Abstract
Fibroblaster i svulst mikromiljøet er en viktig determinant i progresjon av kreft, og kan være et lovende mål for cancerterapi. Insulinlignende vekstfaktorbindende protein 7 (IGFBP7) er kjent som en tumor suppressor i kolorektal cancer (CRC). Den foreliggende studien undersøkte induktive mekanismen for IGFBP7 ekspresjon i fibroblaster av supernatant fra de CRC-cellelinje SW620. Resultatene viste at ekspresjon av IGFBP7 var oppregulert i fibroblaster ved behandling med SW620 supernatant og eksogen TGF-β1. Den IGFBP7 indusert av SW620 supernatant eller TGF-β1 ble delvis inhibert av TGF-β1 spesifikt antistoff AF og TGF-β1 reseptorantagonist SB431542. Wnt signaleringsrettede gener, c-Myc, CCND1 og proteinene Dvl2 /3, ble alt opp-regulert i fibroblaster som uttrykker høye nivåer av IGFBP7, og den oppregulering kunne inhiberes både ved Wnt signale antagonist Dickkopf-1 ( DKK1) og av den TGF-β1 reseptorantagonist SB431542. Som konklusjon, CRC-celler fremmer høy ekspresjon av IGFBP7 i fibroblaster, mest sannsynlig gjennom ko-regulering av TGF-β og Wnt signalering i et Smad2 /3-Dvl2 /3 avhengig måte. Samlet utgjør disse data tyder på at fibroblaster kan være en roman terapeutisk mål i tumorterapi
Citation. Rao C, Lin SL, Ruan WJ, Wen H, Wu DJ, Deng H (2014) Høy Expression of IGFBP7 i Fibroblaster indusert av kolorektal kreft celler er co-regulert av TGF-β og Wnt signale i et Smad2 /3-Dvl2 /3-avhengig måte. PLoS ONE 9 (1): e85340. doi: 10,1371 /journal.pone.0085340
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 7 juli 2013, Godkjent: 04.12.2013; Publisert: 10 januar 2014
Copyright: © 2014 Rao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science Foundation Natural i Zhejiang-provinsen (LY12H16027), Natural Science Foundation National of China (30870971) og Major Program of Natural Science Foundation of China National (81090420, 81090421). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de mest ondartede svulster som truer menneskehetens overlevelse på verdensbasis, ranking tredje blant alle ondartede svulster [1]. Invasjonen og metastasering av kreftceller er den viktigste dødsårsaken. Mesteparten av forskningen har fokusert på selve svulsten, men den viktige rollen mikromiljøet i tumorprogresjon har også kommet for å bli gjenkjent.
En svulst kan betraktes som et sår som ikke gror, sin invasjon og metastasering er ikke bare bestemt av kreftcellene, men også av svulsten stroma [2]. Mikrometastaser danne lenge før en tumor kan diagnostiseres, og tumor-stroma interaksjon spiller en viktig rolle i løpet av tumorprogresjon. Fibroblaster er en av de mest viktige celle komponenter i tumor stroma, hvor de alltid skaffe en aktivert fenotype [3]. Akkurat som i fibrose, forblir fibroblaster i svulster vedvarende aktivert; de utskiller og modulere den ekstracellulære matriks (ECM) i stroma som spiller en viktig rolle i løpet av tumorprogresjon [3] – [5].
IGFBP7 er et utskilt protein som er kjent for å være en tumor suppressor i bryst , hjerne, tykktarm, lunge, lever og pankreas-kreft [6] – [11]. Det er et celleheftende glykoprotein av ~ 30 kD [12]. In vivo, ulike uttrykk mønstre av IGFBP7 funnet i ulike krefttyper. IGFBP7 uttrykk er lav i glioblastom, lungekreft, bukspyttkjertelkreft og leverkreft [6], [9], [10], [13], mens både økt og redusert ekspresjon av IGFBP7 har blitt rapportert i bryst- og prostatakreft [14] – [17]. Disse funnene antyder at rollen til IGFBP7 i tumorceller er kompleks, men studier på IGFBP7 i tumor stromaceller seg selv er sjeldne. I en rapport ble IGFBP7 funnet å fremme angiogenese i endotelceller [18], men den nøyaktige rollen til IGFBP7 i fibroblaster er fortsatt ukjent.
