Abstract
Både S100A14 og S100A16 er medlemmer av multifunksjonelle S100 protein familien. Dannelse av homo /heterodimerer anses å være en av de viktigste mekanismene for S100 proteiner for å utføre deres ulike cellulære funksjoner. Ved å ansette en klassisk Gjær to hybrid (Y-2 H) skjerm, identifiserte vi S100A16 som eneste interaksjon partner av S100A14. Denne interaksjonen ble verifisert ved co-immunoprecipitation, dobbel indirekte immunfluorescens og dobbel farging i prøver av muntlig plateepitelkarsinom og normal munnslimhinnen. Den funksjonelle betydningen av denne interaksjonen ble undersøkt ved anvendelse av retrovirale mediert over-ekspresjon og knock-down av disse proteinene i flere cancercellelinjer. Over-ekspresjon og knock-down av S100A14 ført til samtidig opp- og nedregulering av S100A16 protein i cellelinjene som ble undersøkt. Det var imidlertid ingen oppregulering av S100A16 mRNA ved S100A14 over-ekspresjon, noe som indikerer at modulering av S100A16 ekspresjon var ikke på grunn av økt transkripsjonen aktivitet, men muligens ved post-transkripsjonell regulering. I motsetning, over-uttrykk for S100A16 var assosiert verken med oppregulering av S100A14 mRNA eller dets protein, noe som tyder på en enveis regulering mellom S100A14 og S100A16. Cellular behandling med proteinsynteseinhibitor cykloheksimid viste en tidsavhengig intracellulær nedbrytning av både S100A16 og S100A14 proteiner. I tillegg regulering av S100A16 og S100A14 degradering ble funnet å være uavhengig av de klassiske proteasomal og lysosomale veier av protein degradering. Videre studier vil derfor være nødvendig å forstå den funksjonelle betydningen av dette samspillet, og mekanismene for hvordan S100A14 er involvert i reguleringen av S100A16 uttrykk
Citation. Sapkota D, Costea DE, Ibrahim SO, Johannessen AC, Bruland O (2013) S100A14 samhandler med S100A16 og regulerer sitt uttrykk i humane kreftceller. PLoS ONE 8 (9): e76058. doi: 10,1371 /journal.pone.0076058
Redaktør: Zhihua Liu, Chinese Academy of Medical Sciences, Kina
mottatt: 14 mars 2013; Godkjent: 20 august 2013; Publisert: 27.09.2013
Copyright: © 2013 Sapkota et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Universitetet i Bergen (postdoktor fond, DS) og Bergen medisinske forskningsstiftelse (DEC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
S100 protein familien er en multifunksjonell gruppe av EF-hånd kalsium bindende proteiner. Denne familie består av små sure proteiner (10-12 kDa) som er uttrykt bare i virveldyr i en celle og vevsspesifikk måte. Hittil har 25 S100 protein medlemmer blitt beskrevet hos mennesker. Medlemmer av S100-proteinet er blitt vist å regulere en rekke biologiske prosesser som cellesyklus, celle motilitet, signaltransduksjon, protein-fosforylering, transkripsjon, celleoverlevelse og apoptose, relatert til normal utvikling og karsinogenese [1,2]. Til tross for disse ulike funksjonelle roller, trenger S100 proteiner ikke har noen enzymatiske aktiviteter til ansvar for sine cellulære aktiviteter [3,4]. En av mekanismene for de ulike cellulære funksjoner er evnen til flertallet av S100 proteiner som kommuniserer direkte med en rekke andre cellulære proteiner, for derved å modulere deres funksjoner [3]. Flere medlemmer av S100 proteiner kan danne homodimerer /oligomerer (for eksempel: S100A4 [5], S100B [6]), eller heterodimerer (for eksempel: interaksjoner mellom S100A8 og S100A9 [7], mellom S100A4 og S100A1 [8], mellom S100B og S100A6 [6]), og disse homo /heterodimer- formasjonen anses å være viktig for deres cellulære funksjoner.
