Abstract
Økt uttrykk av angiotensin II type 2 reseptor (AT2R) induserer apoptose i en rekke tumorcellelinjer, med enten Angiotensin II-avhengig eller Angiotensin II-uavhengig regulering, men det molekylære mekanismen er fortsatt dårlig forstått. Her har vi brukt PCR Array analyse for å fastslå genet og mikroRNA uttrykk profiler i menneskelige prostata kreft cellelinjer transduced med AT2R rekombinant adenovirus. Våre resultater viste at AT2R i forhold til ekspresjon fører til oppregulering av 6 apoptose-relaterte gener (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2), 2 cytokingener (IL6 og IL8) og en mikroRNA, og nedregule av en apoptose-relatert gen TNFSF10 og 2 cytokingener (BMP6, BMP7) i omsatte DU145 cellene. HRK ble identifisert som en oppregulert genet i AT2R-omformet PC-3 celler ved real-time RT-PCR. Deretter benyttet vi sirnas til taushet de oppregulert gener for å kunne fastslå deres roller på AT2R overekspresjon mediert apoptose. Resultatene viste nedregulering av Gadd45a redusert den apoptotiske effekt ved ~ 30% i DU145-celler, nedregulering av HRK redusert AT2R-mediert apoptose med mer enn 50% i PC-3-celler, mens nedregulering av TRAIL-R2 forbedret AT2R-mediert apoptose mer enn 4 ganger i DU145 cellene. Vi fant også at effektene på AT2R-mediert apoptose forårsaket av nedregulering av Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK var uavhengig i aktivering av p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53. Til sammen våre resultater viste at TRAIL-R2, Gadd45a og HRK kan være nye målgener for videre studier av mekanismen for AT2R-mediert apoptose i prostatakreftceller
Citation. Pei N, Jie F, Luo J, Wan R, Zhang Y, Chen X, et al. (2014) Gene Expression Profilering Associated med angiotensin II type 2 reseptor-indusert apoptose i Human prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (3): e92253. doi: 10,1371 /journal.pone.0092253
Redaktør: Gangjian Qin, Northwestern University, USA
mottatt: 06.12.2013; Godkjent: 19 februar 2014; Publisert: 21 mars 2014
Copyright: © 2014 Pei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China Grant 81072113 (HL), National 863 høy teknikk utviklingsprosjekter i Kina Grant 2012AA02A403 (HL), State Key Laboratory av Patogen og Biosikkerhet Program SKLPBS1103 (HL), samt ved tildelinger 2011A091000022, 2010B060500001 , 2011B060300028 og 2011B060300014 til WG fra den kinesiske regjeringen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste formen for kreft i nordamerikanske menn og er den nest største årsaken til kreft sykelighet og dødelighet i USA [1], selv om prognosen har økt på grunn av fremskritt i diagnostiske og kirurgiske teknikker . Hittil har ulike typer behandling for pasienter med hormon-ildfast kreft undersøkt, men ingen effektiv behandling har blitt rapportert. Derfor er nye behandlingsstrategier for prostatakreft presserende behov.
Angiotensin II (Ang II) er nøkkelen effektor i renin-angiotensin-systemet. Ang II har to reseptorer: Ang II type 1 og type 2 reseptorer (AT2R) [2]. AT2R, den andre hoved reseptoren isoform er hovedsakelig uttrykt i mesenchyme av fosteret, og i en begrenset utstrekning i voksent vev [3]. Det er vel-etablert at økt ekspresjon av AT2R induserer apoptose i en rekke cellelinjer, slik som pheochromocytoma, fibroblaster, glatte muskelceller og endotelceller via enten Ang II-avhengig eller Ang II-uavhengig regulering [4] – [11]. Våre tidligere undersøkelser viste at AT2R i forhold til ekspresjon betydelig indusert apoptose i prostatakreftceller [12]. En fersk undersøkelse viser at intratrakeal administrering av en nanopartikkel-basert terapi med AT2R genet demper kreft vekst lunge, og effekten er bedre enn TRAIL [13]. Til tross for suksess i opptegning av fysiologiske rolle, de molekylære og cellulære handlinger av AT2R-megle apoptose forblir udefinert. Her har vi brukt real-time PCR rekke analyse for å profilere et stort antall gener og microRNAs involvert i AT2R indusert apoptose i prostata kreft cellelinjer.
