Abstract
endostatin er en viktig endogen hemmer av neovaskularisering som har vært mye brukt i anti-angiogenese terapi for behandling av kreft. Imidlertid er dets kliniske anvendelse i stor grad hindret av den lave effekt. Humane placenta-avledede stamceller (hpMSCs) er spesielt attraktive celler for klinisk bruk i celle-baserte terapier. I den foreliggende undersøkelse, hpMSCs ble isolert og karakterisert. Vi vurderte deretter svulsten rettet mot egenskaper og antitumor effekt av hpMSCs som genet levering kjøretøy for eggstokkreft terapi. Vi utviklet effektivt hpMSCs å levere endostatin via adenovirus transduksjon mediert av Lipofectamine 2000. tropisme kapasitet konstruerte hpMSCs mot kreftceller ble deretter bekreftet av
in vitro
migrasjon analyser og
in vivo
av intraperitoneal injeksjon av hpMSCs inn i nakne mus. De hpMSCs som uttrykker den humane endostatin-genet vist fortrinnsrett homing til tumorstedet, og betydelig redusert tumorvolumet uten åpenbare systemiske toksiske effekter. Disse observasjonene ble assosiert med signifikant redusert blod spirer og tumorcelle-proliferasjon, så vel som en dramatisk økt tumor apoptose indeks. Disse resultatene antydet at hpMSCs er potensielt en effektiv levering kjøretøy for terapeutiske gener for behandling av eggstokkreft
Citation. Zheng L, Zhang D, Chen X, Yang L, Wei Y, Zhao X (2012) Antitumor aktiviteter of human Placenta-avledet stamceller Uttrykke endostatin på eggstokkreft. PLoS ONE syv (7): e39119. doi: 10,1371 /journal.pone.0039119
Redaktør: Olivier de Wever, Ghent University, Belgia
mottatt: 24 desember 2011; Godkjent: 16 mai 2012; Publisert: 24.07.2012
Copyright: © 2012 Zheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National 973 Program of China tilskudd (2011CB910703). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de vanligste gynekologiske kreftformer, og det er fortsatt den fjerde største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner [1]. Til tross for de mange fremskritt i kirurgiske inngrep, kjemoterapi og strålebehandling i løpet av de siste tiårene, er prognosen for pasienter med avansert eggstokkreft er fortsatt dårlig, med en 5-års overlevelse på mindre enn 30% for pasienter med fjernmetastaser. Dette lav overlevelse skyldes primært eventuell svulst tilbakefall og fremveksten av resistens [2]. Derfor er nye terapeutiske tilnærminger sterkt behov for å endre fremtidsutsiktene for pasienter med eggstokkreft.
Angiogenese spiller en avgjørende rolle i de biologiske og patologiske prosesser for kreft. Flere linjer av bevis har vist at veksten og utviklingen av de fleste faste kreftformer er angiogenese avhengige og tumor angiogenese er høyt organisert ved en balanse mellom positive og negative regulatorer [3], [4]. Til dags dato har et stort antall anti-angiogenese midler blitt identifisert. Endostatin, et 20-kDa karboksyl-terminalt fragment av α1 kjeden av kollagen XVIII som hemmer endotelial cellemigrering, proliferasjon, og induserer apoptose av vaskulære endotelceller, er blitt betraktet som den mest potente hemmer av angiogenese. Det er godt etablert at endostatin effektivt kan hemme forskjellige faste tumorer, for eksempel små Lewis lunge karsinom [5], tykktarmskreft [6], human brystcancer [7], hepatocellulært karsinom [8], [9], eggstokk-kreft [ ,,,0],10], [11], og malignt melanom [12]. Imidlertid, som et protein medikament, har endostatin en kort halveringstid
in vivo
og lett mister sin effekt. Videre er det behov for en hyppig doseringsregime, og høye doser av dyre rensede protein hindrer fremtidig klinisk anvendelse. For å overvinne disse manglene, er anvendelse av genterapi blitt utforsket. Imidlertid er genavlevering effektiviteten av plasmidvektorer svært dårlig, og de produserer også meget lav ekspresjon av endostatin. Andre strategier har forsøkt å overvinne noen av disse problemene i forsøk på å forlenge uttrykk for endostatin. Adenovirus er ansett som en av de mest effektive genvektorer, og har vist seg å generere høy ekspresjon av endostatin i flere dager [4]. Ikke desto mindre, oppstår begrensninger fra den relativt korte overlevelsestid av viruset, og disse vektorer kan ikke migrere spesielt til tumorstedet, og således kreve plassering injeksjon. Derfor er nye og mer effektive terapeutiske verktøy som trengs for den spesielt rettet mot endostatin uttrykk til tumorcellene.