I løpet av tumor-stroma interaksjoner, fibroblaster kan bli påvirket av parakrine signale generert av kreftceller. Blant disse signalings, blir TGF-β antatt å være det mest potente en. TGF-B-aktiverte fibroblaster skape en viktig pro-invasjon og pro-angiogenese nisje for tumorutvikling [19] – [21]. Det har blitt rapportert at TGF-β signale virker hovedsakelig gjennom Smad trasé [22]. Ved aktivering binder TGF-β liganden til TGF-β reseptor I /II (TβRI /II), og de fosforylerte TβRI rekrutterer og fosforylerer reseptor-regulert Smads (R-Smads). Den TβRII-ALK5 kompleks aktiverer Smad2 /3, mens den TβRII-Alk1-komplekset aktiverer Smad1 /5/8. Når aktivert, R-Smads fosforylere og danner komplekser med Smad4, og beveger seg inn i kjernen for å regulere transkripsjonen aktivitet [23].
I tillegg til TGF-β signalering, Wnt signalering spiller også en viktig rolle i utvikling av CRC . Rapporter har påpekt at ~90% av CRC tilfellene skyldes mutasjoner av Wnt signalveien [24]. Ved kanonisk Wnt aktivering, wnt ligander bindes til frizzled reseptorer og LRP (low-density lipoprotein-reseptor-relatert protein) for å fremme fosforyleringen av LRP i en Dvl avhengig måte [25], [26]. Deretter p-LRP rekrutterer Axins fra degradering komplekset til cellemembranen, noe som hjelper β-catenin å unnslippe degradering. Akkumulert β-catenin beveger seg fra cytoplasma til kjernen, og danner en transkripsjon aktivering kompleks med TCF /LSF. Den TCF /LSF-β-catenin kjernefysiske komplekset aktiverer transkripsjon av Wnt signal målgener som c-myc, CCND1, FGF20, DKK1 og WISP1 som regulerer celleproliferasjon og differensiering [26] -. [29]
i denne studien brukte vi supernatanten fra SW620, en CRC-cellelinje som er avledet fra metastatisk tumor av en kolorektal karsinom, og HELF som er en av de kanoniske fibroblast cellelinjer. Det faktum at både SW620 og HELF er IGFBP7 negative cellelinjer gjør tolkningen av våre funn mer entydig. Hensikten med denne studien er å undersøke uttrykk mønster av IGFBP7 i fibroblaster og mekanismen bak den.
Materialer og metoder
Reagens og antistoffer
TGF-β1 rekombinant protein ble kjøpt fra Peprotech, USA. AF (TGF-β1 nøytraliserende antistoffer) og DKK1 rekombinante protein ble kjøpt fra R Kanin anti-β-aktin-antistoff, Santa Cruz, USA. Sekundære antistoffer for Odyssey ble kjøpt fra Li-COR, USA.
Cellekulturer
fibroblast (HELF) og CRC cellelinje SW620 var både dyrket i RPMI 1640 (Gibco, USA) supplert med Penicillin- streptomycin løsning (100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin, Gibco, USA), 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 50% supernatant fra CRC cellelinje SW620. Kulturmediet ble skiftet daglig i 3 dager, for begge cellelinjer. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære.
Fremstilling av SW620 supernatant
CRC-cellelinjen SW620 ble sådd ut i kulturflasker (8 x 10
5-celler) i RPMI1640 supplert med penicillin-streptomycin løsning (som ovenfor), og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Gibco, USA). Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Supernatanten (SW620-S) ble oppsamlet etter 2 dager, ble filtrert med et 0,22 um filter-membran (Millipore, Irland) og lagret ved -80 ° C.
Cell behandling
fibroblaster dyrket i kulturflasker ble vasket to ganger med PBS og deretter erstattet med RPMI1640 alene eller i 50% RPMI 1640 supplert med 50% friskt SW620-S, forskjellige konsentrasjoner av rekombinant TGF-β1 protein, med eller uten AF, SB431542 for forskjellige tidsperioder; behandlingene var uthvilt etter 3 dager, og uttrykk for IGFBP7 ble oppdaget av kvantitativ real-time PCR, RT-PCR og Western blot analyse.