I denne rapporten, blant gener som kan være relatert i apoptose vei, det er 7 apoptose-relatert gen, 4 cytokiner og 1 mikroRNA uttrykk som ble endret i AT2R løpet uttrykt prostatakreftceller sammenlignet med kontroll. AT2R-indusert apoptose i DU145 cellene ble forsterket når TRAIL-R2 ble slått ned. Imidlertid ble apoptotiske effekter mediert av AT2R redusert i DU145 cellene når Gadd45a ble stille. Interessant, da HRK ble stille, apoptose indusert av AT2R ble redusert i PC-3 celler. Vår studie viste også at virkningene for AT2R-mediert apoptose forårsaket av nedregulering av TRAIL-R2 og HRK var uavhengig i aktivering av p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53. Vår studie skal bidra til identifisering av AT2R-sensing faktorer innblandet i apoptotiske sti i prostatakreftceller, og hjelpe oss til å forstå AT2R drevet apoptose bedre ved å gi mulige målgener for videre studier.
Materialer og Metoder
Cell Culture
Menneskelige prostata kreft cellelinjer (PC-3 og DU145-celler) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). PC-3-celler ble dyrket i F-12 medium og DU145-celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% FBS i henhold 5,0% CO
2. Sera og media ble kjøpt fra Invitrogen og American Type Culture Collection
rekombinant Adenoviral Bygg og klargjøring
rekombinant adenovirus vektorer ble konstruert, forberedt, og titreres som tidligere beskrevet [14]. En adenovirusvektor inneholdende den forbedrede green fluorescent protein-gen som styres av en cytomegalovirus-promoter (Ad-CMV-EGFP) og en adenoviral vektor som inneholder genomisk AT2R (G-AT2R) DNA med introner 1 og 2 og den kodende region og forbedret grønt fluorescerende protein-genet kontrollert av cytomegalovirus arrangører (Ad-G-AT2R-EGFP).
Cell Treatment
For viral transduksjon, prostata kreft celler (4 × 10
5) ble sådd inn i seks-brønns Corning vev kultur plater. Dagen etter ble cellene transduced med Ad-G-AT2R-EGFP eller kontroll vektor Ad-CMV-EGFP og endringer i cellen morfologi ble observert ved hjelp av et Olympus BX41 fluorescens mikroskop. Transduserte celler ble anvendt 24 til 48 timer senere, avhengig av den bestemte protokoll.
For de små interfererende RNA (siRNA) studier, DU145 og PC-3-celler ble transfektert med enten TRAIL-R2, GADD45A, TP53BP2, HRK eller kontroll siRNA hjelp Lipofectamine Reagens (Invitrogen) etter produsentens protokoll. Alle sirnas ble kjøpt fra Qiagen. Disse behandlinger ble etterfulgt 24 timer senere ved transduksjon med Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle), og deretter, 48 timer senere, antallet av apoptotiske celler eller apoptose-relaterte gener /proteiner ble undersøkt.
RNA Isolation og real-Time RT-PCR
Total RNA ble isolert fra behandlede DU145 og PC3 celler ved hjelp RNeasy Mini-Kit (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Isolert RNA gikk DNase I (OMEGA Biotek, Norcross, USA) behandling for å fjerne genomisk DNA. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved en ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop, Rockland, DE, USA), og den RNA renhet ble bekreftet ved 260/280 optisk tetthetsverdi fra 1,8 til 2,0. RNA-prøvene ble testet for nedbrytning status ved agarosegelelektroforese. Den isolerte RNA ble deretter omgjort til cDNA med Oligo dT og PrimeScript reverstranskriptase (TAKARA, Dalian, Kina) regenter. Fluorescerende kvantitativ PCR ble utført med den termo sykling betingelse: 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med 5 s ved 95 ° C og 34s ved 60 ° C. Prøvene ble analysert med ABI 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems) og underkastet sammenlignende △△ C
T-metoden ved anvendelse av human GAPDH som indre standard. Real-time PCR-produkter (8 mL) ble lastet på 2,5% agarosegel som inneholder etidiumbromid.
