Abstract
Biomarkører og nye terapeutiske mål haster tykktarmskreft (CRC). Pseudo-tyrosin-kinase-reseptor 7 (PTK7) er involvert i celle plane polaritet, og det er deregulert i forskjellige maligniteter, inkludert CRC. Men lite er kjent om sin protein uttrykk i menneskelig CRC, eller om en mulig sammenheng i sitt uttrykk med kliniske endepunkter. Ved hjelp av en klinisk kommenterte Tissue microarray (TMA) produsert fra fra 192 sammenhengende CRC pasienter behandlet ved første operasjonen, undersøkte vi PTK7 uttrykk ved immunhistokjemi i tumorvevet og matchet normal slimhinner, og korrelert sitt uttrykk med klinisk-patologisk funksjoner og pasient utfall. PTK7 uttømming av spesifikk shRNA i HCT116 og HCT15 CRC cellelinjer ble funnet å påvirke celledeling, motstand mot narkotika og cellemigrasjon. Tumorvekst og metastatisk fenotype ble undersøkt
in vivo
bruker en xenograft mus modell av CRC celler med modulert uttrykk for PTK7 nivåer. PTK7 var signifikant oppregulert i CRC vev, sammenlignet med tilsvarende friske slimhinner, og signifikant overekspresjon ble funnet i 34% av pasientene. PTK7 overekspresjon var signifikant assosiert med en redusert metastase overlevelse i ikke-metastaserende pasienter. I HCT116 og HCT15 celler, shRNA PTK7 redusert migrasjon men ikke påvirke celledeling og motstand mot narkotika. I en xenograft mus av HCT15 celler, nedregulering av PTK7 ført til redusert tumorvekst, mens dens overekspresjon i PTK7-negative kreftceller førte til økte metastatiske arrangementer. PTK7 uttrykk representerer således en potensiell prognostisk biomarkør og en roman terapeutisk mål i CRC
Citation. LHOUMEAU A-C, Martinez S, Boher J-M, Monges G, Castellano R, Goubard A, et al. (2015) Overuttrykte av Promigratory og Prometastatic PTK7 Receptor er assosiert med en negativ klinisk utfall i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (5): e0123768. doi: 10,1371 /journal.pone.0123768
Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
mottatt: 02.10.2014; Godkjent: 21 februar 2015; Publisert: 11 mai 2015
Copyright: © 2015 LHOUMEAU et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av La Ligue Nationale Contre le Cancer (Etikett Ligue JPB) https://www.ligue-cancer.net/, Fondation pour la recherche MEDICALE (ACL) https://www.frm.org/, Region PACA (SM) https://www.regionpaca.fr/, SIRIC (Inca-DGOS-Inserm 6038) https://www.oncopaca.org /fr /. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Med 447 000 tilfeller og 215 000 dødsfall per år i Europa, tykktarmskreft (CRC) er fortsatt et stort folkehelseproblem [1,2]. Integrering av 5-fram og oksaliplatinbasert adjuvant kjemoterapi til kirurgisk reseksjon i node positive-pasienter har bedret overlevelse [3,4], men et betydelig antall av disse pasientene fortsatt slutt tilbakefall og dø av metastatisk sykdom. På samme tid, er node-negative pasienter vanligvis ikke behandles med adjuvant systemisk behandling, mens noen av dem kan ha nytte av denne strategien [5]. Dermed er identifisering av gyldige og robuste biomarkører som kan skille en gruppe pasienter betydelig risiko for tilbakefall presserende behov. I tillegg, selv om noen molekylære målrettede behandlingsformer har bidratt til å øke overlevelsen ved metastatisk CRC [6-9], ingen av dem har vist seg å bedre overlevelse ved adjuvant behandling [10,11]. Derfor er det fortsatt ivrig nødvendig å identifisere molekylære aktører som spiller en relevant rolle i tykktarmskreft biologi og kan tjene som mål for nye biologiske behandling.
