Abstract
Ulike typer histone metylering har vært assosiert med kreft progresjon. Avhengig av metylering området i histonproteinene, dens virkninger på transkripsjon er forskjellige. DPY30 er et vanlig medlem av SET1 /MLL histone H3K4 metyltransferase komplekser. Imidlertid har sitt uttrykk og roller i magekreft er dårlig karakterisert. For å avgjøre om DPY30 har patofysiologiske roller i magekreft, ble uttrykket og roller undersøkt. Immunhistokjemi og sanntids-PCR viste opp-regulering av DPY30 ekspresjon i noen gastriske cancercellelinjer og pasientens vev. Dens knockdown av siRNA redusert spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, mens dens overekspresjon viste det motsatte effekter. Disse resultatene indikerer at DPY30 har viktige roller i spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, og foreslår DPY30 kan være et terapeutisk mål i magekreft
Citation. Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) Roller av DPY30 i spredning og motilitet av magekreft celler. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10,1371 /journal.pone.0131863
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 03.03.2015; Godkjent: 08.06.2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Bio Medisinsk teknologi Development Program (# 2012M3A9C6050213, OSO) og Basic Science Research Foundation (# 2012R1A1A3010521, HME) av National Research Foundation (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MEST), og med et stipend fra National R D Program for Cancer Control, departementet for helse, velferd og familiedepartementet, republikken Korea (# 0920050, OSO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kovalente modifikasjoner av histon haler, for eksempel, acetylering, fosforylering, ubiquitinering, og metylering, modulere kromatinstruktur og spille sentrale roller i regulering av cellesyklusprogresjon, gentranskripsjon, reparasjon DNA, embryoutvikling, og cellulær differensiering [1, 2]. Mens øket histon acetylering er vanligvis forbundet med transkripsjonen aktivering, er den metylering av histon-korrelert med transkripsjonelle aktivering og undertrykkelse. For eksempel er metylering av histon H3 lysin 9, 20, eller 27 rester (H3K9, H3K20 eller H3K27) som er involvert i transkripsjonen genet Slå, men på den annen side, metylering ved H3K4, H3K36, eller H3K79 assosiert med åpen kromatin og aktiv gentranskripsjon [3].
i pattedyr, mono-, di- og tri-metylering av H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, og H3K4me3) er utført av seks distinkte set1 /MLL familie komplekser (SET1A, SET1B , MLL1, MLL2, MLL3, og MLL4) [4, 5]. Disse H3K4 metyltransferaser (H3K4MT) inneholder ulike katalytiske subenheter, og aktiviteter av alle seks familie komplekser styres av vanlige multi-subenhet kjernekomponenter, som inkluderer WDR5, RBBP5, ASH2L, og DPY30, og er også referert til som WRADs. [6-9]. Et tap av noen underenhet av WRAD komplekse resulterer i redusert H3K4 metylering. WDR5 og RBBP5 er avgjørende for alle tre typer metylering av H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, og H3K4me3), mens ASH2L og DPY30 er i hovedsak kreves for H3K4me3 [6, 8, 10, 11].
DPY30 er en medlem av alle menneskelige set1 /MLL komplekser, og er nødvendig for full sET1 /MLL metyltransferase aktivitet [10, 12]. DPY30 har vært implisert i differensieringen potensialet i embryonale stamceller (ESCS) langs den neuronale linage [10] og er avgjørende for korrekt differensiering og proliferasjon av hematopoietiske stamceller [12]. Videre uttømming av DPY30 forårsaker celler til å angi en alderdom lignende tilstand og for å oppregulere p16 (CDKN2A) og p15 (CDKN2B), som er direkte involvert i senescence [13].
Magekreft er en av de ledende årsaker til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [14]. Selv om de siste diagnostiske og terapeutiske fremskritt gir utmerket overlevelse for pasienter med tidlig magekreft, er sykdommen vanligvis diagnostisert på et sent stadium når prognosen er dårlig [15]. Gastrisk karsinogenese innebærer den progressive ansamlinger av forskjellige genetiske og epigenetiske forandringer, noe som fører til gain-of-funksjon av onkogener og tap-av-funksjon av tumorsuppressorgener. Videre, siden gentranskripsjon sterkt avhengig av kromatinstruktur, endret eller unormal histon metylering er typisk assosiert med tumorprogresjon og prognose av kreft [16], og selv om status for histon metylering har blitt godt beskrevet i mange typer av kreft, dette aspektet fortsatt uklart i magekreft [16, 17].
i denne studien, for å avgjøre om DPY30 har patofysiologiske roller i magekreft, ble uttrykket og roller undersøkt.