stamceller (MSC) er multipotente stamceller med evne til å differensiere i en rekke celletyper, inkludert kondrocytter , osteoblaster, adipocytter, muskler, neuroner, stromale celler, og andre celletyper [13]. Flere studier har indikert at humane placenta-avledede stamceller (hpMSCs) er lik stamceller fra benmarg med hensyn til cellekarakteristikker og deres potensial for multilineage differensiering [14] – [16]. Som morkakevev kommer i løpet av de første stadiene av embryologiske utvikling, kan disse vev inneholder celler som har beholdt de prosperities av tidlige embryonale celler som de avleder. Videre er det grunnleggende for opprettholdelse av placenta fetomaternal toleranse under graviditet, noe som tyder på at celler som er tilstede i placenta vev kan ha immonomodulatory egenskaper. I mellomtiden nylige studier viste at mesenchymale isolert fra morkake vev har evnen til å spesifikt målsøkende til flere tumorstedet. Disse tre viktige aspekter gjøre celle fra morkaken svært attraktiv kandidat for mulig bruk i cellen terapi tilnærminger i direkte kreftbehandling [17]. Noen studier har konstruert MSC å uttrykke interferon β (IFNβ) i hjernesvulst [18], metastatisk melanom [19], og brystkreft modeller [20]. MSC-leverte IFNβ har vist seg å undertrykke tumorcellevekst ved å indusere kreftcelledifferensiering og apoptose, noe som resulterer i økt overlevelse i disse modellene [18], [19]. Disse studiene viste det aktuelle molekylære mekanismen medier cross-undertrykkende samspillet mellom konstruerte MSC og tumorvekst kan involvert i flere aspekter, inkludert: a. MSC kan reise til samme homing destinasjon som migrerende kreftstamcelle med uvanlige evner til å migrere til oncogenetic nettstedet; b. cytokin skjult i MSC kan unngå immunsystemet overvåking og være godt tolerert av verten uten å indusere en uakseptabel immunrespons; c. viral-transduced MSC kan levere viral initiatively til kreft nettsteder og også øke den lokale viral dose ved kontinuerlig virusreplikasjon og forsterkning [21]. Disse resultatene viste MSC kan tjene som potensiell kandidat for vektor for genterapi. I mellomtiden hpMSCs har vist seg å være mer fordelaktig i celle innkjøp, lagring og transplantasjon enn benmargavledede MSC. Videre mesenchymale stromale celler fra benmargen har en risiko for virusinfeksjon [22] og deres differensiering Kapasiteten reduseres betydelig med donor alder [23]. Videre er placenta vanligvis kastes etter fødselen; som sådan, er dette vevet tilgjengelig i stor tilførsel, og isolering av stamceller fra dette vevet ikke innebærer noen invasive prosedyrer for giver og unngår etisk kontrovers. Disse viktige aspekter lage celler isolert fra morkaken gode kandidater for mulig bruk i celleterapi. Den primære interesse for denne studien har vært fokusert på hvorvidt endostatin konstruerte hpMSCs kan spesielt migrere til svulsten området og overvinne tumorprogresjon og metastaser i en menneskelig eggstokkreft modell.