S100A14 er et nylig tillegg til S100 protein familien [9,10]. Differential uttrykk for S100A14 har blitt rapportert i en rekke humane kreftformer [9,11]. Vi har nylig rapportert en rolle S100A14 i reguleringen av spredning og invasjon av muntlig plateepitelkarsinom (OSCCs) [12,13]. S100A14 ble funnet å modulere ekspresjon av flere molekyler, inkludert p21, MMP1 MMP9 og i OSCC-avledede celler [12,13]. I tillegg har den biologiske rollen dette proteinet blitt rapportert i andre humane kreftformer, som spiserør [14] og tykktarm kreft [15]. Imidlertid er den nøyaktige mekanismen og molekylære signaler S100A14 i human kreft ikke fullt ut forstått. Å være hovedsakelig et membranprotein [12] med N-myristoylation sete ved N-terminus [9], kan det spekulert i at S100A14 kan samhandle med andre proteiner som potensielt er involvert i signaltransduksjon. Følgelig har S100A14 blitt vist å interagere i en kalsiumavhengig måte med nucleobindin [10], et protein som foreslått å være involvert i G-protein-koblede signaltransduksjon [16]. Imidlertid har evne til S100A14 til å danne heterodimerer med andre S100 proteiner ikke blitt undersøkt. I denne studien, viser vi at S100A14 samhandler med en annen S100 protein, den S100A16, og modulerer dens uttrykk i humane kreftcellelinjer.
Materialer og metoder
Cell kultur og behandlinger
Den muntlige plateepitelkarsinom-avledet cellelinjer: CaLH3 [17], H357 [18], VB6 [19] og OSCC1 [13] ble dyrket som beskrevet tidligere [12]. HeLa-celler (ATCC, CCL-2
TM) ble rutinemessig opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (kat: D6429, Sigma) supplementert med 10% FCS. Alle cellelinjer ble dyrket i fuktig miljø med 5% CO
2 ved 37 ° C. Tjuefire timer før behandling med hemmere, 1.0×10
5 til 1.5×10
5 celler per brønn ble sådd i 6-brønners plater. Celler ble behandlet med 0, 50, 100 eller 150 uM proteosomal inhibitor MG-132 (kat: C2211, Sigma) i 5 og 10 timer; 0, 50, 100 eller 150 uM lysosomal inhibitor chloroquin (kat: C6628, Sigma) i 24 timer og 200 ug /ml proteinsynteseinhibitor cykloheksimid (kat: # 239763, Calbiochem) i 0, 3, 5, 7 og 8 timer. Etter behandling ble cellene lysert med 1 x RIPA-buffer og anvendt for immunblotting. Expression of S100A16 protein ble beregnet i forhold til uttrykk av GAPDH nivåer (ved hjelp av Multi Gauge programvare, versjon 3.2, Fujifilm Corporation) og tegnes som prosent S100A16 protein som gjenstår etter cycloheximide behandling (data ikke vist). S100A16 halveringstid (
t
1/2) ble beregnet ved hjelp av GraphPad prisme 5.03 for Windows (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com).
Gjær to- hybrid skjerm (Y-2H skjermen)
de kodende sekvensene til menneske S100A14 ble fusjonert i ramme med GAL4 DNA-bindende domene av pGBT9 vektor for å danne pGBT9-S100A14 agn konstruere. Y-2H screening tjenesten ble kjøpt fra tysk Cancer Research Center, Heidelberg, Tyskland. Kort, PGBT9-S100A14 konstruksjonen ble ko-transfektert med humant cDNA keratinocytt bibliotekene i
Saccharomyces cerevisiae
. Positive kloner ble identifisert ved TRP1 utvalg til 0 mm 3-aminotriazol. Alle positive kloner ble sekvensert ved hjelp av Sanger-sekvensering. Detaljene i pGBT9-S100A14 agn konstruksjon og Y-2H screening-protokoller er tilgjengelige på forespørsel.