Materialer og metoder
Cell kultur og siRNA transfeksjon
de magekreft cellelinjer utvunnet, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, og NCI-N87 ble kjøpt fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul). Den gastrisk epitel cellelinje, HFE145 var begavet fra professor Hassan Ashktorab (Howard University). Mage cancer cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2/95% luftatmosfære i RPMI 1640 supplert med 25 mM HEPES, 10% føtalt bovint serum (FBS) (GE Healthcare Life Science, South Logan , UT, USA) og 100 ng /ml penicillin /streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). DMEM (GE Healthcare Life Science) medium supplementert med 10% FBS og 100 pg /ml penicillin /streptomycin ble anvendt for HFE145 kultur. Cellene ble transfektert med små interfererende RNA (siRNA) eller kryptert (SCR) siRNA hjelp DhamaFECT reagens 1 eller 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. siRNA sekvenser var som følger: DPY30 siRNA duplex (ORF) (Bioneer, Daejeon, Korea), 5′-CAC UCU GAG UAC GGU CUC A (dTdT) -3 «, 5’CUC UGA GUA CGG UCU CAC A (dTdT) -3 «, 5’CUC ACU UAU UCU AGG UAC U (dTdT) -3′; DPY30 siRNA duplex (3»-UTR) (Bioneer); 5’CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) -3 «, 5’GAG GCA GCU UUA AUU GCC august AUC A (dTdT) -3»; WDR5 siRNA duplex (Bioneer), 5’HiG CUU GUG AAG CUC HiG U (dTdT) -3 «, 5’HiG GUG AUC UCA ACA GCU U (dTdT) -3», 5’CAG AUU CUA ACC UUC UUG U (dTdT) -3 «; RBBP5 siRNA duplex (Bioneer), 5’GUG UGA AAA GGG CUC AGU A (dTdT) -3 «, 5’CAG AUU CUC AGG AUC UUG U (dTdT) -3», 5’GUG Guu GAG AUU AGU AGA U (dTdT) -3 «; ASH2L siRNA duplex (Bioneer), 5’GUA UGA ACG GGU UUU Guu A (dTdT) -3 «, 5’CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) -3», 5’HiG UAC CUU UCA UGA CCA A (dTdT) -3 «; egge (SCR) siRNA (Thermo Scientific), 5’GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 «.
DPY30 overekspresjon
DPY30 cDNA ble klonet inn pLenti6.3 -V5 /DEST vektor (lentiviral reisemålet vektor) med
in vivo
rekombinasjon basert Gateway kloning system (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Donor vektor (pDONR221) husing cDNA sekvens av DPY30 ble kjøpt fra Ultimate ORF Clones (Invitrogen), og saman med counter-valgbar
CCDB
gen av pLenti6.3-V5 /MÅL bruker LR clonase enzymblanding (Invitrogen). Den tomme vektor pLenti6.3 /V5-MÅL ble brukt som en mock kontroll. Rekombinante lentiviruses ble produsert i 293ft celler, og brukes til å infisere SNU216 og SNU638 celler, i henhold til produsentens instruksjoner (ViraPower Lentiviral Expression System, Invitrogen). DPY30-overekspresjon stabile celler ble etablert av valget med blasticidin (7,5 mikrogram /ml) (Invitrogen).
For rednings analyser, vi endret, fulgt en protokoll «RNAi forstyrrelser bruker Precision Lenti ORF samling» (https://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). I korthet ble cellene infisert med rekombinante lentiviruses (pLenti6.3-V5 /MÅL eller DPY30-over-konstruksjoner). 24 timer etter transduksjon, ble mediet som inneholdt virus fjernet og erstattet med fullstendig kulturmedium. Den følgende dag, blasticidin ble tilsatt i en konsentrasjon på 7,5 ug /ml. Celler ble opprettholdt under utvalg i seks dager, ved å erstatte medium eller aging hver 2-3 dager etter behov. De utvalgte bestander av kontrollceller eller celler uttrykker DPY30 ble brukt til transfeksjon eksperimenter med DPY30 siRNA rettet mot den åpne leseramme (ORF) eller 3′-utranslatert region (UTR).
