Abstract
ARF tumorsuppressorgener virker som en sensor av onkogene signaler, motvirke avvikende spredning i stor grad via aktivering av p53 transkripsjonen program, selv om et antall av p53-uavhengige funksjoner er blitt beskrevet. Monterings bevis tyder på at i tillegg til å fremme tumorgenese via forstyrrelser i homeostatisk balanse mellom celleproliferasjon og apoptose av åpenlys kreftceller, genetiske endringer som fører til tumor suppressor tap av funksjon eller onkogen vinning av funksjon kan også egge tumorutvikling via virkninger på tumor mikromiljøet. I en transgen musemodell for flertrinns pankreatisk nevroendokrine carcinogenese (PNET) som drives av inhibering av den kanoniske p53 og Rb tumor-suppressorer med SV40 stort T-antigen (Tag), stokastisk progresjon til tumorer er begrenset delvis av et krav for initiering av en angiogen bryter. Til tross for inhibering av p53 ved Tag i denne muse PNET modellen, samtidig avbrudd av Arf via genetisk knockout resulterte i en betydelig akselerert vei til tumordannelse som ble overraskende ikke drevet av endringer i tumorcelle-proliferasjon og apoptose, men heller via tidligere aktivering av den angiogene bytte om. I innstillingen av en konstitusjonell p53-genet knockout, tap av Arf også akselerert svulst utvikling, om enn i mindre grad. Disse funnene viser at Arf tap av funksjon kan fremme tumordannelse via tilrettelegge angiogenese, i hvert fall delvis, gjennom p53-uavhengige mekanismer
Citation. Ulanet DB, Hanahan D (2010) Tap av p19
Arf Forenkler den angiogene Switch og startfasen i en Multi-Stage Cancer Modell via p53-avhengige og uavhengige mekanismer. PLoS ONE 5 (8): e12454. doi: 10,1371 /journal.pone.0012454
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 02.06.2010; Godkjent: 03.08.2010; Publisert: 27 august 2010
Copyright: © 2010 Ulanet, Hanahan. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra National Cancer Institute (DH, R01CA45234) og AP Giannini Foundation for medisinsk forskningsetikk (DBU, https://www.apgianninifoundation.org/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ARF (alternativ leseramme; P14
ARF i menneskelig, p19
Arf i mus) tumor suppressor fungerer som en sensor av hyper-proliferative signaler, noe som resulterer i p53-avhengig vekst og apoptose [1], [2], [3]. Mens ARF ikke uttrykkes på vesentlige nivåer i de fleste normale vev, utløser onkogen aktivering dets ekspresjon [4], noe som resulterer i inhibering av MDM2 ubiquitin ligase og stabilisering av p53 [5]. Inhibering av p53-reaksjonsveien, oftest via mutasjoner i
p53
seg, inaktivering av
ARF
, eller forsterkning av
MDM2
er antatt å være et kritisk trinn i patogenesen av de fleste humane kreftformer [6]. Selv mutasjon av
p53 Hotell og
ARF
i svulster er for det meste gjensidig utelukkende hendelser [7], montering bevis tyder på at forholdet mellom p53 og ARF er ikke strengt lineær og peker på p53 -Uavhengig tumor suppressor funksjoner av ARF [8], [9]. Initial in vivo bevis for en potensiell frakobling mellom ARF og p53 kom fra funn som kombinert
p19
Arf Hotell og
p53
mangel på mus fører til fremveksten av en svulst spektrum bestående av et bredere spekter av tumortyper enn i mus som mangler genet, enten alene [9]. Deretter en studie i DMBA /TPA totrinns mus hud kreft modell avslørt en akselerert vekst av papillomer i en
p19
Arf
-deficient sammenlignet med en
p53
-deficient genetisk bakgrunn [10]. Tilsvarende
p19
Arf
men ikke
p53
mangel tilrettelagt melanom utvikling i en transgen musemodell gjennom lindring av en p53-uavhengig senescence vei [11]. En nyere studie antydet en sammenheng-avhengighet til utfallet av
p19
Arf
tap under onkogenese i innstillingen for
PTEN
-deficiency, ved at
p19
Arf
tap formidles delvis hemmende funksjon under prostata kreftutvikling, men avskaffet senescence og fremmet hyper og transformasjon av mus embryo fibroblaster. I begge innstillingene differensial utfallet av
p19
Arf
tapet inntraff uten effekter på p53 aktivitet [12].
