Abstract
I denne studien undersøkte vi sammenhengen mellom RhoC uttrykk og kreft stamceller (cscs ) formasjonen i hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC). Inhiberingen av RhoC funksjon ble oppnådd ved hjelp shRNA. Ekspresjonen av stamcelle overflatemarkører, ALDH og CD44 var signifikant lav i to RhoC utarmet HNSCC-celle carcinoma-cellelinjer. Videre ble en slående reduksjon i tumorsphere formasjon oppnådd i RhoC knockdown linjer. MRNA-ekspresjon av RhoC i RhoC knockdown vedheftende og tumorspheres er dramatisk ned reguleres i forhold til det forvrengte kontroll. MRNA uttrykk for stamcelletranskripsjonsfaktorer; Nanog, oct3 /4 (Pouf1), og sox2 ble betydelig utarmet i RhoC knockdown kloner. Videre fosforylering av STAT3
ser727, og STAT3
tyr705 var signifikant nedregulert i RhoC knockdown kloner. Overekspresjon av STAT3 i RhoC knockdown viste ingen endring i uttrykk mønstre av enten-STAT3
tyr705 eller stamcelletranskripsjonsfaktorer, som betegner rollen RhoC i STAT3 aktivering og dermed uttrykk for Nanog, oct3 /4 og sox2 i HNSCC. Ekspresjonen av Inter leukin-6 (IL-6) i RhoC knockdown HNSCC-cellelinjer var dramatisk lavt i forhold til det forvrengte kontroll. Videre har vi vist en redning i STAT3 fosforylering av IL-6 stimulering i RhoC knockdown linjer. Denne studien er den første i sitt slag til å etablere involvering av RhoC i STAT3 fosforylering og dermed fremme aktivering av kjerne kreft stamceller (cscs) transkripsjonsfaktorer. Disse funnene tyder på at RhoC kan være en roman mål for HNSCC terapi
Citation. Islam M, Sharma S, Teknos TN (2014) RhoC regulerer kreftstamceller i Head and Neck Plateepitelkarsinom av overekspresjon IL-6 og Fosforylering av STAT3. PLoS ONE 9 (2): e88527. doi: 10,1371 /journal.pone.0088527
Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 14 oktober 2013; Godkjent: 07.01.2014; Publisert: 12 februar 2014
Copyright: © 2014 Islam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av The Ohio State University Comprehensive Cancer Center og Slomin Family Foundation (Florida, USA) til Ted Teknos. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er blant de ti beste fatale kreft på verdensbasis [1], [2]. Videre, som rapportert av American Cancer Society, om lag 41 380 nye tilfeller vil bli diagnostisert i år 2013, hvorav ca 19% av pasientene er sannsynlig å dø på grunn av sykdom i samme år [3]. De overlevende ansikt sekundære manifestasjoner av sykdommen som fører til en langvarig og omfattende behandling. Dette forverres av det faktum at sykdommen viser en høy frekvens av re-forekomst. Som et resultat, HNSCC pasienter står overfor en lang kamp mot sykdommen forårsaker store økonomiske og følelsesmessig byrde [4]. Følgelig en rapport fra Brown
et al product: (2002) siterer HNSCC blant de åtte mest kostbare kreftformene i Medicare programmet [5].
Den uvanlig høy sykelighet og dødelighet skyldes ondartet natur HNSCC og dens utbredt forekomst i de fleste hode og nakke kreft. Derfor er det ikke uvanlig å finne metastaser til lymfeknuter av halsområdet fører til lokoregionalt feil (mest hyppige) etterfulgt av pulmonal og benmetastase [6], [7]. Som et resultat av pasienter med HNSCC viser dårlig prognose og en fem års overlevelse på bare 50-60% [3]. Dermed er det et stort behov for å forstå de genetiske mekanismene som regulerer malignitet av HNSCC og bruke dem til å designe bedre behandlingsstrategier som kan forhindre metastase og gjeninntreden.