Real-time PCR
Vevsprøver ble innhentet fra 23 ubeslektede koreanske primære mage kreftpasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Pusan National University Hospital og Pusan National University Yangsan Hospital og ga skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av Pusan National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) og Pusan National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Total RNA fra vev og celler ble hentet ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) eller en RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ sanntid polymerasekjedereaksjon (real-time PCR) ble anvendt til å kontrollere DPY30 mRNA-nivåer. cDNA ble syntetisert med MMLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA), dNTP, og oligo-dT primere. Primersekvensene som ble brukt var som følger: DPY30, 5′- AAC GCA GGT TGC AGA AAA TCC T 3 «og 5′-TCT GAT CCA GGT AGG CAC GAG -3»; WDR5, 5’TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 og 5’CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT -3 «; RBBP5, 5’AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT -3 «og 5’TCA CAG TCG CCT GAA AGA AC -3»; ASH2L, 5’TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC -3 «og 5’CCA GCC CAT GTC ACT CAT AG -3»; GAPDH, 5’TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 «og 5’CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3». Real-time PCR ble utført ved hjelp av en LightCycler ™ 96 Real-time PCR system (Roche, Nutley, NJ) og Faststart Essential DNA Grønn Master (Roche), i henhold til produsentens instruksjoner. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll.
Immunhistokjemi
Immunohistokjemisk farging med kanin anti-humant DPY30 polyklonalt antistoff (Sigma-Aldrich) ble utført på en gastrisk cancer vev gruppe (n = 59) som kjøpes fra SUPER BIO CHIPS (Seoul) eller på 4-mikrometer deler av parafin-embedded prøver. I korthet, etter deparaffinization og rehydratisering, ble objektglass behandlet med 0,3% hydrogenperoksid i 30 minutter for å inhibere endogen peroksidase-aktivitet, og blokkert med 10% normalt esel serum (NDS) og 1% BSA i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Platene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C i blokkeringsbuffer inneholdende kanin anti-humant DPY30 primære antistoff (1:80, Sigma-Aldrich). Sekundært antistoff (HRP-konjugert) binding ble utført ved en fortynning på 1: 200 i blokkeringsbuffer i 2 timer ved RT. Deteksjon ble utført med HRP (Vector Laboratories), og lysbilder ble kontra ved å behandle dem i 1 minutt med hematoksylin flekker buffer (Sigma-Aldrich).
Celleproliferering analysen
En dag etter transfeksjon cellene med siRNA, ble mediet erstattet med 1% FBS medium, og fire dager senere ble 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) tilsatt og inkubert i 0,5 til 2 timer. For å kontrollere effekten av DPY30 overekspresjon på celleproliferasjon, ble cellene sådd ut i 10% FBS medium, og etter tre dagers dyrking, ble 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO) tilsatt og inkubert i 0,5 til 2 timer. Celle viabilities ble bestemt ved å måle absorbans ved 450 nm ved hjelp VICTOR3 flere lesere (PerkinElmer, MA, USA).
Boyden kammeret analysen
En modifisert Boyden transwell kammeret (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA) ble anvendt. Den nederste kammer ble fylt med 50 pl RPMI inneholdende 10% FBS. For å undersøke effekten av DPY30 kjent ned, SNU1 og SNU16 (ikke-heftende celler) ble transfektert med ORF målretting siRNA. En dag etter transfeksjon ble cellene vasket, suspendert ved en tetthet på 5 x 10
5 celler /ml i 50 ul av RPMI supplert med 0,5% FBS, og sådd inn i det øvre kammer. For å fjerne virkningene av proliferasjon, ble mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) ble tilsatt. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2. Antallet migrerte celler ble evaluert ved å telle cellene i bunn brønner. For å undersøke effekten av DPY30 overekspresjon, de stabile celler (heftende celler, SNU216 og SNU638) ble brukt. Celler (mock og DPY30-mer) ble trypsinert og sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
5 celler /ml. For å fjerne effekten av spredning, ble mitomycin C tilsatt. Celler ble tillatt å migrere til fire timer, ble membraner fiksert og farget ved hjelp av Diff-quik løsning (Sysmex, Kobe, Japan) og vasket med destillert vann. Celle tall i 10 tilfeldig utvalgte felt ble telt ved hjelp av et lysmikroskop. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Matrigel invasjonen assay
De invasive evner av kreftceller ble vurdert ved hjelp av 8-mikrometer porøse BioCoat Matrigel kammerinnsatser (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). En dag etter transfeksjon med SCR eller DPY30 siRNA, ble cellene trypsinert og suspendert ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /ml i 500 ul av RPMI supplert med 0,5% FBS og mitomycin C (0,01 ug /ml, Sigma -Aldrich). Cellene ble deretter tilsatt til kammerinnsatser og plasseres i brønner fylt med 0,7 ml av medium supplert med 10% FBS som kjemotiltrekkende. Etter inkubering i 24 eller 48 timer ble de ikke-invaderende celler på toppen av membranen fjernet ved skraping, og invaderende celler på bunnen av membranen ble fiksert og farget med Diff-quik oppløsning (Sysmex). Celle tall i 10 tilfeldig utvalgte felt ble telt ved hjelp av et lysmikroskop. Forsøk ble utført in triplo og minst 5 felt ble tellet per eksperiment.