Co-immunoprecipitation (Co-IP)
CaLH3 cellene ble lysert i iskald lyseringsbuffer ( 1X RIPA buffer, katt no: 89901, Pierce Biotechnology), supplert med protease (Halt proteasehemmer cocktail kit, katt no: 78410, Pierce Biotechnology) og fosfatase (fosfatase inhibitor cocktail 2, katt no p 5726, Sigma) hemmere. Celleekstrakter ble forbehandlet ved inkubering med protein A /G PLUS-Agarose (kat: sc-2003, Santa Cruz) i 30 minutter. Fem hundre mikrogram forbehandlet celleekstrakt ble inkubert med 3 pg av polyklonalt kanin-anti-humant-S100A14 (kat: 10489-1-AP, Proteintech) eller polyklonalt kanin-anti-humant-S100A16 antistoff (11456-1-AP, Proteintech) for ett time ved 4 ° C på et roterende hjul, i nærvær av 0-2 mM CaCl
2 eller 2 mM CaCl
2 med 5 mM EDTA. Bare lysat (uten antistoff) og polyklonale anti-MMP9 antistoff (kat no: sc-10737, Santa Cruz, isotypematchende IgG) ble benyttet som kontroller for Co-IP. Deretter ble 70 ul av resuspenderte protein A /G PLUS-Agarose (kat: sc-2003, Santa Cruz) ble tilsatt til lysatet-antistoffblanding og inkubert over natten ved 4 ° C på et roterende hjul. Etter inkubering, ble kulene sentrifugert ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten ble kastet. Perlene ble vasket 4 ganger med PBS, på nytt oppslemmet og kokt ved 90 4 ° C i 5 minutter i 30 ul SDS prøvebuffer og immunoblottet med polyklonalt kanin-anti-humant-S100A16 (11456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1 : 500 fortynninger) eller polyklonale kanin anti menneske S100A14 antistoff (10489-1-AP, Proteintech, 1: 1000 fortynninger)
Bygg og transfeksjon av uttrykk og shRNA vektorer
S100A14 ekspresjonsvektor. ble konstruert som tidligere beskrevet [12]. Humane cDNA som koder for S100A16 ble amplifisert ved bruk av primerpar (F: 5 «-ATCCCGCGGCAGGGAGATGTCAGACTGCTA-3′ og R: 5»-TGAGGATCCCTAGCTGCTGCTCTGCTG-3 «) og subklonet inn i pRetroX-IRES-ZsGreen1 retrovirusekspresjonsvektor (Clontech Laboratories, Inc., CA , USA). shRNA målretting
S100A14
mRNA ble bygget ved hjelp av følgende oligonukleotider: shRNA1 (F: 5′- GATCCCCTTGTGTAAGAGCCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGGCTCTTACACAATTTTTGGAAA-3 «; R: 5’AATTTTTCCAAAAATTGTGTAAGAGCCAAAGAATCTCTTGAATTCTTTGGCTCTTACACAAGGG-3»), shRNA2 (F: 5’GATCCCCAGGGTCTTTAAGAACCTACTTCAAGAGA GTAGGTTCTTAAAGACCCTTTTTTGGAAA- 3 «, R: 5′- AATTTTTCCAAAAAAGGGTCTTTAAGAACCTAC TCTCTTGAAGTAGGTTCTTAAAGACCCTGGG-3′), shRNA3 (F: 5»-GATCCCCGAACCTACTTCCTAATCTCTTCAAGAGAGAGATTAGGAAGTAGGTTCTTTTTGGAAA-3 «, R: 5′- AATTTTTCCAAAAA GAACCTACTTCCTAATCTCTCTCTTGAAGAGATTAGGAAGTAGGTTCGGG-3»). Oligonukleotider ble glødet og satt inn i RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express ekspresjonsvektor (kat. Nr: 632487, Clonetech). shRNA målretting
LacZ
genet ble brukt som en kontroll for S100A14-shRNAs. Kreft cellelinjer ble infisert med retrovirus som stammer fra emballasjen (Phoenix A) celler, sortert (GFP /DsRed som en markør), spredte, verifisert for over-uttrykk og knockdown av de respektive proteiner og brukes for funksjonelle analyser.
RNA ekstraksjon, cDNA syntese og kvantitativ RT-PCT (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra kreftcellelinjer ved hjelp RNeasy bindevev mini kit-protokollen (katt no: 74704, Qiagen Inc. , Valencia, CA, USA). Etter produsentens instruksjoner, ble 600 nanogram total RNA konvertert til cDNA ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv Kit system (kat no: 4368814, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle QRT-PCR-amplifikasjoner ble utført på ABI Prism Sequence Detector 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, USA) som tidligere beskrevet [12]. TaqMan analysen for
S100A16 plakater (Hs00293488_m1) og SYBR grønn basert QRT-PCR (med de samme primerpar som for bygging av S100A14 ekspresjonsvektor) ble utført for å kvantifisere
S100A16 Hotell og
S100A14
mRNA i kreftcellelinjer. Sammen 2
-ΔΔ Ct metoden ble brukt til å kvantifisere den relative mRNA uttrykk.