RhoC er medlem av brønnen preget Rho familie av GTPases som er involvert i et bredt spekter av cellulære aktiviteter, inkludert intracellulær signalisering, cytoskeletal organisasjon, celleproliferasjon og regulering av genekspresjon [8]. Interessant, Rho gener som tilhører den Ras-superfamilien, og mange av disse har blitt identifisert som onkogener [9], [10]. Selv om svært få genetiske mutasjoner er observert i RhoC genet, er det rapportert å være over-uttrykt i mange former for invasive karsinomer inkludert HNSCC [11], [12]. Spesielt studier i alle typer kreft hvor RhoC uttrykk ble analysert viste en meget sterk sammenheng mellom økt kraftig uttrykk og metastasering. Dessuten, når RhoC funksjon hemmes
in vitro
, resulterer det i en sterk reduksjon av celle invasjon og motilitet [13]. Interessant,
in vivo studier av
tumorgenese i RhoC knockout mus viser tumorer med en sterkt redusert evne til å metastasere til lungene [10]. Til sammen disse studiene at sterkt RhoC er en pro-metastase onkogen som spiller en betydelig rolle i å transformere ikke-invasive tumorceller til en invasiv fenotype.
Studiet av RhoC funksjon fokuserer hovedsakelig på sin rolle i omorganiseringen av cytoskjelettet ved å indusere dannelsen av stress fiber og brennvidde heft, som er viktige skritt mot å endre celler i bevegelige og invasive former [14]. Imidlertid er prosessen med metastase av kreftceller er en kompleks og flertrinns prosess som er ledsaget med den økte ekspresjon av gener som øker motiliteten og invasivitet og en selektiv nedregulering av gener som hemmer denne prosessen. Forekomsten av RhoC i et bredt spekter av invasive karsinomer og dens funksjon som en signal GTPase antyder den kan regulere andre mekanismer, som er involvert i transformasjonen av tumorceller inn i en metastatisk fenotype.
Cancer stamceller (cscs) er en subpopulasjon av udifferensierte tumorceller i en tumormasse som er i stand til selvfornyelse. De viser også sterk resistens mot kjemoterapi-strålebehandling. Videre kan cscs vedvare i svulster som en diskret sub-populasjon som kan tilbakefall og metastasere ved å danne nye svulster [15], [16]. Disse unike egenskapene spille en betydelig rolle i kreftcelleoverlevelse fører til tilbakefall. Viktigere, kan de også være en kilde til celler med en invasiv fenotype, og dermed spille en nøkkelrolle i metastasering.
Et stort antall studier har blitt utført på tilstedeværelse og rolle cscs i hode og nakke kreft som er gjennomgått grundig av Minnelli og Gallo (2012) [17]. En studie av primære svulster i hode og nakke kreft ved hjelp av markører CD44 og ALDH identifisert en undergruppe av kreftceller som unike cscs egenskaper, inkludert selvfornyelse, evne til å danne nye svulster hos mus og viste høy metastatisk potensial (Prince
m.fl.
2007, Davis
et al
2010, Clay
et al
2010) [16], [18], [19]. Interessant, ALDH positive tumorceller oppviste mer karsinogent potensial i forhold til CD44-positive celler [19]. Videre Chen
et al product: (2010) [20] rapporterte primære svulster med et høyere uttrykk av CD44 og ALDH, hvilke attributter godt med dårlig prognose i HNSCC pasienter. Basert på disse studiene, kan det konkluderes med at cscs kan spille en betydelig rolle i metastasering av HNSCC; dermed tyder på et behov for å forstå de molekylære mekanismene som regulerer dem.
cscs er også identifisert og karakterisert i HNSCC cellelinjer hvor de har vist seg å spille en viktig rolle i epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) [ ,,,0],21]. I vår studie har vi analysert effekten av RhoC hemming på de funksjonelle egenskapene til kreftceller som viser CSC-lignende funksjoner i HNSCC cellelinjer. Vi viser at hemme RhoC aktivitet i HNSCC cellelinjer fører til en betydelig reduksjon i cellepopulasjon som uttrykker CD44 og ALDH, markører for cscs i hode og nakke svulster.