celleoverflatereseptor PTK7, også kjent som colon carcinoma kinase-4 (CCK-4), er en evolusjonær konservert medlem av reseptor-tyrosinkinase-superfamilien, som først ble identifisert i humane normale melanocytter [12] og i human colon carcinoma [13]. Består av syv ekstracellulære immunoglobulin-domener, et transmembranområde og et intracellulært tyrosinkinase-domene, det har en defekt kinase-aktivitet og ingen kjent ligand. Selv om den eksakte biologiske rolle er uklar, har nyere bevis knyttet PTK7 til planar celle polaritet (PCP) pathway [14]. Mens apico-basal polaritet organiserer epitelisk cellebinding langs et xy-aksen, styrer PCP posisjonen av celler i planet for en epitelial struktur, som garanterer at de er orientert i samme retning, og spiller derved en stor rolle i forskjellige utviklingsmessige prosesser herunder epitelial celledifferensiering og bevegelser [15]. Av notatet, kan deregulering av PCP føre til ulike patologiske lidelser, inkludert kreft. Velkjente regulatorer av PCP omfatter Wnt ligander og frizzled (FZ) reseptorer, som aktiverer den Dishevelled adapter på plasmamembranen, og setter i gang den såkalte Wnt veien, enten i sin kanoniske (β-catenin avhengig) eller ikke-kanoniske (β-catenin-uavhengig) organisasjon [16]. PTK7 ble foreslått å regulere PCP siden mutasjon i Xenopus eller i mus førte til åpen PCP-relaterte utviklingsforstyrrelser, inkludert neural tube nedleggelse defekter [17,18]. I tillegg ble PTK7 vist til direkte kontakt med Dishevelled, som fører til rekruttering på membranen og påfølgende fosforylering /aktivering av FZ7 [19]. Vi og andre har vist at PTK7 kan også aktivere den kanoniske Wnt banen i en kinase domene avhengig måte [18,20].
Nylig PTK7 ble funnet å være overuttrykt i ulike kreft hos mennesker, inkludert epiteltumorer slike som mage, bryst, spiserør, gallekanalen og lunge kreft [21-26], men også i sarkom [27] og i hematologiske maligniteter, inkludert akutt og kronisk myelogen leukemi [28-30]. Overraskende, mens PTK7 ble først beskrevet i humane tykktarmskreft cellelinjer [13], ingen data er for tiden om sin protein uttrykk i CRC vev fra klinisk kommenterte pasienter. Derfor har vi vurdert PTK7 protein uttrykk på en TMA sammensatt av CRC primære vev og tilsvarende friske slimhinner, og vurdert mulige sammenhenger i sitt uttrykk med konvensjonelle kliniske og patologiske parametere, samt med pasientens utfall. PTK7 ekspresjon ble således vist å være assosiert med metastatisk utbytte og redusert overlevelse hos ikke-metastatiske CRC-pasienter. Vi deretter undersøkt virkningen av modulerende uttrykk i prekliniske modeller og funnet ut at PTK7 induserer en pro-trekkfugl og pro-metastatisk fenotype, i samsvar med kliniske data.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av Institut Paoli-Calmettes (IPC) Institutional Review Board (IRB, Comité d’Orientering strategique, COS). IRB ikke anser som obligatorisk å innhente informert samtykke fra pasientene, men data ble analysert etter all pasientinformasjon er fullstendig anonymisert. For dyr forskning, ble alle eksperimentene utført i samsvar med de franske Retningslinjer for dyr håndtering og godkjent av etikkomiteen i forsøk med dyr av Marseille (C2EA-14). Dyrene ble plassert i Spesifikke patogenfrie forhold, individuelt ventilerte bur (Tecniplast, Frankrike, Sealsafe Plus Mouse-mus IVC Green Line) med 4-5 ledsagere.
Alle mus fikk fri tilgang til autoklaveres og filtrert vann og bestrålt mat i en 10-14-timers lys /mørke syklus, med en romtemperatur på 21 ± 2 ° C og luftfuktighet på 55 ± 15%. Alle bur inneholdt tre spon, sengetøy og en poppel treull reir (Anibed, Frankrike) for miljøberikelse.