I en transgen musemodell for flertrinns bukspyttkjertelen nevroendokrine kreftutvikling (PNET) , RIP-Tag2, uttrykk for den SV-40 T-antigen (Tag) i bukspyttkjertelen beta celler fører til hemming av tumor suppressors p53 og Rb, fremme en timelig definert ennå stokastiske flertrinns vei til tumorigenesis. Til tross for onkogen-ekspresjon i alle ~400 mus pankreatiske øyer, er sekundære hendelser som er nødvendig for progresjon til hvert trinn i reaksjonsveien til tumorer [13], [14]. De fleste, men ikke alle normale holmer utvikle seg til hyperplastic /dysplastiske lesjoner i løpet av omtrentlig 14 ukers levetid på RIP-Tag2 mus. På samme måte, bare et subsett (~15-20%) av hyperplastiske holmen lesjoner gjennomgå en angiogen bryter, og bare en liten del (omtrent 25%) av disse angiogene øyer deretter videre inn i faste tumorer. Fremme av hyperplastisk bryteren er antatt å være delvis mediert av vekst /overlevelsesfaktor, IGF-II, som dets ekspresjon induseres samtidig med utbruddet av β-cellehyperformering [15]. En nyere studie har identifisert en sammenheng mellom mikroRNA uttrykk signaturer og de ulike RIP-Tag2 tumorigenesis etapper, som innebærer at endringer i uttrykket av disse miRNAs kan spille en rolle i å drive disse «bryterne» [16].
Vi har søkt i denne undersøkelsen for å finne ut om Arf hadde p53-uavhengige funksjoner undertrykke tumorprogresjon i RIP-Tag2 PNET modell, via kors til mus som bærer en genetisk knock-out av
Arf., en tidligere studien viste at genetisk utstansing av
p53
i denne modellen ikke resulterte i en akselerert reaksjonsvei til tumordannelse, og i virkeligheten, ble beta tumorcelleproliferasjon redusert, sannsynligvis en konsekvens av destabilisering av SV-40 stort T- antigen onkogen, til hvilken den binder [17]. I kontrast, viser vi her at tap av
Arf
akselererer betydelig tumordannelse, via lette angiogene bryteren. Disse studiene gir
in vivo
bevis for p53-uavhengige funksjoner av Arf og foreslå en ny rolle for Arf som en suppressor av tumor angiogenese.
Resultater
Knockout av
Arf
akselererer RIP-Tag2 tumor progresjon uten signifikante effekter på tumorceller apoptose /spredning
i samsvar med den kjente induksjon av p19
Arf svar på onkogene signaler [4],
ARF
mRNA-ekspresjon ble funnet å være indusert i SV-40 Tag-uttrykkende hyperproliferative holmer sammenlignet med normale øyer, med en ytterligere økning med progresjon til angiogene lesjoner og faste tumorer i RIP-Tag2 mus (figur 1). For å avgjøre om Arf kan undertrykke tumorigenesis i innstillingen av p53 hemming, vurdert vi effektene av genetisk knockout av
Arf
på denne veien. Bemerkelsesverdig, tap av Arf resulterte i en meget betydelig, nesten fem ganger økning i tumorbyrde (figur 2A, p 0,0001); Det var i tillegg en 1,8 gangers økning i tumornummer (figur 2B, p = 0,002). Heterozygot tap av Arf resulterte også i en signifikant økning i tumorbyrden (p 0,001) og tumor antall (p = 0,02) sammenlignet med
ARF
villtype-RIP-Tag2 mus. Tap av villtype
Arf
allele skjedde ikke i noen av de
ARF
+/-
svulster undersøkt (Figur S1).