Videre har vi også preget den molekylære mekanismen som RhoC regulerer vekst og selvfornyelse av cscs. Våre resultater viser at RhoC kan betydelig redusere uttrykket nivåer av kjernestamcelletranskripsjonsfaktorer, Nanog, sox2 og oct3 /4. Vi viser videre at dette oppnås ved å redusere nivået av fosforylert STAT3 via IL-6 /JAK signalveien. Denne studien er den første i sitt slag som forsøker å dissekere rolle RhoC GTPase signalveien i forskriften og aktivering av stamcelletranskripsjonsfaktorer. (Disse faktorene fremme og opprettholde kreftceller med stamcellelignende egenskaper i hode- og halskreft).
Derfor basert på våre funn vi konkludere med at RhoC er en viktig onkogen som er nødvendig for vedlikehold og spredning av cscs i HNSCC.
Materialer og Metoder
Cell kultur
hode og hals plateepitelkarsinom cellelinjer UM-SCC-1 og -47 (University of Michigan plateepitelkarsinom ) ble anskaffet fra University of Michigan. Disse er godt karakteriserte linjer avledet fra pasienter med T2N0 av gulvet i munnen og T3N1 av undersiden av tungen hhv [22], [23]. Cellelinjer ble dyrket som beskrevet tidligere [13].
Lentivirus transduksjon, infeksjon og valg av positive RhoC knockdown kloner
For å få stabile RhoC knockdown kloner fra de nevnte cellelinjer brukes vi RhoC knockdown og egge sekvens kontroll konstruksjoner med GFP tagget og puromycin motstand områder som beskrevet i vår tidligere utgitt arbeid [13]. Valg av RhoC knockdown stabile kloner ble oppnådd ved å anvende 2,0 og 1,6 ug /ml puromycin for UM-SCC-1 og henholdsvis -47. Disse klonene ble ytterligere sortert ved strømningscytometri for å få maksimalt antall GFP-positive celler, som også ble anvendt i etterfølgende studier.
Transient transfeksjon av RhoC-siRNA
På grunn av at emisjonsspektra av GFP tagget med RhoC shRNA var den samme som den emisjonsspektra av den fluorescens antistoff som brukes til å identifisere ALDH-positive celler, kan de transfekterte RhoC-shRNA /GFP knockdown kloner generert fra UM-SCC-1 og -47 cellelinjer ikke brukes til å identifisere og sortere CSC sub-befolkningen. I stedet knockdown av RhoC ble oppnådd forbigående i både UM-SCC-1 og -47 hjelp RhoC-siRNA (Ambion /Life-teknologi, USA) og lipofactAMIN 2000 som transportør. Vellykket transfeksjon og inhibering av RhoC ble demonstrert ved mangelen på dets ekspresjon med Western blot-analyse ved å bruke anti RhoC antistoff.
kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kvantitative revers transkriptase polymerase kjedereaksjoner (QRT-PCR) ble utført av Taqman sondesystem fra Applied Bio Systems (Foster City, CA) ved hjelp av følgende produkter RhoC: Hs00733980_m1, Sox2: Hs01053049_s1, Nanog: Hs02387400_g1 og Oct3 /4 (POUF1 ) Hs01895061_u1. OZ1 og G3PDH ble brukt som data normalizers. Relative endringer i genekspresjon ble beregnet ved hjelp av to
– (- Δ). C
T-metoden [24]
Western blot analyse
Western blot analyser ble utført i henhold til standardprotokollen. De primære antistoffene som ble anvendt polyklonale RhoC, og p-STAT3
ser 727, p-STAT3
tyr705 (1:1000 fortynninger) og αβ Tubulin (som en laste kontroll) (1:2000 fortynninger). Disse antistoffene var et produkt av Cell Signaling (Cell signal Technologies, Inc., Boston, USA). Etter inkubasjon med primære antistoffer ble membranene blottet for en time med sekundær HRP-konjugert anti-kanin antistoff (1:2500) (GE Healthcare og biovitenskap, Piscataway, NJ, USA). ECL-super signalsystem (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ble brukt for protein visualisering.