Materialer og metoder
rekombinant adenovirus vektor konstruksjon
bygging av rekombinant endostatin adenovirus er blitt beskrevet i en tidligere studie [10]. Kort beskrevet ble fulllengde humant endostatin cDNA (omtrent 570 bp) amplifisert ved RT-PCR. Etter sekvens bekreftelse ble cDNA klonet inn i en shuttle vektor for redning av rekombinant E1- /E3-slettet adenovirus (Adeasy system) [24]. De virale partikler ble amplifisert i 293-celler, renset ved to-trinns cesiumklorid (CsCl) gradient ultrasentrifugering, og målt ved absorpsjon ved 260 nm. Virustiteret ble kvantifisert ved anvendelse av en standard TCID50 assay.
Cellekultur og reagenser
A2780s cellelinje og humane embryonale nyre (HEK293 celler) ble oppnådd fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas , VA, USA) og dyrket i RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) rutinemessig supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum pluss ampicillin og streptomycin i en fuktet 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C . Kvinne naken mus (6-8 uker gamle) ble kjøpt fra Laboratory Animal Center of Sichuan University.
hpMSC isolasjon og kultur
Full-begrepet human placenta ble hentet fra en frisk mor etter donor under en vev samling protokoll godkjent av institusjonens Institutional Review Board (IRB) i West China Second Hospital skriftlig samtykke. De informert samtykke ble skrevet ned og alle dokumentene ble holdt i West Kina Second Hospital IRB. Med sterile prosedyrer, føtale deciduas placenta-vev ble kuttet i stykker på omtrent 1 cm
3 i størrelse, vasket med PBS, og spaltet med 1 mg /ml I type kollagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 37 ° C i 2 timer. Cellene ble deretter separert via sentrifugering over Ficoll-Hypaque separasjonsmedium ved et g /cm
3 densitetsgradient 1,088 for å fjerne uønskede celler. De oppsamlede celler ble resuspendert i kultur i L-DMEM-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 20% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10 U basisk fibroblast vekstfaktor (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mmol /l L-glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 100 U /ml penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 100 mikrogram /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Cellene ble deretter sådd ut på 75 cm
2 kolber og dyrket i en 37 ° C, 5% CO
2 inkubator med mettet fuktighet. Etter 48 timer, ble ikke-adherente celler fjernet ved å erstatte kulturmediet. Friskt medium ble byttet hver 3. til 4. dag. Cellene ble høstet ved trypsinering (0,25% trypsin med 0,1% EDTA), deretter passert, og deretter brukt i løpet av fjerde passasje for eksperimenter.
Celleoverflate- fenotype og multipotent differensial estimering
For å skille hpMSCs, fenotypiske karakteriseringen av CD29, CD44, CD105, CD73, CD166, CD90, ble CD34 og CD 45 analysert ved hjelp av en strømningscytometer (Coulter EPICS Elite ESP) [25]. Celler ble spaltet og inkubert med antistoff i 25 minutter ved 4 ° C. Ufargede, nonincubated celler fungerte som kontroll. Deretter ble cellene fiksert i 4% bufret formalin og analysert med et strømningscytometer. Minimumskrav av celler for 8000-gated hendelsene ble anskaffet for hver prøve. For osteogene og adipogenic differensiering, hpMSCs ble dyrket på 5 × 10
4 celler per brønn på 12-brønners plater i OsteoDiff eller Adipodiff induksjon medium (Miltenyi Biotec GmbH) for 3 uker, deretter Alizarin Red S og Olje-Red-O ble brukt til å visualisere kalkavleiringer og fettdråper separat. For å bestemme hvorvidt transfeksjon med adenovirus vil påvirke multipotente egenskaper, 48 timer etter transfektert med adenovirus, ble cellene dyrket i OsteoDiff eller Adipodiff induksjonsmediet i 3 uker, deretter Oil-Red-O og Alizarin Red S ble anvendt for å visualisere kalkavleiringer og fett dråper henholdsvis
hpMSC transfeksjon og protein uttrykk analyser