mRNA nivåer av
ARF
ble vurdert ved hjelp av kvantitativ RT-PCR på cDNA generert fra RNA bassenger av normale ikke-transgene holmer og hyperplastiske holmer, angiogene holmer (isolert holmer 5-10 mus ble slått sammen) og tumorer (lik mengder av RNA isolert fra 10 tumorer fra i det minste fem mus slått sammen) fra RIP-Tag2 mus. Genuttrykk normalisert og plottet i forhold til MGUS uttrykk
(A, B) Effekter av heterozygot og homozygot knockout av
Arf
på tumorbyrde (A;. * P 0,001, * * p 0,0001 sammenlignet med
Arf + /+
, forskjellen mellom
Arf +/- Hotell og
Arf – /-
mus var ikke statistisk signifikant) og tumor nummer (B ; * p = 0,02, ** p = 0,002) i 12 uker gamle RIP-Tag2 mus. Gjennomsnittsverdier +/- SEM fra 15 (
Arf + /+
), 17 (
Arf +/-
), eller 20 (
Arf – /-
) mus /gruppe indikeres. Mann-Whitney test for statistisk signifikans. (C) apoptose, som bestemmes av TUNEL merking i hyperplastiske øyer (Hyp), angiogene holmer (Ang) og tumorer (Tum) fra
Arf
+ /+
eller
Arf
– /-
RIP-Tag2 mus. Middelverdier +/- SEM fra graderte lesjoner av 6-7 individuelle mus i hver genotype er indikert. Det totale antallet lesjoner som ble analysert for hver genotype /lesjon trinn er som følger:
Arf + /+ plakater (Hyp: n = 27; Ang: n = 33; Tum: n = 14);
Arf – /- plakater (Hyp: n = 18; Ang: n = 25: Tum: n = 22). (D) Proliferation, som målt ved den% av celler med BrdU-inkorporering i de forskjellige stadier av øy-lesjoner fra 4 individuelle
Arf + /+ plakater (Hyp: n = 21; Ang: n = 24; Tum: n = 12) og
Arf – /- plakater (Hyp: n = 18; Ang. n = 22; Tum: n = 24) RIP-Tag2 mus
Gitt den tidligere demonstrert evne ARF å indusere cellesyklus og apoptose uavhengig av p53 [9], [18], [19], [20], [21], undersøkte vi om endringer i apoptose og spredning som vurderes av TUNEL merking og BrdU inkorporering henholdsvis i pre-neoplastiske og tumorlesjoner fra
RIP-Tag2; Arf
+ /+ Hotell og
Arf
– /-
mus. Overraskende, var vi ikke i stand til å oppdage noen signifikant effekt av tap av Arf på hver av disse parameterne på noen av RIP-Tag2 stadier (figur 2C, D). For å sikre at vi ikke overse subtile effekter på cellesyklusregulering /spredning, i tillegg til BrdU inkorporering analysen, som måler andelen av celler i S-fase, vi også vurdert den proliferative indeksen med farging for fosfor-histon H3, en markør for celler i M-fase. I overensstemmelse med BrdU-inkorporering-analysen ble det ikke observert noen signifikant forskjell i prosentandelen av celler i M-fase ved tap av Arf (figur S2). Videre er stabil knockdown av
Arf
ved hjelp av et
Arf
målretting shRNA i en cellelinje avledet fra en vill-type RIP-Tag2 tumor hadde ingen virkning på veksten av kreftceller in vitro (figur 3).
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP ble stabilt transduced med en ikke-lyddemping (NS) eller
Arf
silencing shRNA. (A) knockdown av Arf protein uttrykk av
Arf
målretting shRNA. β-aktin protein nivåer angitt som en kontroll for protein belastning. (B) Effekt av
Arf
knockdown på tumorcellevekst
in vitro
. Gjennomsnittsverdier +/- SEM fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer er angitt.