apoptotiske Gene Expression analyse ved hjelp av Real-Time PCR Array
Første cDNA syntese ble utført med RT
2 First Strand kit (C-03) i samsvar med protokollen gitt av produsenten (SABiosciences, Frederick, MD, USA) sikret cDNA prøvene ble deretter screenet for uttrykket av 84 viktige gener involvert i apoptose etter hjelp av human apoptose RT
2 Profiler PCR Array (PAH-012A, Superarray, Frederick, MD, USA) på en ABI 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), i henhold til produsentens protokoller. For å oppnå statistisk data, analyserte vi kontroll og eksperimentelle prøver på hver av de to tidsintervaller i tre eksemplarer. Uttrykk for målgener ble målt i forhold til gjennomsnittet terskelen syklus (C
T) verdier av fem forskjellige kalibrator gener (B2M, GAPDH, HPRT1, RPL13A og ACTB). Resultatene ble uttrykt som den relative ganger endring av genekspresjon i AT2R utført gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Gener med relativ fold endringer større enn ± 2 ble ansett som opp- eller nedregulert i uttrykket. Gener som ga en p-verdi på 0,05 ble ansett for å vise statistisk signifikans for studien
Menneske Cytokiner analyse ved hjelp av Real-Time PCR Array og Real-Time RT-PCR
. cDNA prøvene ble også screenet for ekspresjon av 84 pathway-fokusert cytokiner og ved hjelp av RT
2 Profiler PCR Array Menneskelig Common cytokiner (PAH-021A, Superarray, Frederick, MD, USA) på en ABI 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), i henhold til produsentens protokoller. Eksperimenter ble utført en gang mellom Ad-G-AT2R-EGFP-transduced celler og Ad-CMV-EGFP-induserte celler til skjermen cytokiner generelt.
Real-time RT-PCR ble brukt til å validere uttrykk profilering. Gener ble valgt på grunnlag av deres mulige fysiologiske roller og på i hvilken grad de ble regulert av overekspresjon av AT2R. Oligonukleotidprimere og TaqMan prober spesifikke for Bcl-2, ble IL6 og IL8 oppnådd fra Applied Biosystems. Isolering av totalt RNA ble utført som beskrevet ovenfor. Renset RNA (25 ng) ble benyttet for å gjøre RT-PCR i en Applied Biosystems Prism 7000 Sequence Detection System, med bruk av ett-trinns RT-PCR masterblanding Reagenser. Uttrykk av husholdningsgenet GAPDH ble brukt til å normalisere mRNA uttrykk. Kvantifisering og analyse av genekspresjon ble bestemt ved anvendelse av sammenligningssyklus grensen (C
T) -metoden som beskrevet i Applied Biosystems User Bulletin # 2. Primere som brukes til å påvise nivåer av andre cytokiner er vist i tabell 1 og real-time PCR ble utført ved hjelp SYBR Premiks Ex Taq (TAKARA) regenter som beskrevet ovenfor.
Menneske microRNAs analyse ved hjelp av Real-Time PCR Array og real-Time RT-PCR
For å kvantifisere miRNA uttrykket, total RNA ble ekstrahert fra Ad-G-AT2R-EGFP-omsatte og Ad-CMV-EGFP-induserte celler med RNeasy Mini-Kit (Invitrogen ). Den isolerte total RNA ble revers transkribert ved hjelp av OneStep PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA prøvene ble undersøkt for uttrykket 88 sti-fokusert mirnas miScript miRNA PCR Array Menneskelig Cancer PathwayFinder (MIHS-102Z, Frederick, MD, USA). På en ABI 7500 real-time PCR system
microRNAs ble analysert videre basert på deres mulige roller i kreft og uttrykket som ble betydelig regulert i miRNA PCR Array system. Denne grense ble valgt for å redusere antall gener til et mer gjennomførbar nummer og til å fokusere på disse gener hvis ekspresjon ble betydelig endret. Ved hjelp av disse kriteriene, var vi i stand til å begrense vårt fokus til 14 følgende mirnas: HSA-MIR-let7c; HSA-MIR-let7e; HSA-MIR-21; HSA-MIR-125; HSA-MIR-126; HSA-MIR-146; HSA-MIR-150; HSA-MIR-182; HSA-MIR-183; HSA-MIR-193; HSA-MIR-767; HSA-MIR-149; HSA-MIR-100; HSA-MIR-32. Relativ uttrykk ble beregnet via den komparative syklus terskel (C
T) metode med uttrykket av U6 liten kjernefysiske RNA som referanse. Uni-MIR qPCR Primer ble inkludert i pakken. Mengden av miRNA ble overvåket med SYBR Premiks Ex Taq II (Perfect Real Time) (Takara, Japan). PCR-betingelsene var 30-årene ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30-årene.