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SDS) av tre uavhengige eksperimenter. Betydningene av forskjeller ble bestemt ved bruk av Student
t
-test for uparede observasjoner.
P
verdier av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Uttrykk av DPY30 i mage kreft vev
For å undersøke DPY30 uttrykk i menneskelig magekreft, utførte vi immunhistokjemi hjelp av en magekreft vev matrise eller arkiv parafin-vevssnitt. I normale gastrisk vev, DPY30 ekspresjon var vanskelig å oppdage (Fig 1 A), men i kreftvev DPY30 protein ble allment overuttrykt (fig 1B-1D). Spesielt DPY30 ble overuttrykt i invadere mage kreftceller (fig 1B-1D). Videre har vi bestemt mRNA nivåer av DPY30 i en udødelig normal gastrisk epitel cellelinje (HFE145) og seks magekreft cellelinjer utvunnet (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 og NCI-N87) ved hjelp av real-time PCR. MRNA nivået av DPY30 var betydelig høyere (endring 5) i SNU1 og SNU16 enn i HFE145 celler, mens uttrykket nivået av DPY30 i SNU216, SNU620 og SNU638 var lik de i HFE145 celler og var lavere (endring 10) i NCI-N87 (fig 1E). Vi har også sjekket mRNA nivåer av DPY30 i mage kreft vev. DPY30 ble sterkt uttrykt i 15 tilfeller (15/23, 65%) sammenlignet med normalt vev (figur 1F). Disse resultatene indikerer at DPY30 uttrykkes sterkt i noen humane gastriske cancere.
(A-D) Immunhistokjemisk farging viste overekspresjon av DPY30 i magekreft vev. Spesielt dets overekspresjon var tydeligvis større i invaderende kreftceller (B-D) enn i normal gastrisk mucosa (A). (E) Den mRNA nivået av DPY30 i mage kreftceller (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 og NCI-N87) og normal mage epitelceller (HFE145) ble bestemt ved real-time PCR med spesifikke primere for DPY30. GAPDH ble anvendt for å normalisere dataene. Viste verdiene er gjennomsnitt ± SDS av de tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus HFE145). (F) Uttrykket av DPY30 i mage kreft vev ble undersøkt ved real-time PCR med spesifikke primere for DPY30. GAPDH ble anvendt for å normalisere dataene. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0,01; **,
p
0.05 (Student
t
test, kontra normal).
Roller av DPY30 i spredning av magekreftceller
For å bestemme mulige roller DPY30 i mage kreftceller, må vi først slått ned DPY30 bruker ORF målretting DPY30 siRNA og overvåket sin knockdown effektivitet ved real-time PCR (fig 2A). ORF-målretting DPY30 siRNA (100 nM) ble redusert mRNA-nivået av DPY30 i HFE145, SNU1, SNU16, SNU216, og SNU638 celler sammenlignet med egge siRNA (SCR) med 78%, 89%, 79%, 76%, og 88%, respektivt. Fem dager etter transfeksjon celler med SCR eller ORF målretting siRNA, utførte vi spredningsanalyser. Knockdown av DPY30 hemmet de proliferations av HFE145, SNU1 og SNU16 sammenlignet med SCR med 31%, 69% og 71% henholdsvis mens knockdown påvirket ikke proliferations av SNU216 og SNU638 (Fig 2B), hvor uttrykket nivå DPY30 var lav (figur 1E). Deretter produserte vi DPY30-overekspresjon cellelinjer (DPY30-eldre) bruker HFE145, SNU216 og SNU638 celler, og deretter sammenlignet DPY30 mRNA nivåer i mock-celler (kontroll) og DPY30-over-celler. Real-time PCR resultater viste at uttrykket nivået av DPY30 var 4,2, 3,5 og 3,2 ganger høyere i DPY30-overekspresjon HFE145, SNU216 og SNU638 celler enn mock celler, henholdsvis (figur 2A). DPY30 overekspresjon forbedret proliferations av HFE145, SNU216 og SNU638 celler versus mock-celler ved 1,9, 2,2 og 1,6 ganger i henholdsvis (figur 2B).