kvantitativ real-time PCR (Q-PCR) og RT-PCR
Total RNA fra behandlede eller ubehandlede fibroblaster ble ekstrahert med TRIzol Reagens (Invitrogen, USA) og revers transkribert til cDNA ved hjelp Hevet II revers transkriptase (Takara, Japan). Q-PCR-reaksjoner ble utført med SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Japan) på ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Primere som brukes til Q-PCR ble utformet i henhold til genbanken (tabell S1). Den Q-PCR-betingelsene var som følger: denaturering i 10 sekunder ved 95 ° C, 5 sek denaturering ved 95 ° C, 30 sekunder gløding forlengelse ved 60 ° C i 40 sykluser. Fluorescens ble påvist ved slutten av hver fase. Transkripsjon av IGFBP7 ble normalisert til karakterutskriften nivået av husholdningsgenet GAPDH. RT-PCR reaksjoner ble utført med Taq (Takara, Japan). RT-PCR-betingelsene var som følger: 5 minutter denaturering ved 94 ° C, 30 sekunder denaturering ved 94 ° C, 30 sekunder annealing ved 59 ° C, 30 sekunder forlengelse ved 72 ° C i 30 cykler, 5 minutter forlengelse ved 72 ° C. Transkripsjon av IGFBP7 var normalisert til karakterutskriften nivået av husholdningsgenet GAPDH.
Western blot analyse
Fibroblaster ble lysert i RIPA buffer. Cellelysatene ble sentrifugert ved 1,33 x 10
5 rpm i en time ved 4 ° C, og proteininnholdet i supernatanten ble målt ved anvendelse av BCA proteinanalyse. 50 ug av total proteinekstrakt ble fylt i en 10% SDS-PAGE-gel og deretter ble proteinene overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad, USA). Membranen ble blokkert med 5% skummet melk TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% v /v Tween-20) i 2 timer ved romtemperatur og inkubert med primært antistoff (1:1000) over natten ved 4 ° C. Etter vasking med TBST 3 ganger, ble blottene probet med sekundært antistoff (1:5000) i 1 time ved romtemperatur. β-aktin ble benyttet til å normalisere mengden av proteinet lastet prøven. Immunoblotter ble skannet med Odyssey (LI-COR, USA). Semikvantitativ evaluering av båndene ble utført ved densitometrisk analyse med ImageJ programvare.
immunfluorescens-mikroskopi
Cellene på objektglassene ble fiksert i kald aceton i 10 minutter. Dekkglass med Cellene ble deretter vasket med PBS 3 ganger i 5 minutter ved romtemperatur, deretter permeabiliserte i 0,05% triton X-100 i 20 minutter og blokkert med 10% normalt bovint serum i 30 minutter. Celler ble inkubert med primære antistoffer fortynnet i PBS over natten ved 4 ° C. Objektglassene ble vasket i PBS før inkubasjon i 1 time med sekundære antistoffer og 20 minutter med DAPI (1: 5000; Invitrogen). Bilder ble tatt av en Zeiss LSM510 konfokal mikroskop.
Dataanalyse
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av 3 eksperimenter. Den uparet t-test ble anvendt for enkelt sammenligninger av grupper med lik varians og normalfordeling. Analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Newman-Keuls posttest ble benyttet for å sammenligne flere data for hver gruppe. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Prism programvare (GraphPad, USA).
P
verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Høy IGFBP7 uttrykk i fibroblaster er indusert av SW620-S
Gitt tumor- suppressor rolle IGFBP7 i CRC-cellelinjer [30] og høy ekspresjon i invasiv foran CRC tumorer (upubliserte resultater), de foreliggende funn viser at SW620-S indusert IGFBP7 ekspresjon i fibroblaster, etter inkubering av fibroblaster i nærvær av SW620-S for kortere eller lengre tid. Resultatene viste at SW620-S i det vesentlige oppregulert nivået av IGFBP7, sammenlignet med kontrollgruppen. Fibroblaster som er utsatt for SW620-S viste en tidsavhengig oppregulering av IGFBP7 mRNA (figur 1A og 1B). I tillegg ble den høye IGFBP7 uttrykk også påvist i fibroblaster behandlet med supernatanten fra de andre to CRC-cellelinjer HT29 og LoVo (figur 1C og 1D, fig S1).