apoptose Assessment
Antall grønne fluorescerende celler som utviser apoptotisk lignende morfologi indusert av AT2R mediert apoptose etter transfeksjon sirnas ble vurdert ved å telle celler fra 10 tilfeldige felt per brønn. Tellinger ble gjort av en person som var blindet med hensyn til behandling.
Western Blot analyse
Vest immunoblotter ble kjørt som beskrevet tidligere [15]. Primære antistoffer og deres kilder var som følger. Anti-total p38 MAPK, anti-total p53, anti-total P44 /42 MAPK, anti-fosforylert P44 /42 (pp44 /42) MAPK, og anti-fosforylerte p53 (pp53) var fra Cell Signaling Technology. Anti-fosforylert p38 (pp38) MAPK var fra Millipore. Anti-β-actin og den sekundære antistoffer pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG og anti-kanin-IgG var fra Sigma-Aldrich. Anti-geit IgG var fra Santa Cruz Biotechnology.
Statistical Analysis
For alle forsøkene ble viral transduksjon gjort i tre eksemplarer brønner og gjentas minst tre ganger. Data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) fra 3 til 5 uavhengige forsøk. Statistisk analyse ble utført med SPSS 13.0 programvare. Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av t-test når bare to grupper ble sammenlignet, og ved ANOVA når 3 eller flere grupper ble sammenlignet. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Adenoviral-mediert uttrykk for AT2R i prostata kreft celler
I denne studien, DU145 celler infisert med Ad-G. AT2R-EGFP (100 IFU /celle, 2 dager) utviste et stort antall av apoptotiske celler sammenlignet med kontroll-vektor (fig. 1A, B, C, D), i samsvar med vår tidligere rapport [12]. Deretter real-time PCR ble anvendt for å bestemme den relative ekspresjon av AT2R. Våre resultater viste at AT2R ble betydelig overuttrykt i Ad-G-AT2R-EGFP-transduserte DU145 eller PC-3-celler på en doseavhengig måte (tabell 2 og fig. 1E, F).
DU145-celler var transduced med Ad-G-AT2R-EGFP (B og D) og Ad-CMV-EGFP (A og C) (100 IFU /celle) i 2 dager, og celle morfologi ble undersøkt under et fluorescens mikroskop. Skala barer, 50 pm. Total RNA ble ekstrahert fra transduserte celler DU145 og AT2Rs ble påvist ved sanntids RT-PCR. Etidiumbromid-farget gels vise AT2R (E) og GAPDH (F) transkripsjoner i transduced celler. M, DL 2000 DNA Maker (Takara); 1, 3, 5, 7, 9: transdusert med 10, 20, 50, 100, 200 IFU /celle separat fra Ad-G-AT2R-EGFP; 2, 4, 6, 8, 10. Transduced med 10, 20, 50, 100, 200 IFU /celle separat fra Ad-CMV-EGFP
TRAIL-R2 og Gadd45a Bidra til AT2R apoptose i celler DU145
PCR-Array-analyse ble utført for å bestemme de molekylære virkninger av AT2R ekspresjon i DU145-celler. Av de 84 genene representert i Human apoptose RT
2 Profiler PCR Array profiler, uttrykket nivåer av 6 gener (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2) var oppregulert og ett gen (TNFSF10) ble nedregulert i DU145 celler transduced med Ad-G-AT2R-EGFP (tabell 3, fig. 2). Disse differensielt uttrykte genene kan allokeres til gener som koder for tumor nekrose faktor (TNF) ligand familien (TNFSF10), TNF-reseptorfamilien (TNFRSF10B), Bcl-2-familien (BAG3, BNIP1, HRK) samt tumorprotein p53 bindings protein 2 (TP53BP2) og vekst arrest og DNA-skade-induserbar, alfa (Gadd45a). Interessant, BCL-2 ble ikke regulert betydelig i PCR Array analyse. Real-time PCR ble videre brukt til gyldigheten sitt uttrykk. Våre resultater viste at det var ingen signifikant endring i BCL-2 uttrykk i Ad-G-AT2R-EGFP-transduced DU145 cellene sammenlignet med Ad-CMV-EGFP-transduced celler (Fig. 3).