Fastsettelse av aktiv RhoC eller [RhoC-GTP]
[RhoC- GTP] i UM -SCC-en og -47 egge kontroll og RhoC knockdown kloner ble bestemt av G-LISA som beskrevet tidligere [25], ved hjelp av G-LISA kit (Cytoskjelett Inc., Denver, CO, USA) og følge produsentens protokollen med RhoC primær antistoff fra Cell Signaling Inc.
Enzyme-linked immunsorbent analyse (ELISA)
Serum frie supernatanter fra egge kontroll og RhoC knockdown cellelinjer oppnådd etter 48 timers inkubering ble sendt for ELISA til cytokin Kjerne Lab University of Maryland, Baltimore, MD. Gjennomsnittsverdier av IL-6 (etter normalisering med antallet celler fra hvor supernatantene ble oppsamlet) i forhold til pg /ml ble fremstilt i et søylediagram.
Strømningscytometri-analyser
Flow cytometri analyse for å sortere ut GFP ble ALDH og CD44 positive celler utført ved hjelp av BD FACS Aria IIU flowcytometer utstyrt med en 488 nm, 15 mW, luftkjølt Argon laser. En ALDEFLOUR kit (Stamcelle Technologies, Vancouver, BC, Canada) ble brukt for ALDH farging. FACS analyse ble utført ved flyt lab kjernefasilitet ved Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Tumorspheres formasjon
For tumorsphere formasjons analyser vi sortert ut GFP positive celler og brukte dem for alle etterfølgende eksperimenter . Tumorspheres fra egge kontroll og RhoC knockdown linjer ble oppnådd ved å dyrke et likt antall celler (1 x 10
6) på ultralave festeplatene i keratinocytt serumfritt medium supplement med EGF 20 ng /ml bFGF 20 ng /ml , insulin 100 ng /ml, og hydrokortison 400 ng /ml. For å spre kulene til den neste generasjon, ble kulene filtrert ut på en 40 pM cellefilter og kort trypsinisert i et vannbad ved 37 ° C. Etter spinningen på 300 × g celle paller ble resuspendert i tumorsphere media og platet på ferske lave festeplater. For å bestemme effektiviteten av tumorsphere dannelse, ble 500 celler fra egge kontroll og RhoC knockdown sådd ut i 96 brønners lave festeplatene. Numrene på sfærer ble tellet etter to uker med såing. De ultra-lave festeplater var et produkt av Corning Incorporated, Corning, NY, USA.
Statistical Analysis
Statistiske analyser (t-test) ble utført ved hjelp av Sigma grafen pad prisme 4-programvare . Gjennomsnittlig ble rapportert med standardavvik (± SD). Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant når
p
verdiene var mindre enn 0,05.
Resultater
RhoC uttrykk er betydelig redusert i RhoC knockdown HNSCC cellelinjer
hemming av RhoC ekspresjon ble utført ved anvendelse av liten hårnål RNA (shRNA) og lentiviral transduksjon og infeksjon metodikk som er beskrevet i metodedelen. Etter lentiviral infeksjon, ble RhoC knockdown kloner valgt ved hjelp av puromycin (1,6 ug /ml) antibiotikum. Antallet celler som ble vellykket infisert ble analysert ved flow-cytometri. Denne viste en bemerkelsesverdig lavt antall ikke-infiserte celler (Fig. 1A-C top panel). I tillegg fluorescens mikroskopi av de stabile kloner viser en sterk grønn fluorescens i de fleste av cellene, som betegner en høy virkningsgrad av lentivirus transduksjon og infeksjon (fig. 1A-C nedre panel). Disse GFP positive celler ble ytterligere sortert ut og re-vokst for senere eksperimenter. Figur 1C er den negative kontrollen viser foreldrelinjen uten lentivirus infeksjon. Dette representerer forskjellen mellom GFP uttrykker (smittet) og ikke-GFP uttrykkende celler.