A. B. IGFBP7 mRNA-ekspresjon bestemt ved RT-PCR (A) og Q-PCR (B) i fibroblaster utsatt for SW620-S for 0, 2, 4 og 6 dager respektivt. C. D. IGFBP7 mRNA-ekspresjon bestemt ved RT-PCR i fibroblaster som er utsatt for HT29-S (C) og LoVo-S (D) for 0, 2, 4 og 6 dager. MRNA-nivået ble normalisert til den av GAPDH i den samme celleekstrakter. *
P
. 0,05 mellom SW620-S-behandlede fibroblaster og kontrollgruppen (0 per dag)
TGF-β1 i SW620-S induserer IGFBP7 uttrykk i fibroblaster
Forrige studium av hvilke faktorer utskilt av CRC-cellelinjer har vist at kreftceller utskiller TGF-β1 i løpet av tumor-stroma interaksjoner [31]. På den antagelse at den IGFBP7 induksjonen skyldtes TGF-β1, ble fibroblaster utsatt for 5 ng /ml av eksogen TGF-β1; de viste en tidsavhengig økning i IGFBP7 mRNA (figur 2A og 2B). Videre, fibroblaster eksponert for forskjellige konsentrasjoner av eksogen TGF-β1 i området fra 5 ng /ml til 20 ng /ml i 6 dager viste en doseavhengig økning i IGFBP7 mRNA (figur 2C og 2D). Dataene viste at ekspresjonen av IGFBP7 er ikke bare avhengig av tid, men også på konsentrasjonen av TGF-β.
A. B. IGFBP7 mRNA-ekspresjon bestemt ved RT-PCR (A) og Q-PCR (B) i fibroblaster som er utsatt for RPMI1640 eller 5 ng /ml TGF-β1 for 0, 2, 4 og 6 dager. C. D. IGFBP7 mRNA-ekspresjon i fibroblaster er utsatt for 0, 5, 10 og 20 ng /ml TGF-β1 i 6 dager bestemt ved RT-PCR (C) og Q-PCR (D). EF Fibroblaster ble behandlet med SW620-S eller 5 ng /ml TGF-β1 i nærvær av 0, 20, 200 ng /ml AF i 6 dager, IGFBP7 mRNA i fibroblaster ble påvist ved RT-PCR (E) og Q-PCR (F). MRNA-nivået ble normalisert til den av GAPDH i den samme celleekstrakter. *
P
0,05 mellom SW620-S /TGF-β1-behandlede fibroblaster og kontrollgruppe.
+
P
0,05 mellom SW620-S-behandlet fibroblaster med eller uten 20 ng /ml AF.
++
P
0,05 mellom SW620-S-behandlet fibroblaster med eller uten 200 ng /ml AF.
#
P
0,05 mellom TGF-P1-behandlet fibroblaster med eller uten 20 ng /ml AF.
##
P
. 0,05 mellom TGF-P1-behandlet fibroblaster med eller uten 200 ng /ml AF
For å bekrefte at TGF-β1 ble proteinet utskilt av CRC-celler som er ansvarlige for IGFBP7 induksjon, vi brukte immunodepletion med en TGF-β1-spesifikt antistoff (20 ng /ml AF) for å fjerne TGF-β1 fra SW620-S. Dette immunodepleted SW620-S ikke klarte å overtale IGFBP7 i fibroblaster (figur 2E). Fibroblaster ble behandlet med SW620-S eller TGF-β1 i nærvær av AF delvis inhiberte IGFBP7 indusert av SW620-S eller TGF-β1 alene, noe som indikerte at TGF-β1 var den viktigste, men ikke den eneste faktor som induserte IGFBP7 ( Figur 2F).
Høy IGFBP7 uttrykk i fibroblaster er hovedsakelig gjennom TGF-β /ALK5 /Smad2 signalveien
i TGF-β signalering, fosforylerer den TβRII-ALK5 kompleks Smad2 /3. For å bestemme hvorvidt induksjon av IGFBP7 var gjennom Smad2-avhengig signalisering, ble SB431542 (en selektiv antagonist av TGF-β /ALK5 /Smad2 signalering) tilsatt til fibroblaster. I fibroblaster utsatt for SW620-S eller eksogen TGF-β1 med 10 uM SB431542, den IGFBP7 induksjon ble delvis inhibert (figur 3C og 3D). Høy uttrykk for P-Smad2 ble påvist i fibroblaster behandlet med SW620-S for kortere eller lengre tid. Denne oppregulering av P-Smad2 var tidsavhengig, og nådde en topp på dag 6 (Figur 3B). Nivåene av p-Smad2 (figur 3E) og TβRII (figur 3A) økte med SW620-S eller eksogent TGF-β1 ble redusert til normalt nivå ved SB431542, som indikerte at dette oppregulering var gjennom TβRII-ALK5-Smad2 /3 vei.