Celler behandlet med Ad-CMV-EGFP (200ifu /celle) ble brukt som kontroll.
DU145 celler ble transduced med enten Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) eller Ad-CMV-EGFP (EGFP ) for 2d på 200 IFU /celle. Disse behandlinger ble fulgt av total RNA isolering og deretter sanntids RT-PCR-analyse ved bruk av spesifikke oligonukleotidprimere og TaqMan prober. Alle data ble normalisert mot nivåer av GAPDH mRNA-ekspresjon i den samme prøven. Kolonner, mener fra tre separate forsøk.
siRNA forstyrrelser teknologien ble brukt til videre bestemme rollen fire oppregulert gener, inkludert TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 og HRK, i AT2R indusert apoptose i omsatte DU145 cellene. Transfeksjon av disse sirnas i DU145-celler ble redusert deres mRNA-ekspresjon (Fig. 4A). Behandling av DU145 celler med Gadd45a siRNA reduserte den apoptotiske effekt på omtrent 30%, mens TP53BP2 siRNA og HRK siRNA ikke føre til signifikant forskjell på AT2R-mediert apoptose sammenlignet med kontroller. Interessant, behandling av DU145 celler med TRAIL-2 siRNA betydelig økt AT2R-indusert apoptose mer enn 4 ganger sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler (Fig. 4B). Videre er økt apoptose var ikke på grunn av den direkte effekten av TRAIL-R2 siRNA, siden TRAIL-R2 siRNA alene forårsaket ingen apoptotiske resultater (data ble ikke vist).
DU145 cellene ble transfektert med TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 eller HRK siRNA (20 nmol /L) eller tak siRNA (20 nmol /L), etterfulgt av transduksjon med Ad-G-AT2R-EGFP (100 IFU /celle) i 2 dager. (A) sirnas mediert-reduksjon av mRNA-ekspresjon i transdusert DU145 celler; (B) Grønne fluorescerende celler som utviser apoptotisk morfologi, som ble talt fra 10 felt per brønn .. Columns, mener tre eksperimenter; barer, SE. *, P . 0,05
Sammen er disse dataene indikerer at apoptose indusert av AT2R overekspresjon er delvis avhengig av Gadd45a på DU145 cellene. TRAIL-R2 kan være en negativ regulator i AT2R-indusert apoptose i DU145 cellene.
HRK Bidrar til AT2R apoptose i PC-3 celler
Vurderer oppregulert gener produsert av overekspresjon av AT2R i DU145 cellene, vi neste utforsket effekten av AT2R overekspresjon på genene i PC-3 celler ved real-time RT-PCR. Vi viste at uttrykket nivåer av HRK (et pro-apoptotiske genet) ble øket i PC-3-celler på en doseavhengig måte og nådd et meget høyt nivå ved 100ifu /celle (fig. 5A).
A, HRK mRNA uttrykk i PC3 celler transduced med de angitte doser. B og C, ble PC3 celler behandlet med 20 nmol /L HRK siRNA eller kontrollere siRNA og Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle) som beskrevet i materialer og metoder fulgt 48 timer senere ved real-time RT-PCR-analyse (B) av enten HRK mRNA eller vurdering av celler med apoptotisk lignende morfologi (C). Kolonner, mener fra tre separate forsøk i hvert fall; barer, SE. *, P 0,05 versus kontrollceller
For å undersøke hvilken rolle HRK i AT2R-indusert apoptose i PC3 cellene ble HRK siRNA omformet til PC-3 celler for å redusere i HRK uttrykk (Fig. . 5B). Resultatet viste nedregulering av HRK i PC-3 celler betydelig redusert AT2R-indusert apoptose av ~45% (Fig. 5C).