Lentivirus infiserte celler som viser GFP-ekspresjon i UM-SCC-47. (A) Histogrammer av det forvrengte styre (sr kontroll) og (B) RhoC knockdown (RhoC kd) oppnådd ved flowcytometri. (C) Negativ kontroll. Representasjon av GFP uttrykk i fluorescens og sterkt lys vises i bunnplatene. Rundt 90% av cellene var GFP positive betegner den vellykkede transduksjon av shRNA hjelp rekombinant lentivirus.
Vi testet effektiviteten av shRNA i nedbrytende RhoC mRNA uttrykk av sanntid kvantitativ PCR (QRT-PCR) i våre utvalgte cellelinjer. Som vist i figur 2, er mRNA ekspresjonsnivåer av RhoC genet i knockdown klonene var signifikant lav (Fig 2A og amp;. D), mens proteinet uttrykket var ikke påvisbar i Western blot (Fig 2B og amp;. E). I motsetning til dette ble tilstrekkelig RhoC ekspresjon observert i kloner med shRNA-eggesekvensstyring. Den relative RhoC mRNA-ekspresjon i den shRNA-egge kontroll og RhoC knockdown kloner ble evaluert ved kvantitativ RT-PCR og C
T-verdier som ble oppnådd ble normalisert ved hjelp av to husholdningsgener som beskrevet i materialer og metoder delen. En reduksjon på omkring 80% av den RhoC mRNA-ekspresjon ble observert i UM-SCC-1 og- 47 knockdown kloner i forhold til det forvrengte styre (Fig 2A og amp;. D). I vår forrige undersøkelse, bekreftet vi at bare RhoC mRNA uttrykk ble hemmet når vi brukte RhoC shRNA konstruksjoner laget med spesifikke sekvenser av RhoC mRNA; Videre, uttrykket nivåer av andre Rho proteiner ble ikke påvirket i UM-SCC-cellelinjer [13]. Derfor har vi brukt samme RhoC shRNA konstruerer for vår nåværende studie
(A og D) mRNA uttrykk for RhoC oppnås ved real time RT-PCR.; (B og E). Western blot analyse som viser RhoC uttrykk i egge kontroll og RhoC knockdown kloner (C og F). Søylediagram som viser uttrykk for aktiv RhoC [RhoC-GTP] i egge kontroll og RhoC knockdown UM-SCC-en og-47 henholdsvis. En betydelig reduksjon i RhoC mRNA, proteiner og [RhoC-GTP] nivåer ble oppnådd i de RhoC knockdown cellelinjer.
Deretter analyserte vi RhoC proteinekspresjon ved bruk av Western blot og observert en dramatisk reduksjon av den RhoC protein i RhoC knockdown kloner (figur 2B . E). Videre ble ekspresjon av aktive RhoC [RhoC-GTP] ble bestemt ved G-LISA og en tilsvarende lav ekspresjon av aktiv RhoC påvises i RhoC knockdown kloner av UM-SCC-en og-47 (figur 2C 95%), og derfor CD44 kunne ikke brukes som en stamcelle markør for disse cellelinjene. I tillegg viser våre resultater er lik tidligere rapporterte studier som ble funnet CD44 å være rikelig uttrykt i tumorceller av HNSCC [26].