(A) Sanntids-PCR ble benyttet for å bestemme effektiviteten av knockdown eller overekspresjon av DPY30 i HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 og SNU638 celler. Knockdown effektivitet ble bestemt etter transfeksjon cellene med 100 nM DPY30 siRNA rettet mot ORF eller egge siRNA (SCR). Overekspresjon effektivitet ble bestemt i DPY30-overekspresjon og mock celler. (B) Effekt av DPY30 knockdown eller overekspresjon på celleproliferasjon. En cellelevedyktighet analyse ble anvendt for å måle celleproliferasjon i nærvær av 1% FBS. For de DPY30 knockdown forsøkene ble celle levedyktighet analyser utført fem dager etter trans 100 nM DPY30 siRNA eller SCR. Etter tre dagers kultur, ble cellenes levedyktighet analyser utført på DPY30-over og mock-celler. (C) Expression analyse av DPY30 etter kjente-ned eller overekspresjon av henholdsvis sirnas eller DPY30 ORF. ORF-målretting eller 3′-UTR-targeting siRNA ble brukt for knock-down. (D) Eksogene DPY30-ORF reddet hemming av spredning av 3′-UTR-targeting DPY30 siRNA. Mock eller DPY30-overekspresjon celler ble transduced med to typer DPY30 siRNA (3′-UTR-targeting eller ORF målretting), ble deretter celleviabilitet analysen undersøkes. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus SCR eller Mock).
For å bekrefte spesifisiteten av DPY30 siRNA, utførte vi redningsforsøk. For redningsforsøk, brukte vi en DPY30 siRNA rettet mot 3′-UTR stedet for ORF fordi ORF målretting siRNA kan også svekke den eksogene DPY30 ORF DNA vi innført. For å overuttrykker DPY30, vi omformet SNU1 og SNU16 med viruspartikler, pLenti6.3-V5 /MÅL (kontroll) eller DPY30-ORF-over-konstruksjoner. DPY30-overekspresjon SNU1 eller SNU16 celler viste høyere uttrykk av DPY30 2,1 eller 2,5 ganger høyere enn mock celler, henholdsvis (figur 2C). ORF-målretting siRNA førte til nedregulering av DPY30 ekspresjonsnivåer ved større enn 75% i mock samt DPY30-overekspresjon celler. 3′-UTR-målretting siRNA nedregulert den DPY30 ekspresjon av mer enn 85% i mock-celler, mens det i de DPY30-overuttrykkende celler, det reduserte DPY30 uttrykk til et nivå lik den til SCR siRNA-transfekterte celler ( fig 2C). Dette resultatet indikerer at det eksogene DPY30-ORF DNA er resistent mot 3′-UTR-målretting siRNA og uttrykkes ved et lignende nivå som det av endogen DPY30 mRNA. ORF målretting siRNA hemmet spredning av celler uavhengig av eksogene DPY30 uttrykk (Fig 2D). Spredning ble også hemmet av 3’UTR målretting siRNA i håne celler, men det ble delvis hemmet i DPY30-overekspresjon celler. I DPY30-overuttrykkende celler, redusert ORF-målretting siRNA spredning av SNU1 og SNU16 sammenlignet med SCR siRNA med 74% og 66%, henholdsvis, men det 3′-UTR-målretting siRNA redusert med 20% og 8%, respektivt . Dette resultatet indikerer at eksogene DPY30 redder hemming av proliferasjon indusert av 3′-UTR-targeting siRNA, og fenotyper forårsaket av DPY30 bestemt siRNA ikke er off-target effekter.