Den isolerte MSC befolkningen med positiv fenotype ble utvidet kontinuerlig i ukevis før de plateholde hpMSCs nådde . 90% samløpet og besatt tilstrekkelig forankring aktivitet og stabilitet til å tåle påkjenninger i viral vektor infeksjon ved en høy multiplisitet (vanligvis mellom populasjonsdoblinger 4 og 7). Før transduksjon, ble vekstmediet fjernet, og cellene ble vasket en gang med serumfritt DMEM. Ad-Hendo-GFP ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) på et mangfold av infeksjon (MOI, virus /celle) av 2000 (valgt som den optimale mellom Mois av 1000, 2000 og 3000). Etter 48 timer, vektor- og mock-transduced celler ble analysert under en invertert mikroskop (Axiovert 200; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, USA). Og et flowcytometer ble søkt om evaluering av grønn fluorescens
Cellene transfektert med Ad-Hendo (hpMSC-Ad-Hendo) og kontroll adenovirus (Ad-null) ved en MOI av 2000 (2,5 * 10
8 pfu /10
6 celler i 1,0 ml komplett media) var deretter oppnådd, og supernatanten ble høstet, konsentrert ved ultrafiltrering (Centricon YM-3; Millipore, Bedford, MA, USA), og analysert ved hjelp av Western blot. Proteiner ble separert ved anvendelse av en 12% SDS-PAGE-gel og transblottet på en PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranen ble deretter blokkert i 5% fettfri melk i 0,1% Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST) i 1 time ved værelsestemperatur og senere probet med et kanin polyklonalt anti-endostatin-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) fortynnet 1:400 ved 4 ° C over natten. Deretter ble blottene inkubert med et pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin-immunoglobulin (1:5000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i 1 time ved romtemperatur. Proteinbåndene ble påvist ved anvendelse av et ECL-påvisning kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Videre er også utført vi ELISA-analyse for å bestemme ekspresjonsnivået av endostatin utskilt av konstruerte hpMSCs
in vitro
. Som beskrevet tidligere, ble de isolerte hpMSCs transfektert med adenovirus som bærer endostatin, og på 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon, ble supernatantene samlet opp og analysert for humant endostatin genekspresjon nivåer ved hjelp av et humant endostatin Quantikine ELISA-sett (R Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, USA). Disse eksperimentene ble utført i tre eksemplarer.
Fastsettelse av hpMSC homing til svulsten nettstedet
Svulster ble etablert i mus ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon av 5 * 10
6 A2780s celler. Etter 14 dager med svulst utfordring når tumornoduler var håndgripelig, ble hpMSCs transfektert med Ad-GFP hjelp Lipofectamine som beskrevet før. Etter 48 timer ble cellene oppsamlet, vasket en gang med PBS og suspendert i friskt medium. Da cellene ble injisert intraperitonealt 2 * 10
5 celler per injeksjon. Ikke-tumorbærende mus ble anvendt som kontroll. Tre dager og 2 uker etter injeksjonen ble tumorknuter og orangs (hjerte, lever, milt, lunge, nyre) samlet og frosset i henholdsvis Optimal Cutting Temperatur forbindelse (OCT). Fluorescent hpMSCs ble oppdaget i friske frysesnitt (3-5 mikrometer) av tumorprøver og organer ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
Behandling av den eksperimentelle xenograft modell
Kvinnelige naken BALB /c mus 6- 8 uker gammel ble kjøpt fra forsøksdyr sentrum av Sichuan University. Forskningen Protokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og behandling Committee of Sichuan University. Menneskelig eggstokkreft ble etablert ved i.p. injeksjon av nakne mus med 5 * 10
6 A2780 celler i 200 ul PBS. Før i.p. administrasjon, hpMSCs ble transfektert med Ad-Hendo eller Ad-null ved en MOI av 2000 som beskrevet ovenfor. Mus ble tilfeldig delt inn i fire grupper (n = 5 dyr /gruppe): (a) mus behandlet med 0,9% normalt saltvann (NS); (B) mus behandlet med hpMSCs på 2 * 10
5 /mus; (c) mus behandlet med Ad-null-transfekterte hpMSCs på 2 * 10
5 /mus; (d) mus behandlet med Ad-Hendo-transfekterte hpMSCs på 2 * 10
5 /mus. Behandlingen begynte 5 dager etter tumorcelle-utfordring og ble administrert via i.p. injeksjon hver 3. dag for totalt 6 ganger. Musene ble overvåket på en daglig basis for tumorbyrde, oppblåst mage, kakeksi, og andre abnormiteter. Musene ble avlivet en uke etter den siste administrering, og i.p. svulster ble så fjernet og veid.