FACS-analyse som viser ekspresjon av (A) ALDH i kryptert kontroll og RhoC knockdown kloner. (B) Den tumorspheres dannelse i kryptert kontroll og RhoC knockdown UM-SCC-1 og -47cell linjer. (C) Representasjonen av tumorspheres formasjon effektivitet i kryptert kontroll og RhoC knockdown UM-SCC-1 erholdt i 96-brønners plater. En betydelig reduksjon i ALDH ekspresjon ble observert. Tumorsphere formasjonen var dramatisk lav i RhoC knockdown UM-SCC-1 og -47 hhv. (D) En betydelig reduksjon i den RhoC mRNA-ekspresjon ble oppnådd på RhoC knockdown tilhenger celle og i tumorspheres. (E) Stamcelletranskripsjonsfaktorer, sox2, oct3 /4, og Nanog viser betydelig nedregulering i sin mRNA som avslørt av real time RT-PCR i egge kontroll og RhoC knockdown kuler hentet fra UM-SCC-1.
RhoC knockdown HNSCC linjer er sterkt redusert i deres evne til å danne tumorspheres
Tumorceller celler~~POS=HEADCOMP med stamcelle-lignende egenskaper er i stand til å danne flytende sfærer når dyrket under ikke-heftende serumfritt medium. Derfor, for å etablere ytterligere rolle RhoC i CSC vekst og vedlikehold, undersøkte vi tumorsphere formasjons evner i disse cellelinjene. Først, et likt antall celler (1 x 10
6) fra kryptert kontroll og RhoC knockdown cellelinjer ble sådd ut på ultralave festeplater for observasjon. Vi valgte fem forskjellige felt for å visualisere antallet tumorspheres som hadde dannet. I det forvrengte kontroll, var det et stort antall tumorspheres med et færre antall av celleaggregater. I motsetning til dette ble en klar nedgang i tumorsphere dannelse detektert i RhoC knockdown kloner generert fra både UM-SCC-1 og 47-cellelinjer. Videre bør det bemerkes at veldefinerte grenser, et karakteristisk trekk ved tumorspheres, er bare til stede i de som er avledet fra eggekontrollcellene, men er tydeligvis fraværende når avledet fra RhoC knockdown-celler (fig. 3B). I stedet, hva som blir sett er små cellegrupper eller aggregater som er blottet for enhver veldefinert ytre grense. Videre gjorde disse cellegruppene ikke forplante eller danne kuler etter at de ble trypsinert og re-belagt. I motsetning til dette, ble kulene lett genereres fra styrecellelinjer (scrambled sekvens) selv etter re-plating dem opp til den femte generasjon. Vi analyserte også tumorsphere formasjon effektivitet i en 96-brønners plate ved anvendelse av 500 celler per brønn og observert platen for kulene etter to uker. En bemerkelsesverdig reduksjon i antall sfærer (85%) ble observert for de RhoC knockdown-celler sammenlignet (fig. 3C) kontrollcellene. I likhet med den foregående tumorsphere analysen ble celleaggregater observert fra celler avledet fra RhoC knockdown cellelinjene som var helt ulikt veldefinerte kuler avledet fra kontroll kloner. Vi har oppnådd et lignende mønster av tumorsphere dannelse effektivitet når den UM-SCC-47 kryptert kontroll og dens tilhørende RhoC knockdown linjer ble testet (data ikke vist). Disse data tyder på at RhoC er viktig for vekst og vedlikehold av kreftceller med stamcellelignende egenskaper i hode- og halskreft.