I løpet av den postoperative perioden, ble smertene lettet etter en subkutan injeksjon meloksikam (Metacam injeksjon, Boehringer Ingelheim, 1mg /kg en gang daglig i 3 dager) og Baytril (Bayer) -supplemented vann tillegg ble administrert til mus i 7 dager før xenograft for forhindring av infeksjon i løpet av 3 uker etter operasjonen.
human avliving av mus ble utført ved hjelp inhalert karbondioksid anestesi i samsvar med etikkomiteen i forsøk med dyr av Marseille (C2EA-14)
pasienter og vev
Person vev fra 192 pasienter fortløpende med etapper i til IV tykktarmskreft (CRC ) behandlet ved vår institusjon (Institut Paoli-Calmettes, Marseille, Frankrike) etter innledende kirurgisk reseksjon ble samlet mellom 1990 og 1998. Staging brukte amerikanske Joint Committee on Cancer kriterier [31]. Alle prøver ble formalinfiksert og parafininnebygd, og evaluert i Biopathology avdelingen. Pasientene fikk adjuvant 5-FU-basert kjemoterapi i tilfelle av spredning til lymfeknuter eller metastaserende sykdom i henhold til standard anbefalinger. Etter fullført behandling, ble overvåking utført ved 3-måneders intervaller for de første 2 årene, og ved 6-måneders intervaller etterpå. Pasientene ble overvåket for metastatisk tilbakefall av klinisk undersøkelse og blodprøver, årlig brystet X-ray og lever ultralyd og /eller CT scan. Kliniske og patologisk funksjoner samt utfallet egenskaper ble hentet fra vår prospektivt opprettholdt institusjonelle database. I tillegg til å undersøke mulige forskjeller i PTK7 uttrykk mellom metastatisk og primære vev, 7 PTK7-positive levermetastaser og paret primære CRC ble valgt for komparativ immunhistokjemi.
microarray for bygging
TMA ble forberedt som tidligere beskrevet [32,33]. For hver prøve ble 3 representative områder valgt fra en hematoksylin-eosin-fargede snitt av et donor-blokk. Kjerne sylindere med en diameter på 0,6 mm ble stanset og satt på 3 separate mottaker parafinblokker ved hjelp av en bestemt oppstillingsanordningen (Beecher Instrumenter, Silver Spring, MD, USA). Mottakeren blokken inneholdt par av tumor og normal slimhinne, samt kontroll normale og godartede vev (tynntarm, adenomer) og cellelinje pellets. Fem mikrometer deler av den resulterende TMA blokk ble anvendt for IHC-analyse etter overføring på glassplater. To tykktarmskreftcellelinjer (CaCo2, HT29) og en magekreft cellelinje (HGT1) ble anvendt som kontroller.
Immunhistokjemi analyse
For PTK7 farging geite-IgG, anti-human /mus /rat PTK7 /CCK-4 affinitetsrensede polyklonale antistoff ble hentet fra R Dako) i 25 minutter og deretter med streptavidin-konjugert peroxydase (Dako REALkit). Diaminobenzidin ble anvendt som kromogen. Haematoxylin ble brukt for kontra, og Dekk ble montert ved hjelp Curemount (Instrumedics, Hackensack, USA) løsning. De ble undersøkt under et lysmikroskop av to patologer (GM, FP). Følgende parametre ble tatt opp: fargeintensitet (0: fraværende, 1: lav, 2: Middels, 3: høy)., Prosentandel av fargede celler, og flekker funksjoner (nucleus, membran eller cytoplasma flekker)
For Ki67 flekker, mus IgG, anti-human Ki67 Clone MIB-1 fra Dako ble brukt som tidligere beskrevet [34].
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
CRC cellelinjer, HCT116 og HCT15 ble gitt av ATCC. HCT116 HCT15 og cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin.
kultur av L-celler, Wnt5a /Wnt3a produksjon, og B16F10 in vivo-metastase-analyser
Se S1 Materialer og metoder.