Tap av Arf forenkler angiogene bryter
For å undersøke hvordan knockout av
Arf
kan være akselererende tumorvekst uten endringer i β-celleproliferasjon eller apoptose, vurdert vi om tap av Arf kan påvirke noen av de iboende barrierer som begrenser overgang av onkogen uttrykke p-celler i bukspyttkjertelen holmer gjennom de ulike trinnene til tumordannelse. Til tross for ekspresjon av Tag onkogenet i den tredje bukspyttkjertelen som begynner ved embryonisk dag 9, er det en forsinkelse i den sporadisk initiering av holme hyperproliferasjon av flere uker. For å avgjøre om tap av Arf kunne legge til rette for en tidligere oppstart av hyperplastisk bryteren, undersøkte vi hvor mange prosent av hyperproliferative holmen lesjoner (bestemt ved farging med Ki67 spredning markør) på både 3- og 5-ukers alder i
RIP -Tag2; Arf
+ /+ Hotell og
Arf
– /-
mus. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i andelen hyperproliferative holmer på ett av disse stadiene (figur 4A), men på 5-ukers alder, holmer fra
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus var i gjennomsnitt større i størrelse (figur S3A, 1,5 ganger økning; p = 0,007). Den økte lesjon størrelse var ikke et resultat av øket cellestørrelse som antall celler /område var nesten identisk mellom de to gruppene (figur S3b).
(A) Effekter på hyperplastisk bryteren. Holmer fra Ki67-farget seksjoner fra 3- eller 5-ukers gamle mus ble scoret som «normal» (ingen hyper) eller hyperplastisk. Verdier representerer fordelingen av de forskjellige holmen underklasser innenfor de angitte genotyper. For tre-ukers mus, 60 (
Arf + /+
) og 58 (
Arf – /-
) holmen lesjoner ble scoret på seksjoner fra tre mus /gruppe; for 5 uker gamle mus, 166 (
Arf + /+
) og 231 (
Arf – /-
) holmen lesjoner ble scoret på seksjoner 3-4 mus /gruppe. Fordelingen av holmen typer var ikke signifikant forskjellig mellom de to genotypene i begge tidspunkt (Fishers eksakte test, 5 uke endepunktet: p = 0,06). Representative Ki67-farget hyperplastic lesjoner (fra 3 uker gammel RIP-Tag2 mus) av den indikerte
ARF
genotyper er avbildet til høyre. (B, C) Effekter på angiogene bryter og startfasen. Antallet røde, angiogene lesjoner (B) og tumorer (C) ble beregnet ut fra 11 (
Arf + /+
) eller 15 (
Arf – /-
) 8-ukers gamle RIP Tag2 mus av de angitte genotypene. Middelverdier ± SEM er indikert. Mann-Whitney test for statistisk signifikans; * P = 0,01, ** p. 0,0001
Vi neste vurdert effekten av
Arf
knockout på hyppigheten av angiogene veksling. I motsetning til den ubetydelig innvirkning på forekomsten av holmen hyperplasias, ble antall røde, hemoragisk angiogene holmer betydelig økt (med ca 30%) i 8 uker gammel
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus sammenlignet med
RIP-Tag2
;
Arf
+ /+
kullsøsken (figur 4B; p = 0,01). I tillegg, mens forekomsten av solide tumorer var svært sjeldent på 8 uker i
RIP-Tag2
;
Arf
+ /+
mus (svulster stede i 4/11 mus, gjennomsnitt på en svulst /mus), små svulster ble funnet i nesten alle
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus analysert i denne alderen (gjennomsnitt av ~2.5 svulster /mus, figur 4C, p 0,0001). Av notatet, i scoring for hyperplastic lesjoner på 5 ukers tidspunkt, sporadiske holmer som viser de typiske hemoragisk funksjoner /blod øyene angiogene holmer [22], [23] ble observert, med en trend mot en høyere forekomst i
Arf
– /-
sammenlignet med
Arf
+ /+
mus; men denne forskjellen var ikke statistisk signifikant på dette tidspunkt (fig S3C). Derfor, i denne flertrinns-modell, tap av Arf akselererer tumordannelse, i det minste delvis, via tilrettelegge den angiogene bryter.