Analyse av RhoC og stamcelletranskripsjonsfaktorer uttrykk i tilhenger og tumorspheres i HNSCC
Differensial uttrykk for RhoC mRNA i festede celler og tumorspheres
: Neste, vi analyserte RhoC mRNA uttrykk i tumorspheres generert fra UM-SCC-en cellelinje og sammenlignet den med sine tilsvarende heftende celler ved hjelp av real time RT-PCR. Det bør bemerkes at de adherente celler anvendt for eksperimentene viser til det forvrengte styre eller RhoC knockdown monolagsceller som er dyrket i standard cellekultur grunnen. Våre resultat viser at det er en forhøyet ekspresjon av RhoC mRNA i UM-SCC-en egge kontroll sammenlignet med de RhoC knockdown motstykker (Fig. 3D). Interessant er det RhoC uttrykket mye høyere i eggekontroll tumorspheres i forhold til sine heftcelle kolleger. Dette kan være på grunn av nærværet av en høyere konsentrasjon av RhoC i tumorspheres hvor høyere antall cscs er lokalisert i forhold til kontrollen heftende cellepopulasjon, som utviser en blanding av celler med både stammen og ikke-stamcelle lignende egenskaper. Dette understøtter ytterligere vår hypotese at RhoC er nødvendig for opprettholdelse av CSC lignende funksjoner. Våre resultater er i samsvar med en tilsvarende studie på RhoC uttrykk i brystkreftcellelinjer, hvor ALDH positive celler utstilt en høyere RhoC uttrykk sammenlignet med ikke-ALDH uttrykker celler [27].
stamcelletranskripsjonsfaktorer er nede regulert i RhoC knockdown tumorspheres.
vekst og selvfornyelse av stamceller inkludert forplantning avhenger av riktig uttrykk for kjernen stamcelle transkripsjon faktorer Nanog, oct3 /4 og sox2. Derfor har vi analysert uttrykket nivåer av disse stamcelle transkripsjoner faktorer i RhoC knockdown og eggekontroll tumorspheres generert fra UM-SCC-en cellelinje ved real-time RT-PCR. Interessant, ekspresjonsnivåene av alle tre kjernetranskripsjonsfaktorer ble dramatisk redusert i RhoC knockdown-celler sammenlignet med de kodede styre tumorspheres (fig. 3E). Sox2 var sterkest uttrykt i eggekontroll tumorspheres, mens Nanog og oct3 /4 var både mindre sterkt uttrykt, men hadde lignende uttrykk nivåer. Men i RhoC knockdown kolleger, sox2 og Nanog viste størst reduserte nivåer etterfulgt av oct3 /4. Videre har vi også sett på deres uttrykk nivåer i heft HNSCC cellelinjer (kryptert kontroll og RhoC knockdown) hvorfra tumorspheres ble utledet. I UM-SCC-1 egge kontroll og RhoC knockdown cellelinjer, de tre transkripsjonsfaktorer viste tilsvarende nivåer av uttrykk som observert i tumorspheres som ble avledet fra dem (fig. 4A). I UM-SCC-47 egge kontroll, oct3 /4 hadde det høyeste uttrykk etterfulgt av sox2 og Nanog. I likhet med UM-SCC-en RhoC knockdown linje, viste Nanog den største reduksjonen når RhoC uttrykket ble hemmet fulgt av Sox2 (Fig. 4B). I begge UM-SCC-1 og -47 RhoC knockdown linjer, oct3 /4 viste minst mulig redusert uttrykk. Alt i alt har våre resultater viser at RhoC medierer forplantning og selvfornyelse av cscs ved å regulere ekspresjon nivået av kjernen stamcelle transkripsjonsfaktorer.
Sanntid RT-PCR som viser mRNA-ekspresjon av sox2, oct3 /4 og Nanog i heftende celler av UM-SCC-1 (A) og-UM-SCC-47 (B). En betydelig reduksjon i mRNA-ekspresjon ble observert i stamcelletranskripsjonelle faktorer i RhoC knockdown HNSCC cellelinjer.
