vi har derfor utvidet vår mutasjon analyse til et lite panel av villous, tubulovillous og rørformede adenomer å bestemme frekvensen av Gnas mutasjoner i et vestlig adenom kohort (tabell 3). Total, vi fant Gnas kodon 201 mutasjoner i 46% (6/13) av villous adenomer og i 15% (3/20) av tubulovillous adenomer, og på ingen rørformede adenomer. Således Gnas mutasjoner i adenomer oppstår utelukkende i sammenheng med villøse morfologi. Men i den vestlige befolkningen karakteriseres vi finner vi at villous adenomer dele molekylært i to omtrent like store grupper, en gruppe bestående av villous adenomer som oppstår via Gnas mutasjon vei, og det andre settet med villous adenomer som oppstår gjennom en alternativ vei.
Gnas mutante CRC er overveiende KRAS /BRAF mutant og ligger i proksimale colon
Blant IPMNs, Gnas mutasjoner er ofte co-ledsaget av mutasjoner av KRAS. Blant Gnas mutant tykktarm kreft, identifiserte vi mutasjoner i KRAS og BRAF onkogener i ni av ti (90%) tilfeller, en brøkdel som er betydelig høyere enn den generelle hyppigheten av KRAS og BRAF mutasjoner i tumor kohort (P 0,0305, Fishers eksakte test). Den totale hyppigheten av KRAS og BRAF mutasjoner i vår tumor befolkning var ca. 56% (44% KRAS, 12% BRAF), som er i overensstemmelse med tidligere studier [20]. Når kontrollert for anatomisk sted inne i tykktarmen, ble alle ti Gnas mutant prøvene funnet å være avledet fra primære kreftformer som har sin opprinnelse i den proksimale kolon, mellom cecum og milten bøyning, lesjoner ofte referert til som høyresidig (P 0,007, Fishers eksakte test). Inkludert i vår svulst kohort var både mikro stabil (MSS) og mikro ustabile (MSI) colontumorer, med MSI tilfeller oppstår hovedsakelig på høyre side. Fordi tre Gnas muterte tumorer var også MSI svulster, er det mulig at blant annet MSI kreft forskjøvet foreningen av Gnas mutasjoner med den proksimale colon. Men når alle MSI kreft er ekskludert fra analysen, forblir sammenslutning av Gnas positive kreft med den proksimale colon signifikant (P 0,044)
Det er interessant å merke seg at mens alle Gnas muterte kreft var høyresidig , Gnas mutante adenomer ble funnet i hele tykktarmen (tabell 4). Ingen signifikante forskjeller ble observert i Gnas muterte tumorer når analysert for kjønn, etnisitet, klinisk stadium, eller mikro status.
Diskusjoner
I denne studien finner vi at Gnas mutasjoner forbinder med en distinkt underklasse av tykktarm kreft som kjennetegnes av plassering i proksimale colon, etter å ha sammenfallende KRAS eller BRAF mutasjon, og ved samarbeid med villous morfologi. Selv om hyppigheten av Gnas mutant tykktarm kreft er 2,3%, finner vi disse svulstene utgjør en distinkt molekylær-patologisk underklasse av tykktarmskreft. Så vidt vi vet, denne analysen av 428 kolon tuomrs er den mest omfattende analyse av disse mutasjonene som har blitt gjort. Den 2,3% frekvensen av Gnas mutasjoner i dette kullet, er høyere enn det som rapporteres senest ved Idziaszczyk og kolleger i 2010, men mindre enn først observert i en tidligere mindre studie av vi og medarbeidere [2]. Forbløffende nok Gnas mutante kreft er ikke funnet i den distale colon, mens Gnas mutante villous adenomer oppstå i hele tykktarmen, øke muligheten for at Gnas mutante adenomer utvikle seg raskere til kreft i proksimale colon eller er mer sannsynlig å bli symptomatisk og oppdaget når den er plassert i distal kolon. Disse spørsmålene må bli ytterligere adressert eksperimentelt å skille mellom disse to mulighetene.