Immun
Twenty 5-40 mikrogram av protein ble løst i NuPAGE® Novex 4-12% eller 10 % Bis-TrisTris gel (Life Technologies, NY, USA) i NuPAGE® MOPS /MES SDS buffer (Life Technologies, NY, USA) og immunoblottet med polyklonale kanin anti menneske S100A14 (10489-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 1000 fortynninger), polyklonale kanin anti menneske S100A16 (11456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 500 fortynninger) og monoklonale mus anti human-p53 (sc-263, Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA, 1: 1000 fortynninger) følgende standard western blot protokollen. Anti-GAPDH (SC-25778, Santa Cruz, 1: 5000 fortynning) ble anvendt som en kontroll lasting. Blottene ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Supersignal
® West Pico, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) og bildene ble oppdaget på en Fujifilm Las-4000 scanner
Double indirekte immunfluorescens (DIF)
bruk av OSCCs og deres tilsvarende normal slimhinne for DIF og immunhistokjemi ble godkjent av Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk, Vest-Norge. Skriftlig samtykke ble innhentet fra deltakeren i studien. Fem mikrometer deler av OSCCs og deres tilsvarende normal slimhinne ble de-paraffinized, rehydrert følgende standard prosedyrer og varme-indusert epitop gjenfinning ble utført i Tris-EDTA buffer (pH 9,0) ved hjelp av mikrobølger (kat no: NN-L564W, Panasonic, Osaka , Japan). Etterpå ble først primære antistoff (polyklonalt kanin-anti-S100A16 antistoff, 11456-1-AP, Proteintech, 1:50 fortynninger) påført i 1 time ved værelsestemperatur og vasket. Prøvene ble inkubert med Fab-fragment geit anti-kanin IgG (kat 111-007-003, Jackson Immunoresearch, 1:50 fortynninger) i 2 timer, for å tillate veksling av kanin IgG for å geit Fab [20]. Deretter ble prøvene ble inkubert med muse-anti-GoatDyLight 488IgG (kat 205-485-108, Jackson Immunoresearch, 1:50 fortynninger) sekundært antistoff i 1 time, vasket, blokkert med 10% geiteserum i 1 time og den andre primære antistoff , polyklonalt kanin-anti-S100A14 (kat: 10489-1-AP, Proteintech, 1: 600 fortynning), ble påført i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking, sekundært antistoff geit anti-kanin Alexa fluor
® 568 (kat: A-11011, Invitrogen, 1: 200 fortynninger) ble applisert i 1 time, vasket og objektglassene ble montert i forlenge
® Gold antifade reagens med DAPI (kat no: P36935, Invitrogen). Prøvene ble undersøkt ved hjelp av Leica TCS SP2 AOBS (Leica Microsystems, Tyskland) konfokal laser mikroskop.
Uisolerte og immunhistokjemi (IHC)
Enkelt og dobbel IHC ble utført på seriesnitt av OSCCs og deres korresponderende normal slimhinne. Enkelt IHC for S100A16 og S100A14 ble utført som beskrevet tidligere [12]. For dobbel IHC, fem mikrometer seksjoner ble de-paraffinized, rehydrert følgende standard prosedyrer og varme-indusert epitop gjenfinning ble utført i Tris-EDTA buffer (pH 9,0) ved hjelp av mikrobølger (katt nr: NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japan) . Etter blokkering med peroksydase blokk og 10% geiteserum ble snittene inkubert med polyklonalt kanin-anti-S100A16 (kat: 11456-1-AP, Proteintech, fortynning 1: 200) i 1 time ved romtemperatur, vasket og anti-kanin sekundært antistoff konjugert med pepperrot-peroksidase-merket polymer (kat: K4011, DAKO, Golstrup, DK) ble påført, og reaksjonen ble visualisert ved anvendelse ImmPACT VIP (kat: SK-4605, Vectorlabs, California, USA) som enzym-substrat, noe som resulterer i en purpur reaksjonsprodukt. For å forhindre kryss-reaktivitet med påfølgende immunohistokjemiske reaksjonen ble antistoffene ifølge de første reaksjonene denaturert ved å varme opp prøvene i pH 6,0 Target Retrieval Buffer (kat: S1699, DAKO, Golstrup, DK) ved hjelp av mikrobølger (1000 watt i 2 minutter og 250 watt for fem og et halvt minutt, NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japan) [21]. Etterpå seksjoner ble inkubert med peroksydase blokk og 10% geiteserum nok en gang, og den andre primære antistoff (polyklonalt kanin-anti-S100A14, 10489-1-AP, Proteintech, fortynning 1: 1400) ble påført og vasket. Deretter ble anti-kanin-sekundært antistoff konjugert med pepperrot-peroksidase-merket polymer (kat: K4011, DAKO, Golstrup, DK) ble påført og visualisert med ImmPACT SG (kat: SK-4705, Vectorlabs, California, USA) som resulterer i en grå reaksjonsproduktet. Prøvene ble deretter kontra med hematoksylin (kat no: S3301, DAKO, Golstrup, DK), dehydrert og montert med EuKit monteringsmedium. Prøvene ble undersøkt ved hjelp av Leica DMLB mikroskop.