design av spesifikk shRNA og produksjon av viruspartikler
shRNA sekvenser spesifikk for PTK7 konstruksjonene ble utformet som beskrevet i S1 Materialer og metoder. Disse oligonukleotider ble kjøpt fra Invitrogen, Frankrike og klonet inn pLKO.1-GFP vektor ved hjelp AgeI og EcoRI restriksjonssetet. En rykke ut ikke-måls shRNA ble brukt som kontroll
Viral partikler som inneholder shRNA ble produsert ved transient transfeksjon av HEK 293T celler med emballasje system vektorer (PSPAX. Plasmid 12260 og VSVG: plasmid 12259, Addgene, Cambridge, USA ) og pLKO.1-shRNAs-GFP. Virale supernatanter ble høstet 48 timer etter transfeksjon, ble filtrert og anvendt for å infisere HCT 116 og HCT15 celler i nærvær av 4 ug /ml polybrene. Infeksjon effektivitet ble kontrollert ved GFP-ekspresjon i infiserte celler. Cellene ble sortert ved flowcytometri hjelp GFP uttrykk (BD aria2, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) og shRNA effektivitet ble kontrollert av Western Blot og QRT-PCR-analyse.
Protein utvinning og immunobloting
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% glyserol, 1% Triton X-100, 25 mM NaF, 10 uM ZnCl2) supplert med 0,5 mm fenylmetylsulfonylfluorid fuoride (PMSF), 1 mM ortovanadat, 1 mM β-glycerofosfat og en protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, USA). Lysatene ble sentrifugert ved 13000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Pelletene ble fjernet og proteinkonsentrasjonen ble justert ved bruk av Bradford-analyse (Bio-Rad). Proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulosefiltere, blokkert i 1 time ved romtemperatur i Tris-bufret saltløsning /5% fettfri tørrmelk /0,1% Tween 20, og blottet over natten med primære antistoffer i blokkeringsløsning (rotte monoklonalt anti-PTK7 generert i laboratoriet, mus monoklonalt antistoff αTubulin, Sigma-Aldrich, USA). Etter omfattende vaskinger i TBS /0,1% Tween 20, ble filtrene inkubert i 1 time ved romtemperatur (RT) med et HRP-konjugert, sekundært antistoff før den ble avdekket med en forbedret kjemiluminescens substrat (West Pico, Thermo Scientific, USA). Kjøpet ble utført med en G-BOX imager (Ozyme, Frankrike).
Kvantitativ RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp RNeasy mini kit (Qyagen, Nederland). RNA-pelletene ble lufttørket og oppløst i ultrarent vann. cDNA ble generert med høy kapasitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Bio-systemer, USA) etter produsentens anvisninger. SYBR forblanding ble fremstilt med 10-PM primere og 1 ul cDNA mal. QRT-PCR på 96-brønners optiske plater ble utført ved hjelp av de ovennevnte reagenser, og produktene ble analysert på en ABI Prism 7500 (Applied Bio-Systems, USA). Graden av ekspresjon av PTK7 ble normalisert til GAPDH og representert som en relativ uttrykk. Prober var som følger: PTK7 fwd 5′- CAGTTCCTGAGG ATTTCCAAGAG -3 og rev 5′-TGCATAGGGCCA CCT TC-3 «; GAPDH FWD 5»-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3 «og 5′-rev AAGCTTCCCGTTCTCAG-3»
celleproliferasjonsanalyse
celle proliferasjon ble bedømt ved CellTiter 96 assay (Promega, USA). Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler i 96-brønners plater og inkubert i DMEM inneholdende 10% FCS for den angitte tid. Deretter Platene ble inkubert med CellTiter 96 ved 37 ° C i 2 timer. Absorbans ved 490 nm ble målt ved anvendelse av et 96-brønners plateleser.
medikamentresistens assays
celler ble sådd i en tetthet på 5 000 celler i 96-brønners plater og inkubert i DMEM inneholdende 10% FCS for 24 timer. Deretter ble legemidler (irinotekan, 5-fluoruracil, og cisplatin) tilsatt, og cellene ble videre inkubert i 72 timer CellTiter 96 ble deretter tilsatt, og platene ble inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Absorbans ved 490 nm ble målt ved anvendelse av et 96-brønners plateleser.
Cellemigrering assay
Celler ble sådd ut i en tetthet på 5 000 celler i 6-brønners plater tidligere belagt med kollagen I og var inkubert i 24 timer. Deretter ble cellene sultet over natten og stimulert med DMEM 10% FCS eller DMEM uten FCS som kontroll. Cellemigrasjon ble målt ved celle sporing ved hjelp av video-mikroskopi og Metamorph programvare (Molecular Device) i 8 timer.