Kvantifisering av celleproliferasjon og angiogenic microvessel tetthet
Primær tumorprøver med tilstøtende vev og relevante interne organer ble høstet, fiksert i 4% paraformaldehyde, og deretter innebygd i parafin. For immunhistokjemi analyse ble snittene 3-5 um tykke skjæres av de parafinblokker, deparaffinized i xylen, og rehydrert med en serie av gradert EtOH. Antigen gjenfinning ble utført ved autoklavering av delene i gjenfinning buffer (10 mmol /l EDTA-citrat-buffer [pH 6,0]; Dako, Glostrup, Danmark) i 4 minutter i mettet damp etter opp-presset få (126 ° C, 1,6 bar, 23 psi). Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksyd ved romtemperatur i 10 minutter uten lys, og ikke-spesifikk binding av reagenser ble stanset ved inkubasjon av seksjonene i 20 min i 10% normalt geite eller kaninserum. Seksjonene ble deretter inkubert med geit anti-human Ki-67 polyklonale antistoffer (1:150, Maixin-Bio, Fuzhou, Kina) og polyklonale rotte anti-human CD31 (1:200, Maixin-Bio, Fuzhou, Kina) over natten i et fuktig kammer ved 4 ° C; dette ble fulgt av inkubering med biotinylert kanin-anti-geite /rotte IgG og deretter streptavidin-biotin-pepperrot-peroksidase-komplekset ved 37 ° C i 45 min. De immunoreaksjoner ble til slutt utviklet (visualisert med diaminobenzidin [DAB] oppløsningen som et kromogen) ved hjelp av en DAKO flytende DAB + substrat-kromogen system, og de røde gule bunnfall ble identifisert som positiv farging. Kontra ble forsiktig utført med forbedrende Gill hematoxylin, og lysbildene var dehydrert og montert med dekkglass. Seksjonene ble deretter visualisert ved hjelp av et mikroskop ved 400x forstørrelse (Olympus, Tokyo, Japan). Ki-67-positive celler eller blodkar ble talt fra tre områder i hver seksjon i en blindet måte.
Alginat innkapsling analysen
Alginat perle inneholder tumorcelle analysen ble beskrevet i detaljer tidligere [ ,,,0],26]. I korthet ble dyrkede A2780 celler ble resuspendert med 1,5% (m /v) natriumalginat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og deretter tumorcelle alginat oppløsning ble dryppet inn i en virvlende bad av 0,25 M CaCl2 for å danne dråper som inneholder omtrent 1 x 10
5 tumorceller per perle. Etter bedøvet ble de nakne mus implantert subkutant med fire kuler inn i et innsnitt på ryggen, ble snittene suturert med kirurgiske klemmer. Den hpMSCs-Ad-Hendo (mot en MOI 2000) ble injisert intraperitonealt på dag 3, 6, 9, 12 etter implantering perle, med hpMSCs-Ad-null, hpMSCs eller saltvann som kontroll. Etter 14 dager ble musene injisert i.v. med 100 pl FITC-dex- tran-oppløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (100 mg /kg) og ble avlivet 20 minutter senere. Bilde av alginat implantater ble tatt ved hjelp SPOT FIEX kamera. Alginatkuler ble overført til rør inneholdende 2 ml saltløsning. Rørene ble blandet ved hjelp av en vortex i 20 s og sentrifugert (3 minutter; 1000 x g). Endelig fluorescensen av supernatanten ble målt for å kvantifisere blodkardannelse.