statistikker
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). For statistiske analyser, Student’s-
t
test (paret) ble utført ved hjelp av GraphPad prisme 5.03 for Windows (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com), med signifikansnivå satt til 5% .
Resultater
S100A16 ble identifisert som et samspill partner av S100A14 både
in vivo
i gjærceller og
in vitro
i munnkreft avledet celler
for å identifisere samspill partnere av S100A14, en menneskelig cDNA keratinocyte bibliotek ble screenet med pGBT9-S100A14 agn konstruere i
Saccharomyces cerevisiae
. Ut av 54 positive kloner sekvensert, ble menneske S100A16 identifisert 53 ganger. DCAF8 ble identifisert til å være en falsk positiv samhandling partner av S100A14. Interaksjon mellom S100A14 og S100A16 proteiner ble bekreftet av co-immunoprecipitation hjelp av oral cancer avledet CaLH3 cellelinje (figur 1A). Selv om tidligere rapporter viste forbedret samhandling mellom andre S100 proteiner i nærvær av økende Ca
2 + konsentrasjoner, kunne vi ikke gjenkjenner at økt immunoprecipitation mellom S100A14 og S100A16 med økende Ca
2 + konsentrasjoner (0,5 og 2 mm av CaCl
2) (figur 1A). Imidlertid ble det ikke observert interaksjon mellom S100A14 og S100A16 når 5mM av toverdige metallioner chelator EDTA ble brukt sammen med 2 mM av CaCl
2 (figur 1A). Omvendt co-immunoprecipitation analyse ved hjelp av spesifikke antistoffer for S100A16 ytterligere bekreftet samspillet mellom S100A14 og S100A16 proteiner (Figur 1b).
Fem hundre mikrogram pre-ryddet celleekstrakt fra CaLH3 celler ble inkubert med anti-S100A14 antistoff i nærvær av 0-2 mM CaCl
2 eller 2 mM CaCl
2 med 5 mM EDTA (A) eller anti-S100A16 antistoff (B), etterfulgt av inkubasjon med protein A /G PLUS-agarose. Immunkompleksene ble immunoblottet med anti-S100A16 (A) eller anti-S100A14 antistoff (B). Bare lysat (uten antistoff) og anti-MMP9 antistoff ble brukt som kontroller for Co-IP. (A) M, vekt markør molekylær; lane 1, inngang; lane 2, bare lysat; spor 3, kontrollere anti-MMP9 antistoff; baner 4-7 (anti-S100A14 antistoff): lane 4, 0 mM CaCl
2; felt 5, 0,5 mM CaCl
2; kjørefelt 6, 2 mM CaCl
2; spor 7, 2 mM CaCl
2 med 5 mM EDTA. (B) lane 1, inngang; lane 2, bare lysat; spor 3, kontrollere anti-MMP9 antistoff; lane 4, anti-S100A16 antistoff med 0 mm CaCl
2.
S100A14 co-lokaliserer med S100A16 i prøver av OSCCs og normal munnslimhinne
DIF og dobbel IHC var utført i OSCCs og deres tilsvarende normal slimhinne for å undersøke den sub-cellulære lokalisering av S100A14 og S100A16. DIF viste membranøs ko-lokalisering av S100A16 og S100A14 proteiner i epitelceller både normal munnslimhinnen (figur 2A1-A4) og OSCC (figur 2B1-B4). Parallelt med disse resultatene, ble membran samlokalisering av disse proteinene også observert på seriesnitt av normal munnslimhinnen (figur 2C1-C3) og i de invaderende øya OSCC (vel differensiert lesjon) (figur 2D1-D3) ved enkelt og dobbel IHC.