Xenotransplantat musemodeller
NOD /SCID (non-obese diabetic /alvorlig kombinert immunsvikt) /γc null-mus (NSG) ble oppnådd fra Charles River Laboratory (Frankrike). HCT15 celler som uttrykker shCTRL eller shPTK7 ble infisert med lentivirus vektor uttrykker LUC2 og 2,10
6 celler ble injisert subkutant i 9 uker gamle NSG mus (vekt: 25g). LUC2 uttrykk nivå ble kontrollert før injeksjon. Tumorutviklingen ble fulgt i løpet av 8 uker, og beregnes med formelen V = 0.52x (LxB
2). På dag 50, ble tumorreseksjon utført, og tumorvekten ble målt. Deretter, utvikling av metastaser ble etterfulgt av bioluminesens analyse ved hjelp av Photon imageur (Biospace Lab, Paris, Frankrike). Ved opptreden av metastatiske signaler eller fullføring av analysen (dag 130), ble musene obdusert og organ luminescens ble utført. Bildeanalyse ble utført ved hjelp av M3 visjon programvare (Biospace lab). Alle forsøkene ble utført i samsvar med de franske Retningslinjer for dyr behandling.
Statistisk analyse
Sammenligning av kategorisk variabel fordeling ble utført av χ2 eller Fishers eksakte test. For kontinuerlige variabler, ble t-test og ikke-parametrisk Mann-Whitney U test brukt. Oppfølging ble beregnet ut fra diagnose til datoen for siste nyheter for pasienter i live. Metastase overlevelse (MFS) ble målt fra diagnose til første metastatisk hendelse eller død. For pasienter uten metastatisk tilbakefall eller død ved tidspunktet for den siste oppfølging, ble sensurere utført på dato for siste oppfølging. Total overlevelse (OS) ble målt fra diagnose til død eller dato for siste oppfølging. Levninger ble estimert med Kaplan-Meier metoden og sammenlignet mellom grupper med log-rank test. For multivariat analyse ble en Cox modellen. Dataene er rapportert i henhold til rapporterings anbefalinger for svulst markør prognostiske studier (bemerkning) [35]. For å sammenligne tumorvekstkurver i prekliniske forsøk, ble to-veis ANOVA utført. Alle statistiske tester var tosidig. Statistiske analyser ble utført enten med R programvareversjon 2.15 eller Prism programvare (Graphpad programvare, San Diego, CA, USA)
Resultater
PTK7 protein er betydelig oppregulert i CRC
for å bedre forstå hvilken rolle PTK7 i kolorektal tumorigenesis, undersøkte vi sin protein uttrykk ved immunhistokjemi på en TMA inneholder tumorvev fra 192 primær CRC (de kliniske egenskaper er vist i S1 tabell) og matchet normal slimhinne. PTK7 immunofarging kunne bli evaluert i 138 CRC (72%) og 142 normalt vev (74%), henholdsvis. Vi oppdaget PTK7 ekspresjon i primære tumorer i 78 pasienter (56%), med en intensitet på 2 eller 3, i 48 pasienter (35%) og en i det vesentlige cytoplasmiske subcellulære beliggenheten (Fig 1A og 1B). Til sammenligning, bare 32 pasienter (22%) hadde påvisbar farging i matchet normal slimhinne, med en intensitet på 2 eller 3 i 20 pasienter (14%) (p = 1.91.10
-8, chi-2-test, fig 1A og 1B). Dessuten, når PTK7 ble uttrykt, den midlere prosentvise antall positive celler var 31% (95% CI: 25-37%) i tumorvev sammenlignet med 2% (95% CI:. 1.2 til 3.8%; p = 5,74 10
-14, Mann-Whitney U test) i matchet normal slimhinne (fig 1C og 1D). Ved hjelp av en cut-off på minst 10% av positive celler med en intensitet av to eller flere (som vil bli brukt deretter som definisjon av PTK7 overekspresjon), 47 pasienter hadde påvisbare PTK7 overekspresjon i tumorvevet (34%), men bare 3 i normal slimhinne (2%) (fig 1 D). Således PTK7 ble overuttrykt i et betydelig antall primær CRC, men ikke eller nesten ikke i normalt vev
A- PTK7 ekspresjon av immunhistokjemi (IHC) på TMA inneholdende primære CRC vev.: Farging av tumor kjerner som viser høy ( øvre panel) og ingen /lav (nedre panel) uttrykk i representative kreft vev (forstørrelse x 400). B- Intensitet PTK7 farging av IHC i primær CRC og matchet normal slimhinne: farging ble klassifisert som 0, 1+, 2+ og 3+ som beskrevet i materialer og metode delen. Andelene ble sammenlignet ved Chi-2-test. C-Mean prosentandel av celler med PTK7 flekker i grunnskolen CRC og matchet normal slimhinne. D- Tumor kjerner av primær CRC viser PTK7 overekspresjon (som definert ved farging av 10% av celler eller mer, med intensitet på 2 eller mer) og som samsvarer normal slimhinne (forstørrelse x 400). Prosenter ble sammenliknet med Mann-Whitney U test. *** = P 0,001. E- Kaplan-Meier analyse av metastase-fri (til høyre) og generelle (venstre) levninger av ikke-metastatisk CRC pasienter i henhold til PTK7 overekspresjon på TMA. Levninger ble sammenliknet med log-rank test.