Inhibering av RhoC ekspresjon induserer nedregulering av den STAT3 signalveien
Deretter vi har undersøkt den mulige mekanismen som RhoC regulerer ekspresjon av kjernestamcelletranskripsjonsfaktorer. Aktivering av stamcelletranskripsjonsfaktorer, Nanog, sox2 og oct3 /4 formidlet gjennom Signal Givere og aktivatorer av Transcription3 (STAT3) signalveien er godt etablert [28], [29]. Imidlertid er involvering av RhoC i aktivering av disse transkripsjonsfaktorene ikke kjent. Derfor, analyserte vi ekspresjonen av total og fosforylert STAT3 (p-STAT3) i kryptert kontroll og RhoC knockdown HNSCC-cellelinjer. Overraskende, observerte vi at selv om de totale nivåer av STAT3 forble omtrent det samme i det omkastede kontroll og RhoC knockdown cellelinjer, p-STAT3 nivåer ble betydelig redusert bare i RhoC knockdown kloner. Nærmere bestemt, Western blot-analyse avslørte redusert fosforylering av STAT3 protein til ser-727 og Tyr-705 rester (fig. 5A og B). Det er av interesse å merke seg at fosforylering ved den sistnevnte rest er nødvendig for STAT3 å diffundere inn i kjernen for å binde seg til promotorelementer av STAT3 responsive gener [30], [31]. Disse resultatene sterkt støtter ideen om at den RhoC signalveien er nødvendig for aktivering av STAT3 i HNSCC linjer.
(A og B) Western blot-analyse som viser fosforylering av STAT3
ser727 og STAT3
tyr705 i egge kontroller og RhoC knockdown UM-SCC-1 og henholdsvis -47. Normalisert verdi med hensyn til totalt STAT3 er gitt som de numeriske verdiene. Bemerkelsesverdig nedgang i fosforylering av STAT3 ble sett i RhoC knock-down UM-SCC-1 og -47 cellelinjer henholdsvis. (C) Protein analyse viser p-STAT3
tyr705 i ectopically overexpressed (OE) egge kontroll og RhoC knockdown UM-SCC-en. Fosforylert form ble oppdaget bare i kryptert kontroll når STAT3 ble over uttrykt. Et tykt bånd av total STAT3 kan sees i det nedre panelet, noe som bekrefter vellykket transfeksjon av STAT3 i disse klonene. (D) Sanntid RT-PCR som viser ekspresjonen av STAT3, sox2, oct3 /4 og Nanog før og etter STAT3 i forhold til ekspresjon i den RhoC knockdown-klonen. MRNA uttrykk for STAT3 var dramatisk høyt etter at det er over uttrykket, mens ingen signifikant endring i uttrykket ble observert i sox2, oct3 /4 og Nanog i RhoC knockdown klone.
For å bekrefte at fosforylering av STAT3 skjer via RhoC signalveien, vi ectopically over-uttrykt STAT3 i en RhoC knockdown linje (UM-SCC-1). De totale Stat3 nivåer i egge kontroll og RhoC knockdown kloner når STAT3 var over-uttrykt utstilt robuste band, som betegner en vellykket transfeksjon av STAT3. Bart, p-STAT3
tyr705 kan bare ses tydelig i STAT3 over-uttrykke egge kontroll cellelinje. Mer spesifikt, i RhoC knockdown over-uttrykt STAT3 klone, var det en lite bemerkelsesverdig fosforylering av STAT3 ved Tyr-705 som kunne observeres, og var svært lik uttrykket nivåer observert i de opprinnelige RhoC knockdown kloner (Fig. 5C).
Videre har vi analysert mRNA uttrykk nivåer av Nanog, sox2, og oct3 /4 i STAT3 løpet uttrykt RhoC knockdown klone (UM-SCC-1). Som vist i figur 5D, ble det observert en bemerkelsesverdig økning i STAT3 mRNA ekspresjon i denne cellelinjen, men ekspresjonen av kjernen stamcelletranskripsjonsfaktorer, Nanog, sox2, og oct3 /4 er-uforandret og lik den som er observert i RhoC knockdown linjer.