Cellular lokalisering av S100A14 og S100A16 ble undersøkt ved å utføre DIF og IHC i de delene av formalinfiksert og parafininnebygd OSCC og normale munnslimhinnen vev. Overveiende membran lokalisering av S100A16 (grønn), S100A14 (rød) og S100A16 /A14 (gul) ble visualisert i epitelceller normal slimhinne (A1-A4) og OSCC (B1-B4) vev ved DIF (Epth, epitel, CT , bindevev). Tilsvarende med enkel og dobbel IHC på seriesnitt, hovedsakelig membran uttrykk for S100A16 (lilla), S100A14 (grå) og S100A16 /A14 (blandet farge) ble påvist i normal slimhinne (C1-C3) og i OSCC (D1 D3).
S100A16 protein, men ikke mRNA uttrykk er regulert av S100A14 i ulike menneskelige kreftcellelinjer
den biologiske betydningen av samspillet mellom S100A14 og S100A16 ble neste undersøkt av over-uttrykker S100A14 i flere humane kreftcellelinjer (CaLH3, VB6, H357, OSCC1 og HeLa) ved anvendelse av en retroviral mediert genekspresjon strategi. S100A16 proteinnivåer ble funnet å være økt i alle cellelinjene undersøkt etter over-ekspresjon av S100A14 (figur 3A). I tillegg shRNA mediert knock-down av S100A14 var forbundet med undertrykkelse av S100A16 protein i CaLH3 og OSCC1 cellelinjer (figur 3B). Imidlertid var det ingen økning i mRNA-ekspresjonsnivåene av S100A16 i disse S100A14 overuttrykkende kreftcellelinjer (figur 3C).
(A) Retroviral mediert over-ekspresjon av S100A14 ble assosiert med samtidig opp- regulering av S100A16 protein i CaLH3, VB6, H357, OSCC1 og HeLa cellelinjer (-, kontroll konstruksjon; +, S100A14 uttrykk konstruere). (B) I tillegg, shRNA-mediert knock-down av S100A14 i CaLH3 og OSCC1 cellelinjer som ble assosiert med nedregulering av S100A16 protein (-, kontroll konstruksjon; +, konstruerer S100A14 shRNA). (C) Det var imidlertid ingen effekt i mRNA uttrykk nivåer av
S100A16
av over-uttrykke S100A14 i CaLH3, VB6, og H357 cellelinjer.
S100A14 Hotell og
S100A16
mRNA uttrykk nivåer ble normalisert til
GAPDH
mRNA uttrykk. Feilfelt representerer SEM av 3 biologiske replikater gjort i 3 tekniske replikater. Student’s-
t
test (paret) ble utført for statistisk analyse.
S100A16 regulerer ikke uttrykk for
S100A14
mRNA eller protein i menneskelig kreft celle- linjer
Vi neste undersøkt om S100A16 overuttrykk er også assosiert med samtidig endring i uttrykket av S100A14 i kreftcellelinjer. Det var ingen merkbar forandring hverken i mRNA (figur 4A) eller proteinnivåer (figur 4b) av S100A14 etter over-ekspresjon av S100A16 ved hjelp av retrovirale ekspresjonskonstruksjoner.
Det var ingen effekt på mRNA (A) eller protein (B) uttrykk nivåer av S100A14 av retroviral mediert over-uttrykk for S100A16 i CaLH3 og H357 cellelinjer (-, kontroll konstruksjon; +, S100A16 uttrykk konstruere).
S100A14 Hotell og
S100A16
mRNA uttrykk nivåer ble normalisert til
GAPDH
mRNA uttrykk. Feilfelt representerer SEM av 3 biologiske replikater gjort i 3 tekniske replikater. Student’s-
t
test (paret) ble utført for statistisk analyse.