involvering av Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK i AT2R apoptose Independent av p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53
Vi undersøkt videre nedstrøms signalveien forårsaket av AT2R over-uttrykk på celle apoptose. Vår tidligere studie viste at økt uttrykk for AT2R indusere apoptose gjennom aktivering av p38 MAPK veien [14]. Men i foreliggende undersøkelse, aktivering av p38 MAPK, p53 og P44 /42MAPK ble ikke observert i nedregulering av Gadd45a og TRAIL-mediert R2 AT2R-indusert apoptose i DU145-celler (fig. 6A, 6B, 6C). Lignende resultater ble også observert i PC3-celler (Fig. 7A, 7B, 7C). Dette tyder på at involvering av Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK i AT2R-mediert apoptose var uavhengig i aktivering av p38 MAPK, p53 og P44 /42 MAPK.
DU145 cellene ble transfektert med TRAIL-R2 siRNA
(Lane 1), etter Gadd45a
siRNA (Lane 2)
, TP53BP2 siRNA
(Lane 3)
, HRK siRNA
(Lane 4)
, kontroll
siRNA (Lane 5)
eller håne
(Lane 6)
fulgt 24 timer senere av transduksjon med Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle). Etter 2 d av inkubasjon ble cellene oppsamlet og utsatt for Western blot analyser (representative for tre forskjellige eksperimenter). (A) uttrykk nivåer av total P44 /42, pp44 /42 og p-aktin proteinbånd. (B) uttrykk nivåer av total p38, pp38 og p-aktin proteinbånd. (C) uttrykk nivåer av total p53, pp53 og p-aktin proteinbåndene.
PC-3 celler ble transfektert med HRK siRNA
(Lane1)
, kontroll
siRNA (Lane2)
eller håne
(Lane 3)
fulgt 24 timer senere av transduksjon med Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle). Etter 2 d av inkubasjon ble cellene oppsamlet og utsatt for Western blot analyser (representative for tre forskjellige eksperimenter). (A) uttrykk nivåer av total P44 /42, pp44 /42 andβ-aktin protein band. (B) uttrykk nivåer av total p38, pp38 andβ-aktin proteinbånd. (C) uttrykk nivåer av total p53, pp53 og p-aktin proteinbåndene.
Cytokiner og microRNAs Expression Validering
Opp og ned-regulert cytokiner og microRNAs ble undersøkt av Real- time PCR Array i omsatte DU145 cellene (Fig.8A, 9A). Real-time RT-PCR ble brukt til å validere cytokin og mikroRNA uttrykk profilering produsert av AT2R overekspresjon i DU145 cellene. Genene og microRNAs ble valgt basert på deres uttrykk endringer, som ble hentet fra PCR rekke analyse, og mulige fysiologiske roller på apoptose og spredning. De mRNA nivåer av IL8 og IL6 ble økt mer enn 2 ganger og 40% i DU145 celler transduced med Ad-G-AT2R-EGFP sammenlignet med Ad-CMV-EGFP-transduced celler (figur 8B . C), mens BMP6 ( fig. 8D), ble BMP7 (fig. 8E) ble redusert med 50% og 45% henholdsvis og uttrykk for BMP1, BMP4, BMP8B, TGFB1, TGFB2 og TGFB3 (Fig.8F, 8G, 8H, 8J) ble ikke vesentlig endret . Med hensyn til microRNAs, resultatet viste at mikroRNA 150 ble økt mer enn 5 ganger i DU145 celler transduced med Ad-G-AT2R-EGFP sammenlignet med Ad-CMV-EGFP-transduced celler, mens andre microRNAs ikke ble vesentlig endret (Fig. 9B). Disse resultatene var i samsvar med våre miScript miRNA PCR Array data.
DU145 celler ble transduced med enten Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) eller Ad-CMV-EGFP (EGFP) for 2 d 200 IFU /celle. Andre grupper av celler var mock transdusert. A. Opp og ned-regulert cytokiner ble undersøkt av Real-time PCR Array i DU145 cellene. Sanntids RT-PCR-analyse av enten IL8 (B), IL6 (C), BMP6 (D), BMP7 (E), BMP1 (F), BMP4 (G), BMP8B (H), TGFB1 (J), TGFB2 (J) og TGFB3 (J). Alle data ble normalisert mot nivåer av GAPDH mRNA-ekspresjon i den samme prøven. Kolonner, mener fra tre separate forsøk; barer, SE. *, P 0,05.