Fordi DPY30 er en del av Wards undersøkte vi uttrykk og roller andre komponenter av avdelinger. Real-time PCR viste at mRNA nivåer av WDR5 og RBBP5 i SNU1, SNU16, SNU216 og SNU638 var lik de HFE145. Imidlertid mRNA nivået av ASH2L var betydelig høyere (endring 3) i SNU1 og SNU16 enn i HFE145 celler (fig 3A) som DPY30 i figur 1E. For å undersøke om WRAD komponenter er forbundet med spredning av mage kreftceller, knockdowned vi hver WRAD komponent ved hjelp av deres spesifikke siRNA og overvåkes knockdown effektivitet ved real-time PCR (Fig 3B). Hver siRNA (100 nM) ble redusert til mRNA-nivåer i SNU1 og SNU16 celler sammenlignet med SCR med 65% -75%. Knockdown av WDR5 og RBBP5 hemmet spredning av SNU1 og SNU16 celler sammenlignet med SCR med 30-48% (Fig 3C). Imidlertid ASH2L hemmet proliferasjonen av SNU1 og SNU16, hvor ekspresjonsnivået av ASH2L var høy sammenlignet med SCR med 85% og 75%, respektivt.
(A) mRNA-nivåene av WDR5, RBBP5 og ASH2L i HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 og SNU638 celler ble bestemt ved real-time PCR, bruker spesifikke primere for WDR5, RBBP5 og ASH2L. GAPDH ble anvendt for å normalisere dataene. (B) Pusse effektivitet ble bestemt ved real-time PCR. Knockdown effektivitet ble bestemt etter trans celler med 100 nM WDR5, RBBP5 og ASH2L siRNA eller kryptert (SCR). (C) Effekter av WDR5, RBBP5 og ASH2L knockdown på celleproliferasjon. En cellelevedyktighet analyse ble anvendt for å måle celleproliferasjon i nærvær av 1% FBS. 24 timer etter transduksjon, ble celleviabilitet analyser utført. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus HFE145 (A) eller SCR (BC)).
Roller av DPY30 i migrasjon og invasjon av magekreftceller
Vi neste undersøkt om DPY30 regulerer migrasjonen av mage kreftceller. Knockdown av DPY30 redusert de FBS-induserte vandringer SNU1 og SNU16 celler versus SCR med 35% og 45%, henholdsvis (figur 4). I kontrast, DPY30 overekspresjon økte FBS-induserte vandringer SNU216 og SNU638 celler versus mock celler med 2,5 og 2,2 ganger i henholdsvis (figur 4). Disse resultatene førte oss til å undersøke hvilken rolle DPY30 i invasjonen av mage kreftceller. I en Matrigel invasjonen assay, DPY30 siRNA hemmet de FBS-indusert invasjoner av SNU1 og SNU16 celler versus SCR siRNA med 65% og 84%, henholdsvis (figur 5A og 5C). Videre DPY30 overekspresjon økte FBS-indusert invasjoner av SNU216 og SNU638 celler versus mock celler med 3,2 og 2,9 ganger i henholdsvis (figur 5B og 5C). Disse resultater viser at DPY30 fremmer migrering og invasjon av magekreftceller.
(A) A Boyden kammer analyse ble anvendt for å måle migrering av magekreftceller. 10% FBS ble anvendt for å indusere migrering og mitomycin C (0,01 ug /ml) ble tilsatt for å fjerne virkningene av proliferasjon. To dager etter transfeksjon med 100 nM ORF-måls DPY30 siRNA eller kryptert (SCR) siRNA ble migrasjonsanalyser (Boyden kammer assay) utført. Migrasjon analyser ble utført på DPY30-over og mock celler etter kultur for en dag. Bar = 100 mikrometer. (B) migrerte celler ble talt opp og resultatene er presentert som et søylediagram. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus SCR eller Mock).
(A-B) En Matrigel invasjonen assay ble brukt til å måle magekreft celle invasjon. Presentert resultatene er representative for de resultatene som oppnås. 10% FBS ble anvendt for å indusere invasjon, og mitomycin C (0,01 ug /ml) ble tilsatt for å fjerne effekter av proliferasjon. Invasion ble utført to dager etter transfeksjon med 100 nM ORF-måls DPY30 eller SCR siRNA. Etter dyrking i en dag, ble invasjon assay gjennomført for DPY30-over og mock-celler. Bar = 100 mikrometer. (C) Invasive celler ble talt opp og resultatene vises som et søylediagram. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus SCR eller Mock).