Både S100A16 og S100A14 proteiner er degradert intracellulært av mekanismen (e) uavhengig av proteasomal og lysosomale trasé
Ved hjelp av sykloheksimid behandling, tidsavhengig nedbryting av S100A16 og S100A14 ble observert både i kontroll og S100A14 over-uttrykker CaLH3-celler (figur 5A). Det var ikke en signifikant forskjell i S100A16 halveringstid (
t
1/2) mellom styringen og S100A14 over-uttrykker CaLH3 celler (~ 4,8 timer kontra ~ 5,0 timer) (figur 5A). Proteasomal og lysosomale trasé er involvert i nedbrytningen av flertallet av intracellulære proteiner. Den proteasomal inhibitor MG-132 effektivt blokkerer proteolytiske aktiviteten til proteasome [22] og det lysosomale inhibitor chloroquin hemmer lysosomale hydrolaser ved å redusere forsuring av endosomal /lysosomale avdelinger [23]. Ved å behandle de CaLH3 og HeLa celler med proteasomal (MG-132) og lysosomale (Chloroquin) hemmere, ved siden undersøkte vi om disse banene var involvert i nedbrytningen av S100A16. Ingen vesentlig økning i nivåene av S100A16 ble observert etter hemming av proteasomal (data for 10 timers behandling med MG-132 ikke vist) (figur 5B) eller lysosomale baner (figur 5C). Nivået av p53, anvendt som en positiv kontroll for proteasomal inhiberings-forsøkene ble øket som forventet med MG-132 behandling (figur 5B). I tillegg ble ingen merkbar oppregulering av S100A16 og S100A14 observert enten ved kontroll eller i den S100A14 overuttrykkende CaLH3 celler med MG-132 (figur 5D) eller chloroquin behandlinger (figur 5E).
(A ) Kontroll og S100A14 overuttrykkende CaLH3-celler ble behandlet med proteinsynteseinhibitor cykloheksimid i en tidsforløpet (0, 3, 5, 7 og 8 timer) og hele cellelysatene ble immunoblottet med anti-S100A16 og -S100A14 antistoffer. Relativ S100A16 uttrykket (normalisert til GAPDH protein ekspresjon) ble plottet mot tid-kurs og halv-liv (
t
1/2) ble beregnet for både kontroll og S100A14 over-uttrykker CaLH3-celler (data ikke vist). -, Kontroll konstruksjon; +, S100A16 uttrykk konstruere. Cyclo, cykloheksimid.
(B) CaLH3 og HeLa-cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av inhibitor proteasomal MG-132 (0-150 uM) i 5 og 10 timer (data for 10 timer ikke vist) og helcellelysater ble immunoblottet med anti-S100A16 og -p53-antistoffer. Behandling med MG-132 er forbundet med opp-regulering av p53 (anvendt som en positiv kontroll for proteasomal inhiberings-forsøkene), men ikke S100A16 i begge cellelinjer.
(C) CaLH3 og HeLa-cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av inhibitor lysosomal chloroquin (0-150 uM) i 24 timer og hele cellelysater ble immunoblottet med anti-S100A16 antistoff. Chloroquin behandling er ikke assosiert med endring i S100A16 ekspresjon i begge cellelinjer. Konsentrasjoner høyere enn 50 uM av chloroquin resulterte i overdreven HeLa celledød og følgelig ikke brukes i forsøket. Klor, chloroquin.
(D) Kontroll og S100A14 overuttrykkende CaLH3 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av inhibitor proteasomal MG-132 (0-150 uM) i 5 timer og hele cellelysater ble immunoblottet med anti- S100A16 og -S100A14 antistoffer.
(E) Kontroll og S100A14 overuttrykkende CaLH3 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av inhibitor lysosomal chloroquin (0-150 uM) i 24 timer og hele cellelysater ble immunoblottet med anti- S100A16 og -S100A14 antistoffer. Klor, chloroquin.