Analyse av apoptose i tumorvevet
Apoptose-analyse ble utført ved hjelp av TUNEL (terminal deoksynukleotidyl transferase-mediert dUTP nick-end merking) med en deadend Fluorometrisk TUNEL System (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens protokoll. TUNEL-positive kjerner, pyknotic atomkjerner med mørk grønt fluorescerende farging, ble visualisert og analysert under et fluorescens mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Den apoptose indeksen ble bestemt av to avhengige etterforskere ved å telle TUNEL-positive celler i fem høye kraft felt per lysbilde.
Evaluering av potensielle toksisitet
For å vurdere de potensielle bivirkninger og toksisitet av hpMSCs, relevante indekser som vekttap, anoreksi, diaré, kakeksi, huden sår, ruffled pels og toksisk død ble observert. Etter ofring av musene, ble forskjellige organer (hjerte, lever, milt, lunge, nyre etc.) høstet og fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS. Deler av 3-5 mikrometer ble farget med hematoxylin og eosin (H E). Og observert under et mikroskop av to patologer i en blindet måte
Statistisk analyse
De statistiske forskjellene i tumorvekt , dyr vekt, prosent apoptose, og microvessel densitet ble bestemt ved anvendelse av en-veis analyse av varians (ANOVA). AP verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Phenotype analyse og multipotente karakteristikker av isolerte celler
Flow cytometri analyser indikerte at bestanden av plate-holde celler var. positiv for mesenchymal stamcelle markører CD29 (mer enn 95%), CD44 (mer enn 95%), CD73 (mer enn 99%), CD90 (mer enn 95%), CD166 (mer enn 95%), CD105 ( 95%) og negativ for hematopietic markører CD34 ( 3%) og CD45 ( 3%), som var i samsvar med egenskapene til MSC (figur 1A). Den generelle definisjonen av MSC omfatter både fenotypiske og funksjonelle kriterier, så vi benyttet det osteogene og adipogenic differensiering analyse for å identifisere de multipotente egenskaper før og etter adenovirus transfeksjon. For osteogene og adipogenic differensiering, hpMSCs ble dyrket på 5 × 10
4 celler per brønn på 12-brønners plater i OsteoDiff eller Adipodiff induksjon medium (Miltenyi Biotec GmbH) for 3 uker, deretter Alizarin Red S og Olje-Red-O ble brukt til å visualisere kalkavleiringer og fettdråper separat. Som vist i figur 1B, 1C, visualisering lipid vakuoler og kalkavleiringer som peker til en bredere multipotent differensiering kapasitet på våre hpMSCs. Vi har også bestemt om transfeksjon med adenovirus vil påvirke multipotente egenskaper. 48 timer etter transfektert med adenovirus, ble cellene dyrket i OsteoDiff eller Adipodiff induksjonsmediet i 3 uker, deretter Oil-Red-O og Alizarin Red S ble anvendt for å visualisere kalkavleiringer og fettdråper separat. Som vist i figur 1C, kunne positive lipid vakuoler og kalkavleiringer bli visualisert.
A. Fenotypefrekvensene egenskapene til rensede MSC ble verifisert ved strømningscytometri-analyse, som viste at disse utvides og plateholde populasjoner av celler (ved doblinger 3 og 5) var positive for CD29 (mer enn 95%), CD44 (mer enn 95%) , CD73 ( 99%), CD90 ( 95%), CD166 ( 95%) og CD105 ( 95%) overflate markør uttrykk og negativ for CD34 ( 3%) og CD45 ( 3%). Den heltrukne linjen angir ufargede kontrollceller og stiplede linjen angir isolerte stamceller. B. osteogene og adipogenic differensiering besluttsomhet i isolerte stamceller. Venstre panel indikerte positive kalsium innskudd (piler), panel riktig angitt lipid vakuoler (piler). C. osteogene og adipogenic differensiering besluttsomhet i isolerte stamceller etter tilført med adenovirus. 48 timer etter transfeksjon ble cellene vasket med PBS, og dyrket i OsteoDiff eller Adipodiff induksjonsmediet i 3 uker, deretter Oil-Red-O og Alizarin Red S ble anvendt for å visualisere kalkavleiringer og fettdråper separat. Lipid vakuoler og kalkavleiringer (piler) kan bli visualisert (× 100).