Diskusjoner
Roller av DPY30 i kreft biologi har vært dårlig preget selv om sine roller i differensiering av ESCs og blodkreft stamceller hadde blitt rapportert [10, 12]. I denne studien, viste vi nye roller DPY30 i magekreft. DPY30 blir forsterket (data ikke vist) og sterkt uttrykt (figur 1) i en del magekreft vev. Videre sin knockdown eller overekspresjon regulert spredning, migrasjon og invasjon av mage kreftceller. Endringer i uttrykket, translokasjon og somatiske mutasjoner av gener som koder for subenheter av Set1 /MLL komplekser har blitt rapportert i mange kreftformer. Disse resultatene støtter de kritiske rollene til medlemmer av SET1 /MLL kompleks i kreft progresjon.
Up-regulering av DPY30 uttrykk ble kun observert i SNU1 og SNU16 mage kreftceller blant seks magekreftceller vi har undersøkt. Men det er opp-forskriften ble observert i mer enn halvparten av magekreft vev vi har undersøkt (fig 1). Det er vanskelig å forklare dette avviket. Imidlertid er det åpenbart at antallet av magekreftvevet vi har undersøkt er ikke nok. Så, er en omfattende uttrykk studie med mye mer rekke vev er nødvendig for å evaluere klinisk verdi i fremtiden.
Roller av SET1 /MLL H3K4 metyltransferase kompleks i kreft biologi er sammensatt. Regulatoriske subenheter av Set1 /MLL komplekser, inkludert WRAD, inneholder både potente teinene og tumor dempere. For eksempel, koder menn1 genet menin, en integrert subenhet av MLL1 og MLL2, og er mutert hos pasienter med multippel endokrin neoplasi type 1 (menn1) [18, 19]. Videre regulerer menin p18 (CDKN2C) og p27 (CDKN1B) ved å rekruttere MLL1 komplekse [20]. I motsetning til dette, WDR5, en komponent av WRAD komplekset, har blitt rapportert å virke som et oncoprotein i prostata cancer, i hvilken det er overuttrykt og avgjørende for androgen-indusert proliferasjon av tumorceller [21]. ASH2L, som er en annen del av WRAD komplekse og kan samhandle med oncoproteinet MYC [22], er avgjørende for MYC /Ha-RAS-avhengige transformasjon av rotte embryo fibroblaster. Videre er det overuttrykt i mange typer tumorer og er kritisk for spredning av tumorceller [23]. I denne studien, viste vi roller DPY30 som et oncoprotein i magekreft.
Hva er molekylære mekanismene bak rollene DPY30 i magekreft? Selv om vi ikke avsløre, kan flere hypoteser foreslås basert på tidligere studier. En av mulige hypoteser er at DPY30 overekspresjon fører til overexpressions av onkogener via økt H3K4MT aktivitet. Nedbryting av DPY30 eller ASH2L fører til en nedgang i H3K4me3, mens WDR5 og RBBP5 er avgjørende for alle tre typer H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, og H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Dessuten kan overekspresjon av DPY30 alene øke H3K4MT aktivitet [10]. Siden H3K4me2 /3 er et aktivt merke for transkripsjon [3, 24], økes H3K4MT direkte kan oppregulere mange gener, for eksempel, oncogener eller alternativt indirekte nedregulerer tumor-suppressorer. En tidligere rapport som støtter denne hypotesen er at ASH2L, en kritisk komponent i SET1 /MLL kompleks, har vist seg å spille som et oncoprotein [25, 26]. En annen tidligere rapport er at DPY30 aktiverer direkte uttrykk for ID-proteiner via H3K4 metylering [13, 27]. ID proteiner hemmet aktiviteter ETS1 og ETS2 som kan indusere en av tumor suppressor genet, p16. I denne studien, viste vi at komponentene i WRAD (WDR5, RBBP5 og ASH2L) kan hemme spredning av magekreftceller (fig 3), noe som tyder på at DPY30 handling gjennom økt H3K4MT aktivitet. Flere studier er nødvendig for å avdekke mekanismene bak rollene DPY30 i mage kreftceller.