PTK7 overekspresjon er assosiert med dårlig overlevelse i ikke-metastatisk CRC
Vi har undersøkt hvorvidt PTK7 overekspresjon var korrelert med hoved kliniske og patologiske funksjoner. Som vist i S2 tabell, ble ingen signifikant sammenheng funnet mellom PTK7 overekspresjon og parametere som alder, kjønn, tykktarm eller endetarm sted, tumorstadium, lymfeknute forlengelse, metastatisk fase, Lympho-vaskulær invasjon (LVI), differensiering karakter og kolloid slimete komponent. Av notatet, det var en ikke-signifikant tendens til en lavere uttrykk i svulster med mikro ustabilitet høy fenotype. Vi fokuserte på scenen I-III, M0 CRC pasienter og evaluert effekten av PTK7 overekspresjon på overlevelse. Ved univariat analyse, sammen med spredning til lymfeknuter og kolloid slimete komponent, ble PTK7 overekspresjon forbundet med en signifikant redusert MFS (tabell 1). Den 5-årige MFS var 75,7% (95% KI: 65 til 88,1%) i PTK7-negative tumorer versus 54% (95% KI: 38,8 til 75%) i PTK7-positive tumorer (HR = 2,1 [1 til 4,1] ; p = 0,034, log-rank test; fig 1E). Ved multivariat analyse, bare kolloid slimete komponent beholdt uavhengig prognostisk verdi for MFS, men PTK7 nærmet statistisk signifikans (tabell 1). Lignende tendenser ble observert i forhold til total overlevelse (Fig 1E, tabell 1). Således ble PTK7 overekspresjon i ikke-metastatisk CRC forbundet med negativt resultat. For å undersøke mulige forskjeller mellom primære og metastatiske svulster, undersøkte vi flere primære vev fra en liten kohort av 7 PTK7-positive levermetastaser. I alle prøvene, PTK7 uttrykk var lik i begge vev (S1 Fig)
PTK7 downregulation påvirker ikke celleproliferasjon og resistens, men det reduserer cellemigrasjon av menneskelige CRC cellelinjer
for å undersøke det biologiske grunnlaget for økt aggressivitet i PTK7 overekspresjon CRC, vi etablert en knockdown modell av PTK7 i humane CRC cellelinjer HCT15 og HCT116 som uttrykker en stor mengde av endogen PTK7 (fig 2A). Celler ble infisert med lentivirus som uttrykker et ikke-målsøkende shRNA kontroll (shCTRL) eller to forskjellige shRNA målrettet mot PTK7 (shPTK7-1 og shPTK7-2), og effektiviteten av PTK7 knockdown ble verifisert ved mRNA og proteinnivåer (Fig 2A og 2B).