Arf knockout ikke resulterer i signifikante endringer i det vaskulære fenotypen
for ytterligere å utforske naturen på den økte angiogene fenotype i
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus, vi neste vurderte fenotype av angiogene blodkar. Til tross for økt antall angiogene lesjoner i
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus, de resulterende lesjonene var ikke signifikant forskjellig i vaskulær tetthet eller morfologi (fartøy tykkelse, forgreningsgrad) (figur 5A og data ikke vist), eller i graden av pericyte dekning (figur 5B). Gitt tidligere funn som viser en rolle for MMP-9 uttrykker nøytrofiler i å fremme den angiogene bryter [24], også undersøkte vi hvorvidt tap av Arf ekspresjon resulterte i endringer i forekomsten av neutrofil rekruttering til «pre-angiogene» hyperplastiske forandringer. I begge
RIP-Tag2
;
Arf
+ /+ Hotell og
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus, dobbel-farging for Ki67 spredning markør og 7/4 nøytrofile markør viste at ca 25% av hyperplastic lesjoner undersøkt (5 ukers alder) inneholdt infiltrere nøytrofile ( i de fleste tilfeller ikke mer enn var 7/4 + celle /holmen; data ikke vist). I tillegg ble det ingen vesentlige endringer i antall infiltrere MMP-9 og 7/4 doble positive celler observert i angiogene lesjoner fra 8-ukers gamle
RIP-Tag2
;
Arf
+ /+ Hotell og
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus (data ikke vist)
(A) Visualisering av blodkar i angiogene lesjoner fra 8-ukers gamle RIP-Tag2 mus av de angitte genotypene av. farging for Meca32 (rød). Representant Meca32 /DAPI (blå) fusjonerte bilder vises. Fartøyet Tettheten ble beregnet ved å måle arealet som opptas av Meca32 + fartøyer; Verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM beregnet ut fra analyse av 16-20 angiogene lesjoner fra 4 individuelle mus i hver genotype. (B) Double farging for Meca32 (endotelceller, rød) og NG2 (pericytes, grønn) ble utført for å analysere graden av pericyte dekning innenfor angiogene blodkar fra 8-ukers RIP-Tag2 mus av de angitte genotypene. Barer, 20 mikrometer.
Selektiv
Arf
knockout i stromal rommet ikke betydelig forbedre svulst utvikling
Tidligere studier har vist at
Arf
– /- mus
er blinde på grunn av en defekt i involusjon av hyaloid blodkar i øyet under utvikling, som følge av en akkumulering av Pdgrfrβ + perivaskulære celler [25], [26]. Data innblandet begge cellestyrte og ikke-selvstyrte effekter av tap av Arf på denne fenotype [27]. Siden
RIP-Tag2
;
Arf
– /-
mus mangler Arf uttrykk i hele kroppen og ikke bare i tumorceller, vi spørsmål ved om tap av Arf i en ikke-β-celletype kan delvis være lette angiogene bryter og svulstdannelse. For å begynne å utforske denne muligheten, må vi først undersøkt om vi kunne oppdage
Arf
uttrykk i stromal rommet av villtype
RIP-Tag2
svulster. Sanntids kvantitativ RT-PCR-analyse på sorterte cellekamre fra
RIP-Tag2
tumorer demonstrert
Arf
uttrykk, som forventet, i tumorcellerommet, men ikke i endotelceller (CD31 +) , immunceller (CD45 +), eller pericytes (PDGFRp +) (Figur 6A og S4). Disse resultatene er i samsvar med den oppfatningen at induksjon av Arf uttrykk er, for det meste, begrenset til respons på onkogene signaler [4]; Men denne analysen ikke utelukke muligheten for forbigående induksjon av Arf uttrykk i stromal celletyper analysert, og heller ikke uttrykk i andre klasser av tumor infiltrerer cellene [f.eks PDGFRp-negative pericytes [28]].