In vitro
uttrykk for hpMSC-Ad-Hendo
Siden menneskelig placenta- avledet MSCer er forholdsvis motstandsdyktige mot vill-type adenovirus-infeksjon på grunn av deres lave ekspresjon av adenoviral reseptoren CAR, gjennomførte vi Lipofectamine 2000-mediert transduksjon adenoviral. Den genavlevering effektivitet av adenovirus til hpMSCs ble bestemt ved evaluering mikroskop. Vi har funnet at etter transduksjon med det rekombinante Ad-GFP-Hendo ved en MOI på 2000 og 3000, nesten alle cellene som utsendes grønn fluorescens følgende dyrkingsplate-klebrig betingelser (figur 2A). Men sammen med økt infeksjon multiplisitet, celledød ble også forsterket, muligens som følge celleskader på grunn av overdreven transgen ekspresjon. Videre ble flowcytometri brukt til å måle transduksjon effektivitet. Funnene viste at det var effektiv på en MOI av 2000, som omtrent 82,3% av hpMSC-Hendo celler konsekvent uttrykt GFP på dette MOI (figur 2D). Til sammen valgte vi å bruke celler konstruert under disse overføringsforhold (en MOI av 2000) i alle etterfølgende eksperimenter. Deretter for å verifisere om endostatin protein ble utskilt fra hpMSC-Ad-Hendo celler, ble Western blot analyse utført. Som vist i figur 2B, ved en MOI på 2000, et distinkt bånd på omtrent 20 kDa, som tilsvarer størrelsen av endostatin, ble uttrykt i Ad-Hendo-behandlede celler, men ikke i Ad-null-behandlede celler. Videre også utførte vi ELISA analyse for å påvise endostatin utskilt fra hpMSC-Ad-Hendo. Som vist i figur 2C, er konsentrasjonen av endostatin i cellekultursupernatanter var signifikant høyere enn kontrollgruppene og nivået av endotatin også øket med tiden, og holdt seg på et høyt nivå 96 timer etter transfeksjon. Denne analysen bekrefter at endostatin kan skilles effektivt fra de konstruerte hpMSCs.
A. GFP fluorescens ble vurdert i FITC-kanalen. De hpMSCs transfektert med GFP-merket adenovirus viste grønt. Original forstørrelse × 400. B. Celler transfektert med Ad-Hendo og tak adenovirus (Ad-null) ved en MOI på 2000 ble analysert ved hjelp av Western blot for å påvise ekspresjon av endostatin proteinet. hpMSCs transfektert med Ad-Hendo viste tydelig uttrykk for endostatin protein sammenlignet med kontroll. C. Hvis du vil kontrollere uttrykket nivået av endostatin utskilt av konstruerte hpMSCs
in vitro
, ELISA-analysen ble utført for å evaluere endostatin i supernatantene av celler transfektert med adenovirus bærer endostatin, hpMSCs og hpMSCs transfektert med Ad-null ble brukt som kontroll. Etter 48 timer, 72 timer og 96 timer etter transfeksjon, ble cellekultursupernatanter oppsamlet og endostatin-konsentrasjonen ble bestemt. Konsentrasjonen av endostatin i cellekultursupernatanter var signifikant høyere enn kontrollgruppene og nivået av endotatin også øket med tiden, og holdt seg på et høyt nivå 96 timer etter transfeksjon. D. Flowcytometri ble brukt for å evaluere transfeksjonseffektiviteten av Ad-Hendo-GFP. Transfeksjon hastighet ved MOI 1000, 2000 og 3000 var 60,3%, henholdsvis 82,3% og 79%. Sammenlignet med kontrollgruppen, infeksjon ved en MOI på 2000 til høyere transfeksjonseffektivitet. Den røde rammen representerer positive sone på hver tomt.