PTK7 ekspresjonsnivået i shCTRL- eller shPTK7 (1 og 2) -infected HCT15 og HCT116-cellelinjer ble undersøkt ved western blot (A) og Q-PCR-analyse (B). Cellelevedyktigheten ble kvantifisert ved celle-titer assay i 3 dager (C-D). Cell levedyktighet shCTRL- og shPTK7 (1 og 2) -infected HCT15 celler ble evaluert ved celle titer analysen, 72 timer etter adjunction av cisplatin, Irinotecan, og 5-Fluorouracil (E).
deretter analysert effekten av PTK7 på celle-proliferasjon og overlevelse ved bruk av en celle titer assay. I denne proliferasjonsanalyse, nedregulering av ekspresjon av PTK7 i HCT15 og HCT116-cellelinjer hadde ingen virkning på proliferativ kapasitet av kreftceller (figur 2C og 2D). Fordi PTK7 er involvert i Wnt trasé, sjekket vi om dens mulige innvirkning på spredning kan være avhengig av Wnt ligand stimulering [14,18]. Således proliferasjon ble ytterligere undersøkt i nærvær av kondisjonert medium fra L-celler som uttrykker Wnt3a og Wnt5a, som er kjent aktivatorer av kanoniske og ikke-kanoniske veier, henholdsvis. Men selv under Wnt stimulering, vi oppdaget ikke noen innvirkning på PTK7 uttrykk på CRC celleproliferasjon (S2 figur).
Vi har tidligere funnet at PTK7 uttrykk forbedrer legemiddelresistens i akutt myelogen leukemi celler [28]. Derfor, for å undersøke dens innvirkning på legemiddelresistens i CRC cellelinjer, evaluert vi celle levedyktighet HCT15 celler som uttrykker eller ikke PTK7 etter behandling av ulike doser av cisplatin, irinotecan og 5-FU. Som vist i figur 2E, gjorde downregulating PTK7 uttrykk ikke gi noen ekstra følsomhet for HCT15 til cytostatika. Lignende resultater ble oppnådd med HCT116 (S3 figur).
neste undersøkt rollen til PTK7 i cellemigrering. HCT15 celler ble sultet i 24 timer, deretter stimulert med FCS og cellemigrasjon ble etterfulgt av levende celle sporing. Når FCS ble lagt til som en stimulerende faktor, migrering av HCT15 shCTRL celler økte med 2,5 ganger. Men i PTK7-knockdown HCT15 celler, ble FCS-indusert migrering avskaffet. Lignende resultater ble funnet for HCT116-celler (figur 3A og 3B). Dermed gjør PTK7 uttrykk verken påvirker celleproliferasjon eller narkotika motstand, men det ensidige pro-trekkende kapasiteter til menneske CRC cellelinjer.
shCTRL- og shPTK7 (1 og 2) -infected HCT15 celler ble sultet over natten og inkubert med eller uten FCS. Cellemigrasjon ble målt ved celle sporing ved hjelp av video-mikroskopi og Metamorph programvare. Avstand av migrering ble beregnet for hver tilstand og midler ble sammenlignet ved hjelp av Mann-Whitney U-test (A). Representative utvandrende kurs ble vist i (B).
PTK7 downregulation reduserer tumorvekst og metastaseutvikling i xenograft musemodeller
For å undersøke tumorigen aktivitet PTK7
in vivo
, vi subkutant transplantert bioluminescent HCT15 celler (shCTRL eller shPTK7) i NSG mus og overvåkes både tumorvekst og metastatisk spredning. Som vist på fig 4A og 4B, ble effektiviteten av PTK7 knockdown sjekket i tumorer både på mRNA og proteinnivå. I PTK7 knockdown HCT15 celler, ble tumorvolumet redusert med nesten 50% (figur 4C; p = 0, 0125, to-veis ANOVA) sammenlignet med kontrollceller. Tilsvarende ble tumormassen ble redusert med 2,6 ganger i PTK7 knockdown tumorer (figur 4D; p = 0, 0025, Mann-Whitney U-test). Dermed spiller PTK7 en pro-tumorigen rolle
in vivo
. For å vurdere om dette pro-tumorigent virkningen skyldes forskjell i celleproliferasjon, vi undersøkte Ki67 status i tumorxenotransplantater, med og uten PTK7 knockdown. Som vist i S4 figur, ble observert noen signifikant forskjell mellom HCT15 shCTRL og HCT15 shPTK7 xenografter i form av Ki67 farging.