(A) Uttrykk for
Arf
i de ulike konstituerende RIP-Tag2 tumor celletyper. Real-time kvantitativ RT-PCR ble utført på mRNA isolert fra FACS sortert celler fra RIP-Tag2 svulster [ECS (endotelceller), ICS (immunceller), T /OCS (svulst /andre celler)]. Expression nivåer plottet i forhold til L19 uttrykk. (B) Effekt av
Arf
knockout på tumorutvikling av orthotopically transplanterte kreftceller. 1 × 10
5 svulstceller fra en
RIP-Tag2
;
Arf
+ /+
tumor ble injisert i bukspyttkjertelen av
Arf
+ /+
eller
Arf
– /-
mus og lov å vokse i 4 uker. Verdiene representerer gjennomsnittstumorvolum (+ SEM) beregnet fra tumorer isolert fra 12 individuelle mus i hver av de angitte genotyper. Forskjellen mellom verdiene oppnådde ikke statistisk signifikans (Mann-Whitney test, p = 0,1).
For å vurdere den potensielle rolle direkte
Arf
knockout i den ikke-tumor cellerommet i å påvirke tumorprogresjon, utførte vi ortotopiske eksperimenter der kreftceller fra en
RIP-Tag2
;
Arf
+ /+
tumor ble injisert i bukspyttkjertelen av immunocompetent
Arf
+ /+
eller
Arf
– /-
mus, og tumorstørrelse ble målt fire uker senere. Det var ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig tumorstørrelse mellom svulster som dannes i
Arf
+ /+
versus
Arf
– /-
mus (Figur 6b). Kombinert med vår manglende evne til å gjenkjenne
Arf
uttrykk i en svulst stromal celletype, disse resultatene tyder på at knockout av
Arf
i svulsten stromal rommet er ikke sannsynlig å være den dominerende føreren av skyndte tumorvekst observert på
Arf
knockout i RIP-Tag2 mus. Siden det er uklart om mekanismen for angiogenese induksjon i orthotopically injiserte tumorceller følger en lignende vei som angiogenese induseres i endogene pre-neoplastiske lesjoner, gjenstår muligheten for at mangelen på observerte effekten kan delvis være reflekterende slike forskjeller.
Knockout av
Arf
akselererer svulstdannelse via både p53-avhengige og uavhengige mekanismer
Siden p53 har vist seg å være kvantitativt sequestered av SV-40 Tag og dens trans aktivitet beviselig er hemmet i p-celler av RIP-Tag2 mus [17], mistenkt vi mesteparten av effekten observert på knockout av
Arf
å være p53-uavhengig. Likevel fortsatte vi å verifisere p53-uavhengighet
Arf
knockout fenotype ved å analysere effekten av
Arf
knockout i en p53-null genetisk bakgrunn. Som i p53-villtype bakgrunn,
Arf
knockout i
RIP-Tag2; p53
– /-
mus resulterte i en betydelig økt (2,4 ganger) tumorbelastning ved 12 ukers alder sammenlignet med
Arf
+ /+
kullsøsken (Figur 7A; p 0.001), så vel som en signifikant 30% økning i antall av angiogene lesjoner (figur 7C; p = 0,04) og små tumorer (figur 7D; p = 0,002) ved 8 ukers alder, som bekrefter at disse effektene er i det minste del p53-uavhengig. Det bør imidlertid bemerkes at størrelsen av effekten av
Arf
knockout på tumorbyrden (etter 12 uker) og tumor nummer (ved 8 uker) var ikke så dramatisk som i
RIP-Tag2
;
p53
-wild-type mus (figur 2). I tillegg skjedde selv om startfasen tidligere i
RIP-Tag2; p53
– /-; Arf
– /-
sammenlignet med
RIP-Tag2; p53
– /-; ARF
+ /+
mus, ved 12 ukers alder, var det ingen forskjell i tumor antall detekterte mellom mus av disse genotyper (figur 7B), noe som tyder på at begge p53-avhengige og uavhengige funksjoner av ARF samvirker for å undertrykke angiogen bryter og tumorprogresjon i denne flertrinns kreft modell
(A, B)
Arf
knockout i
RIP-Tag2.; p53
– /-
mus resulterer i en økt tumorbelastning (A; p 0,0001) uten å påvirke svulst nummer (B) ved 12 ukers alder. Gjennomsnittsverdier +/- SEM fra 19 (
p53 – /-, Arf + /+
), eller 14 (
p53 – /-, Arf – /-
) mus /gruppe indikeres. Mann-Whitney test for statistisk signifikans. (C, D) Økt angiogene holmen tall (C; p = 0,04) og tumorer (D; p = 0,002) i
RIP-Tag2; p53
– /-
;
p19
Arf – /-
mus ved 8 ukers alder. Gjennomsnittsverdier +/- SEM fra 15 (
p53 – /-, Arf + /+
), eller 13 (
p53 – /-, Arf – /-
) mus /gruppe indikeres. Mann-Whitney test for statistisk signifikans.