DU145 celler ble transduced med enten Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) eller Ad-CMV-EGFP (EGFP) for 2 d 200 IFU /celle. Disse behandlinger ble etterfulgt av isolering av mRNA og deretter sanntids RT-PCR-analyse av utvalgte mikroRNA. Alle data ble normalisert mot nivåer U6 uttrykk i den samme prøve. Kolonner, mener fra tre separate forsøk; barer, SE. *, P 0,05 versus Ad-CMV-EGFP-transduced. A. Opp og ned-regulert microRNAs ble undersøkt av Real-time PCR Array i DU145 cellene. B. Validering av mikroRNA uttrykk ved hjelp Real-time PCR.
Diskusjon
Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som klart vurdere apoptose-relatert gen, cytokiner gen og mikroRNA uttrykk profiler tilknyttet AT2R-indusert apoptose i prostatakreftceller. Det er også den første studien å rapportere om de direkte selektive effekter av Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK på apoptose indusert av over-uttrykk for AT2R i DU145 eller PC-3 celler. Disse resultatene gir viktig informasjon mot en bedre forståelse av molekylære mekanismen på AT2R-mediert apoptose i prostatakreftceller.
I denne studien, observerte vi at tvunget over-uttrykk for AT2R resultert i store endringer i et stort antall genet og mikroRNA uttrykk ved hjelp av PCR Array analyse. Deretter har vi vist at TRAIL-R2 og Gadd45a er involvert i apoptose indusert av AT2R i DU145 cellene og HRK spilt en viktig rolle i AT2R-mediert apoptose i PC-3 celler. Til slutt, TRAIL-R2, Gadd45a og HRK engasjementer i apoptose indusert av AT2R var uavhengig i aktivering av p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53 i prostatakreftcellelinjer.
Gadd45a ble oppregulert i AT2R-overexpressed DU145 cellene i vår nåværende studie. Gadd45a, en p53-regulert og DNA-skade-induserbar genet, er et medlem av Gadd45 familie av gener som er kjent for stress-sensorer, som modulerer cellulær respons overfor en rekke spenningsforhold, herunder genotoksiske og onkogen spenning [16] – [ ,,,0],19]. Andre studier har vist at Gadd45a hemmer tumor angiogenese via blokkering av mTOR /STAT3 sti [20]. Gadd45a er en transkripsjons mål for tumor suppressor p53 og BRCA1, som tap av funksjon spille viktige roller i utviklingen av kreft [21]. Videre Zerbini L, et al [22] har indikert at JUND, Gadd45a og Gadd45g som terapeutiske mål i prostata Caner. I samsvar med denne studien, våre data viste at AT2R-mediert apoptose var delvis avhengig Gadd45a i DU145 cellene.
De data som presenteres her indikerer at TRAIL-R2 er involvert i AT2R-mediert apoptose av DU145 cellene. Et stort antall bevis viser at TRAIL, en apoptose induserende ligand, utløser apoptose i flere cancercellelinjer uten toksisitet overfor normale celler [23]. TRAIL har minst fire celleoverflatereseptorer, og det induserer apoptose gjennom to nært beslektede reseptorer, TRAIL-R1 og TRAIL-R2 [24]. TRAIL-R1 og TRAIL-R2 indusere FADD avhengig apoptose og aktivere NF-kappaB vei [25]. Membranbundne sti /sine reseptorer er konstitutivt uttrykt ved høye nivåer i grunnskolen og metastatisk karsinom i nesten alle pasientene [26]. Vår studie presentert her viser at TNFSF10 (TRAIL) ble nedregulert mens TRAIL-R2 ble oppregulert i AT2R-overexpressed DU145 cellene. Interessant, nedregulering av TRAIL-R2 forbedret apoptotiske effekten indusert av AT2R overekspresjon betydelig. Våre data viser også at apoptose var umulig å oppdage når TRAIL-R2 ble slått ned bare. Derfor våre eksperimenter tyder på at TRAIL og TRAIL-R2 kan være negative regulatorer i AT2R-mediert apoptose i DU145 cellene, og den kombinerte behandlingen med AT2R overekspresjon og TRAIL-R2 downregulation kan være lovende som en ny genterapi mot human prostatakreft.