Uttrykk for PTK7 ble sjekket etter tumorreseksjon av Q-PCR (A) og western blot analyse ( B). Vekst av subkutan xenograft av shCTRL- og shPTK7-infiserte celler HCT15 ble undersøkt (C- D). Bilder fra en representant HCT15 shCTRL injisert mus og deres organer ble vist i venstre panel. Antallet metastase-fri eller positiv-mus i hver tilstand ble undersøkt og vist i panel høyre. Proporsjoner ble sammenliknet med Fischer eksakte test (E).
Med hensyn til den kliniske effekten av PTK7 overekspresjon på MFS og dens pro-trekkende effekt
in vitro
, undersøkte vi om PTK7 kunne forbedre metastaser i xenopodet mus modell. Etter reseksjon av HCT15-avledet tumor, ble metastatisk utvikling overvåket
in vivo
bruker en luciferase reporter. Det var en ikke-signifikant trend for mindre metastatisk forekomst hos mus injisert med PTK7-knockdown HCT15 celler, sammenlignet med shCTRL-HCT15 injisert mus (2 metastatiske arrangementer i 15 mus versus 6 metastatiske arrangementer i 12 mus, henholdsvis; p = 0,0871, Fischers eksakte test) (figur 4E).
for ytterligere å undersøke en potensiell pro-metastatisk effekt av PTK7, vi bygget en mobil modell av PTK7 overekspresjon i PTK7-negative kreftceller og undersøkt dens innvirkning på metastaseutvikling
in vivo
. I fravær av noen tilgjengelige PTK7-negative humane celler CRC, vi brukte en B16F10 melanom-cellelinje, en PTK7-negativ celle med godt dokumentert evne til å produsere lungemetastaser i xenograft-modeller [36], som en modell. Vi transfektert B16F10 celler med PTK7 uttrykk eller tom vektor, og sjekk at PTK7 ble stabilt uttrykt på plasmamembranen ved FACS analyse (s5a og S5b fig). B16F10-celler ble deretter injisert intravenøst, og lungemetastaseutvikling ble analysert. Vi fant at overekspresjon av PTK7 betydelig forbedret metastatisk utvikling (p = 0,0024) (S5C og S5D fig). Ser på størrelsen på metastaser, fant vi at PTK7 overekspresjon ført til et økt antall små og store metastaser (p = 0,0019 og 0.0080 henholdsvis; S5E fig). Imidlertid er andelen av små metastaser var høyere i PTK7 overekspresjon celler, noe som tyder på en dominerende virkning på celleinvasjon og adhesjon, snarere enn på celleproliferasjon. Dermed øker PTK7 overekspresjon metastatisk fenotype
in vivo
.
Diskusjoner
Mens avvikende mRNA uttrykk for PTK7 ble opprinnelig oppdaget i CRC [13], ingen data ble tilgjengelig om sin protein uttrykk i klinisk kommenterte CRC prøver. Ved hjelp av immunhistokjemi, vi har bekreftet sin protein overekspresjon i en relevant del av CRC tilfeller (rundt en tredel av pasientene), sammenlignet med tilsvarende friske slimhinner der det ikke eller knapt påvisbare. I denne serien, ble uttrykket ikke funnet å være assosiert med noen spesifikke kliniske eller patologiske funksjoner, blant annet alder, tumorstørrelse, spredning til lymfeknuter, scene, LVI, kolloid slimete komponent, og differensiering klasse. Imidlertid, i ikke-metastaserende CRC, ble PTK7 overekspresjon forbundet med en signifikant redusert MFS. Dette dårlig prognose effekt på sikt av metastatisk potensiale ble funnet å nærme seg statistisk signifikans i en multivariat analyse, mens spredning til lymfeknuter ikke ble beholdt. Angående til OS, ble observert lignende trender, men uten å nå statistisk signifikans, mest sannsynlig på grunn av den begrensede utvalgsstørrelsen. Av notatet, ble ingen signifikant sammenheng mellom PTK7 overekspresjon og metastatisk scenen på diagnose funnet, heve spennende hypotesen om at PTK7 uttrykk kan gå tapt når metastaser er etablert.