I et forsøk på å identifisere en molekylær mekanisme for økt angiogene svitsjefrekvens i
Arf-
null RIP-Tag2 mus, analyserte vi uttrykk for en oppstilling av angiogenese-relaterte gener ved sanntids-PCR. Vi fikk imidlertid ikke identifisere eventuelle angiogene regulatoriske gener som ble overbevisende endret på transkripsjonsnivået i hele svulster eller angiogene holmer ved tap av Arf (data ikke vist og figur s5a). I lys av nylige studier som viser en rolle for Arf i ribosom biogenesis [29] og i post-transcriptional kontroll av VEGF uttrykk [30], vurdert vi mulige endringer i VEGF uttrykk på proteinnivået ved tap av Arf. Selv VEGF protein nivåer ble beskjedent forhøyet i RIP-Tag2 svulster i
p53
-null genetisk bakgrunn (35% økning; p = 0,02), fant vi at i denne genetiske sammenheng, tap av
Arf
resulterte ikke i endrede nivåer av total VEGF-protein (figur S5b). I tillegg farging for VEGF avdekket ingen åpenbare endringer i VEGF uttrykk /lokalisering i de ulike pre-neoplastiske holmen lesjoner i
Arf
-null RIP-Tag2 mus (Figur S5C). Dermed er det ingen indikasjon på at den akselererte angiogenese som følge av tap av Arf innebærer endring i VEGF biosyntese.
Diskusjoner
inaktivering av ARF /p53 veien er en kritisk hendelse i de fleste menneskers kreft, som tjener til å løfte støtter på onkogene signalisering [31]. I tillegg til de kanoniske tumorsuppressorgener aktivitetene til p53 i å mediere cellesyklus-stans, apoptose og begynnende alderdom, kan p53 også fungere til å opprettholde tumordvale via hemming av angiogenese [32]. I en flertrinns karsinogenese modell hvor p53 er funksjonelt inhibert av SV-40 Tag, viser vi at p19
Arf kan også modulere angiogenese program, i det minste delvis via p53-uavhengige mekanismer. Genetisk ablasjon av
Arf i
RIP-Tag2 mus resulterte i en betydelig akselerasjon av tumorigenesis sti, som var forbundet med en økt frekvens av holmer som gjennomgår en angiogen bryter og tidligere tumordannelse. Spesielt, hyperproliferative bryteren ble ikke berørt, og heller ikke var spredning /apoptose indeksene på ethvert stadium av veien til tumordannelse.
Til tross for økt frekvens av angiogene veksling, blodkar innenfor de resulterende angiogene lesjoner var ikke signifikant forskjellig fenotypisk mellom
RIP-Tag2; Arf
+ /+ Hotell og
Arf
– /-
mus, i samsvar med tidligere studier i denne modellen, hvor endrede angiogene koblingsfrekvenser skjedd uten ledsagende endringer i fartøy morfologi eller svulst celle apoptose /spredning ved genetisk knockout av MMP-9 [33] eller nøytrofil-ablasjon [24]. Fraværet av globale forskjeller i graden av nøytrofile rekruttering til pre-angiogene lesjoner i
RIP-Tag2; Arf
– /-
sammenlignet med
Arf
+ /+
mus antyder at Arf kan modulere angiogenese via en alternativ mekanisme. Men på grunn av den multi-fokal og stokastiske natur av denne tumormodellen, hvori bare ca. 15-20% (basert på totalt 400 øyer /mus) av hyperplastiske lesjoner vil bli «angiogene» (denne frekvensen økes med bare noen% i
Arf
– /-.