Noen tumorceller som er resistente mot TRAIL-indusert cytotoksisitet, selv om TRAIL har blitt rapportert å indusere apoptose av en rekke forskjellige tumorcelletyper [27], [28]. Unnlatelse av å gjennomgå apoptose har vært implisert i motstanden av kreftceller til TRAIL overvåking og derfor i tumorutvikling. De molekylære determinanter for TRAIL-indusert apoptose har ikke blitt grundig undersøkt i menneskelige prostata kreft celler. LNCaP og DU145 prostata kreft celler er resistente mot TRAIL-indusert apoptose, og TRAIL var mindre aktiv mot dem sammenligner med PC-3 prostatakreftceller [29], [30]. Følsomheten til TRAIL-indusert apoptose kan være korrelert til de relative uttrykk for TRAIL-R1 og TRAIL-R2 versus DcR1 og DcR2 eller intracellulære nivåer av Flame-1 [31], [32]. Men sammenlignet med LNCaP-celler, som har den laveste følsomheten for TRAIL-fremkalt apoptose, svært følsomme PC-3-celler viste tilsvarende eller lavere proteinnivåer av TRAIL-R1 og TRAIL-R2 og høyere nivåer av DcR2 [30]. Det er også funnet at uttrykket av TRAIL-R1 og TRAIL-R2 i TRAIL-sensitive MCF10A cellelinjen var ikke forskjellig fra resistente cellelinjer, f.eks 184B5 [33]. Dette gjør det usannsynlig at følsomheten for TRAIL-fremkalt apoptose er fullstendig styrt av de relative mengder av TRAIL-R1 og TRAIL-R2. Det tyder på at andre faktorer eller andre mekanismer kan være viktige regulatorer av følsomhet for TRAIL-indusert apoptose i disse kreftcellene. Sannsynligvis, i denne studien TRAIL-R2 negativt regulere AT2R-mediert apoptose i DU145 cellene vil hjelpe oss med å utforske mekanismene for følsomhet for TRAIL-indusert apoptose i forskjellige celler.
En veldig nylig observasjon at TRAIL-R2, tanke til bare opptre når stimulert av TRAIL på celleoverflaten, oppfyller en distinkt funksjon i kjernen hvor den fremmer celleformering i en TRAIL-uavhengig måte indikerer en spesifikk, spredning-assosiert funksjon av atom TRAIL-R2 [34]. Nuclear TRAIL-R2 hemmer modning av mikroRNA la-7 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og øker deres spredning. Bukspyttkjertelen tumorprøver har økte nivåer av atom TRAIL-R2, som korrelerer med dårlig resultat for pasientene [34]. Disse funnene tyder på at i kjernen, kan dødsreseptorer fungere som tumorpromotere og kan være terapeutiske mål, og mannen hjelpe oss videre studere sammenhengen mellom AT2R og TRAIL-R2.
Flere studier har vist at HRK (pro -apoptotic BH3-bare BCL-2 familiemedlem, Harakiri) er en pro-apoptotiske genet i flere celler [35] – [41]. HRK inaktivering er forbundet med en lav apoptotisk indeks i sekundær glioblastom [42]. I denne studien, viste vi at HRK ble oppregulert i AT2R-overexpressed DU145 og PC-3 celler, og når HRK ble stille, ble AT2R-mediert apoptose betydelig redusert i PC-3, men ikke DU145 cellene. Disse data indikerer at den apoptose indusert ved AT2R over-ekspresjon er i det minste delvis avhengig av HRK i PC-3-celler. Det er også vist at uttrykket nivåer av HRK ble økt i PC-3-celler i henholdsvis en doseavhengig måte. Kollektivt, våre funn indikerte at apoptose indusert ved overekspresjon av AT2R kan være avhengig av den HRK pro-apoptotiske reaksjonsvei i PC-3-celler. Men det er noen spørsmål som skal besvares slik som, mekanismen av apoptotiske sti fra AT2R til HRK ble ikke illustrert, og hvorvidt den HRK kunne utløser apoptose i andre prostatakreftceller.
Våre tidligere forsøk indikerer at AT2R indusert apoptose er ligand (Ang II) uavhengig, mediert av p38 MAPK og caspase-3, og skjer via en ytre celledød signalveien [12].