Diskusjoner
Til tross for de ulike funksjonelle roller spilt av S100 proteiner, disse proteinene ikke har noen enzymatisk aktivitet til ansvar for sine ulike cellulære funksjoner [3,4 ]. En av de mekanismer som S100 proteinene utfører sine varierte cellulære funksjoner er gjennom samspill med og modulerende funksjonene til andre effektor proteiner. Nylig har vi [12,13] og andre [14,15] vist en funksjonell rolle S100A14 i menneskelig kreft. Involvering av S100A14 i reguleringen av oral cancer celleproliferasjon og invasjon, ved modulering av ekspresjon av flere molekyler, inkludert p21, MMP1 MMP9 og ble rapportert av våre nylige studier [12,13]. Disse funnene førte oss til å undersøke mulige interaksjonspartnere S100A14 som kunne modulerer cellulære funksjoner. Ved hjelp av Y-2H-skjermen, identifiserte vi S100A16, et annet medlem av S100 protein familien, som den eneste sanne samspillet partner av S100A14. Dette funn var noe overraskende av flere grunner. For det første vurderer sin flere funksjoner i tumorigenesis med samtidig modulering av uttrykk av flere andre molekyler, S100A14 var ventet å samhandle med mange cellulære proteiner for å utføre de forskjellige funksjonene. Dernest nærvær av N-myristoylation sete ved N-terminalen av proteinet S100A14 tyder på at dette protein kan kommunisere med andre proteiner som potensielt er involvert i signaltransduksjon [9]. For det tredje, S100A14 har allerede blitt vist å interagere med andre cellulære proteiner som nucleobindin [10] og RAGE [14], men disse proteiner ble ikke detektert i det aktuelle Y-2H-skjermen. Men resultatene av vår nåværende Y-2H-skjermen er i samsvar med tidligere Y-2H skjermer for ulike S100 proteiner. I likhet med våre funn, i samspill partnere for andre S100 proteiner fra tidligere Y-2H-skjermer er også i stor grad dominert av S100 protein isoform (er) (anmeldt i 24). En av de foreslåtte årsakene til S100 isoform dominert samhandling i Y-2H kan være en funksjon av kontrollert intracellulær Ca
2+ konsentrasjon (200nm) i gjærceller [25] som er langt under kalsium
K
d-verdier på mange S100 proteiner (10-50 um) og som kan begrense interaksjonen mellom S100 byttedyr og dets ikke-S100 interaksjonspartnere som krever streng Ca
2+ konsentrasjon for interaksjonen for å finne sted. Ikke desto mindre, i motsetning til mange andre S100 proteiner, har strukturelle analyser antydet at både S100A14 og S100A16 er lav affinitet Ca
2 + ion bindemidler med minimal konformasjonsendringer etter binding med Ca
2 + [26,27] og følgelig streng Ca
2+ konsentrasjon er kanskje ikke være nødvendig for vekselvirkningen mellom disse to proteiner. Faktisk, ved å øke Ca
2+ konsentrasjon, økt immunoutfelling ble ikke observert mellom S100A14 og S100A16 i denne studien (figur 1A). Men ingen interaksjon ble påvist mellom S100A14 og S100A16 når 5mM av toverdige metallioner chelator EDTA ble brukt (figur 1A). Tatt sammen, disse funnene antyder at interaksjonen mellom S100A14 og S100A16 er avhengig av de basale nivåene av Ca
2 + og muligens andre divalente metallioner i cellene og å øke konsentrasjonen av Ca
2+ ikke nødvendigvis forbedre interaksjon muligens fordi både S100A14 og S100A16 er dårlig Ca
2 + permer med semi-åpen konformasjon selv i apo-stat og dette konformasjon kanskje ikke nødvendigvis endres selv etter binding Ca
2 + ioner.
i samsvar med funnene i Y-2H og co-immunoprecipitation, ble samlokalisert uttrykk for S100A14 og S100A16 observert i OSCCs og tilsvarende normal slimhinne (figur 2), noe som indikerer en mulig funksjonell betydning av dette samspillet. Faktisk, over-ekspresjon og knock-down av S100A14 i flere cancercellelinjer som var assosiert med samtidig opp- og nedregulering av S100A16 protein (figur 3A og B), men ikke mRNA (figur 3C). Disse funnene tyder på at S100A14 regulerer uttrykket av S100A16 ikke på transkripsjonsnivået, men muligens med post-transcriptional eller translasjonsforskning regulering. I motsetning, ble ingen merkbar effekt observert både på mRNA og proteinnivå S100A14 når S100A16 var over-uttrykt i cancercellelinjer (figur 4A og B), noe som tyder på en ensrettet regulering mellom S100A14 og S100A16 hvor bare S100A14 regulerer protein overflod av S100A16. I likhet med S100A14 har nyere studier vist differensial uttrykk for S100A16 i ulike menneskelige kreftformer, noe som tyder på en rolle av dette proteinet i humane kreftformer [28]. Tatt i betraktning den rolle S100A14 i oral cancer celleproliferasjon og invasjon [12,13], og dens evne til å regulere ekspresjonen av S100A16, kan det spekulert i at S100A14 \\ S100A16 heterodimer kan ha en funksjonell betydning i humane kreftceller.
Etter å ha observert en økning bare i S100A16 protein og ikke i
S100A16
mRNA uttrykk når S100A14 var over-uttrykt i kreftcellene, spekulerte vi at S100A14 kan være involvert i reguleringen av S100A16 protein degradering.