mus) muligheten er fortsatt at uoppdaget forbigående endringer i nøytrofile i en liten undergruppe av lesjoner kan regnskap for økt forekomst av angiogen veksling
mens det er for tiden uklart hvilken spesifikt signal (e) driver den første rekruttering av inflammatoriske celler og initiering av den angiogene bryter, foreslår den nåværende paradigmet som en forstyrrelse i balanse mellom endogene pro- og anti-angiogene faktorer er avgjørende [34] . Spesielt, av de mange p53-uavhengige funksjoner av ARF som er blitt beskrevet hittil [8], flere kan tenkes å potensielt påvirke den angiogene bryter. Spesielt NF-kB og c-Myc, som begge har vært implisert i regulering av angiogenese via deres effekt på ekspresjon av proinflammatoriske mediatorer [35], [36], [37], er blitt identifisert som p53-uavhengig mål av ARF [38], [39]. I tillegg nukleolært lagring av de store induserer angiogenese, HIF-1α av ARF har vist seg å regulere transkripsjonen aktivitet [40]. Videre en fersk komplementær studie av Kawagishi et al. foreslått en p53-uavhengig rolle for ARF i å undertrykke tumorangiogenese via post-transkripsjonen kontroll av VEGF-A uttrykk [30]; Men i RIP-Tag2 PNET svulster, VEGF protein nivåer ble ikke signifikant endret ved tap av Arf. Dermed antyde vi at økt uttrykk nivåer av VEGF ikke lå til grunn tidligere angiogene switching, selv om vi ikke kan utelukke mulige endringer i VEGF biotilgjengelighet, mediert for eksempel ved økt matrise nedverdigende proteolytisk aktivitet.
En potensiell rolle for ARF i prosessen for vaskulogenese og /eller angiogenese har tidligere vært postulert [8], som stammer fra den demonstrasjon av at Arf kan regulere vaskulær utvikling i mus øyet [25], en av de eneste beskrevne funksjoner av ARF bortsett fra tumor suppresjon. En mekanisme der tap av Arf forbedrer PDGF signalering, noe som resulterer i en overdreven spredning og akkumulering av PDGFRp + perivaskulær celler ble foreslått å forklare vaskulær defekt resulterer i blindhet i
Arf
– /-
mus. Mens det var ingen målbare endringer i pericyte opphopning i blodkar av
RIP-Tag2; ARF
– /-
angiogene lesjoner, gjenstår muligheten for at den innledende rekrutteringen av Pdgrβ + perivaskulære celler til neovaskulatur kan bli stimulert enten direkte eller indirekte (for eksempel via sekresjon fra en som ennå ikke identifisert pro-angiogene faktor fra Arf-null pre-neoplastiske /tumorceller) ved tap av Arf.
Ekspansiv svulst utvikling /vekst krever ikke bare deregulering av cellevekst og overlevelse signaler, men også innebærer vesentlige endringer til begynnende svulstens mikromiljø. Spesielt er dannelsen av en blodtilførsel kritisk for tumorvekst og metastase. Emerging bevis tyder på at onkogener og tumor dempere kan påvirke svulst utvikling, ikke bare via celle-autonome funksjoner i regulere spredning /apoptose, men også via direkte modulering av angiogenese regulatorer. Myc-onkogenet er blitt vist å regulere angiogenese via direkte induksjon av pro-inflammatorisk mediator, IL-1β, som fremmer MMP aktivering og frigjøring av sekvestrert VEGF fra den ekstracellulære matriks [41]. Ras, via aktivering av Myc, kan aktivere angiogenese gjennom undertrykkelse av den angiogenese-inhibitor, trombospondin-1 [42]. På samme måte har tumor suppressor p53 vist å positivt regulere trombospondin-1-ekspresjon [43], [44], så vel som fremstillingen av de anti-angiogene kollagen-avledede fragmenter endostatin og tumstatin [45]. Vi heri avdekke en rolle for p19
Arf i å begrense den tumor angiogene bryter, noe som viser at tap av Arf uttrykk fremmer den angiogene bryter og fremskynder tumorutvikling, via både p53-avhengige og uavhengige mekanismer, i en modell av flertrinns karsinogenese .