Den vandrende kapasitet hpMSCs mot tumorceller
in vitro Hotell og
in vivo
det er blitt foreslått at faktorer frigjort fra kreftceller kan være potensielle kjemoattraktanter som er involvert i tropisme av MSCene. For å evaluere den vandrende kapasitet hpMSCs mot A2780 celler,
in vitro
migrasjonsanalyser ved hjelp Millicell inserts ble gjennomført. Kondisjonert medium fra 293-celler ble anvendt som en kontroll. Bare noen få hpMSCs-Ad-Hendo celler migrert mot 293-kondisjonert medium, mens migrasjonen av hpMSCs-Ad-Hendo ble betydelig stimulert av kondisjonert medium fra de menneskelige eggstokkreft A2780 celler (P 0,01; figur 3A). Når antallet migrerte celler på undersiden av Millicell innskudd ble beregnet, ble det bekreftet at umodifiserte hpMSCs migrert til det kondisjonerte mediet fra A2780-celler i et lignende mønster som for hpMSCs-Ad-Hendo. Sammen våre data indikerte at under de betingelser som er beskrevet, hpMSCs viste betydelige trekkende kapasitet og A2780-celler besatt en større kapasitet for å indusere migrering av MSCer, sammenlignet med 293-celler (P 0,05, figur 3B). For å avgjøre om hpMSCs fortrinnsvis omplassert til menneskelige eggstokkene xenografter, vi etablert hårløse mus peritoneal eggstokkreft modell. 2 uker etter i.p. injeksjon av A2780 celler og svulster var håndgripelig, vi i.p. injisert stamceller transfektert med adenovirus som bærer GFP, og ikke-tumorbærende mus ble benyttet som kontroll. På tidspunktet for 3 dager og 2 uker etter i.p. injeksjon av transfekterte mesenchymale stamceller, ble musene avlivet og tumorknuter, lever, milt, lunge, nyre og hjerte ble oppsamlet og GFP-signalet ble målt. Som vist i figur 3C, 3 dager etter i.p. injeksjon, GFP signaler ble påvist ved tumor periferien. 2 uker etter i.p. injeksjon, interessant vi har oppdaget positivt signal i tumoren parenchymal. Dette funnet antydet at de injiserte stamceller vedvare i xenograft og kan integreres i tumor fokus. Videre er det ikke noe positivt signal finnes i organer for tumorbærende og ikke-tumorbærende mus.
A. Migrasjon av hpMSCs /hpMSCs-Ad-Endo celler gjennom en 8-um Millicell membran. HpMSCs ble dyrket i 24-brønns plate på 8-um pore størrelse membraner, og A2780s eller 293-celler ble dyrket i det nedre kammer. Cellene migrerte til den undre side av membranen ble merket med metyl fiolett. Original forstørrelse × 400. B. Induksjon av hpMSCs /hpMSCs-Ad-Endo migrasjon stimulert av A2780s eller 293 celler. Sammenlignet med 293 celler, A2780s celler fremmet migrasjon av hpMSCs //hpMSCs-Ad-Endo betydelig. Viste data som middel ± SD. C. Hvis du vil kontrollere den spesifikke homing eiendom transducted mesenchymale til tumorlokalisering, transducted vi hpMSCs med adenovirus bærer GFP og injisert intraperitonealt til nakne mus med etablert peritoneal ovarial tumor. Etter 3 dager og 2 uker med i.p. injeksjon, ble musene avlivet og tumorknuter og organer ble oppsamlet. Venstre panel: 3 dager etter intraperitoneal injeksjon, GFP signal (pil) ble påvist ved tumor periferien. Høyre panel: 2 uker etter i.p. injeksjon, positiv GFP signal ble detektert i tumoren parenchymal (pil) som indikerte hpMSCs vedvare i xenograft og kan integreres i tumor fokus.