A. Uttrykket av TβRII ble oppdaget av Western blot. B. Fibroblaster ble utsatt for SW620-S for 0, 2, 4 og 6 dager, og p-Smad2 ble påvist ved Western blot. Proteinnivåene ble normalisert til den av β-aktin i de samme celleekstrakter. C.D. Fibroblaster ble utsatt for SW620-S eller TGF-β1 i nærvær av 10 uM SB431542 i 6 dager, og IGFBP7 mRNA-ekspresjon ble påvist ved RT-PCR (C) og Q-PCR (D). MRNA-nivået ble normalisert til den av GAPDH i den samme celleekstrakter. E. Fibroblaster ble utsatt for SW620-S eller TGF-β1 med 10 uM SB431542 i 6 dager, og ekspresjon av Smad2, p-Smad2 (E) ble påvist ved Western blot. Proteinnivåene ble normalisert til den av β-aktin i de samme celleekstrakter.
*
P
0,05 mellom SW620-S /TGF-β1-behandlede fibroblaster og kontrollgruppe.
+
P
0,05 mellom SW620-S-behandlet fibroblaster med eller uten SB431542,
#
P
0,05 mellom TGF-P1-behandlet fibroblaster med eller uten SB431542.
IGFBP7 oppregulering i fibroblaster er delvis gjennom aktivering av kanoniske Wnt signalveien
Siden Wnt signalveien regulerer aktivering av fibroblaster, vi setter ut for å finne ut om Wnt , spesielt den kanoniske Wnt signalveien, var en annen regulator. Fibroblaster ble behandlet med SW620-S viste høy ekspresjon av c-myc og CCND1, nedstrøms målgener av Wnt signalering, i en tidsavhengig måte. Den kanoniske Wnt signalnettverk protein β-catenin oppdaget av Western blot (figur S2A) ble økt og aktivert som vist ved immunofluorence mikroskopi (figur S2B) som indikerte at kanoniske Wnt signal ble aktivert under IGFBP7 oppregulering (Figur 4A og 4B).
A. B. Fibroblaster ble behandlet med SW620-S for 0, 2, 4 og 6 dager, og mRNA ekspresjon av Wnt signale c-myc (A) og CCND1 (B) mRNA-ekspresjon ble vurdert ved Q-PCR målgener. C-E. Fibroblaster ble behandlet med SW620-S i nærvær av 50 ng /ml DKK1 (Wnt antagonist) i 6 dager, og IGFBP7 mRNA-ekspresjon ble påvist ved RT-PCR (C) og Q-PCR (D). MRNA-ekspresjon ble normalisert til den av GAPDH i den samme celleekstrakter. Wnt signalnettverk protein Dvl3 ble påvist i fibroblaster ved Western blot (E). Proteinekspresjon ble normalisert til den av β-aktin i den samme celleekstrakt. *
P
0,05 mellom SW620-S-behandlede fibroblaster og kontrollgruppe. **
P
0,05 mellom DKK1 behandlet fibroblaster og kontrollgruppe.
+
P
. 0,05 mellom SW620-S-behandlet fibroblaster med eller uten DKK1
Etter å ha vist at Wnt signal ble aktivert, vi deretter undersøkt forholdet mellom denne aktivering og høy ekspresjon av IGFBP7. DKKs skilles glykoproteiner som er kjent for å motvirke kanoniske Wnt signal [32]. Når fibroblaster ble behandlet med DKK1, høy ekspresjon av IGFBP7 indusert av SW620-S ble delvis inhibert (figur 4C og 4D). Wnt signalproteiner Dvl2 /3 oppdages av Western blot ble hemmet av DKK1 (figur 4E), noe som tyder på at oppregulering av IGFBP7 var nært knyttet til den kanoniske Wnt signalveien. Derfor kan de faktorer som er ansvarlige for høy ekspresjon av IGFBP7 være TGF-β1 og Wnt ligander som Wnt3a at aktivert TGF-β og Wnt signalveien.
TGF-β og Wnt kanonisk signalveien samvirker i å regulere høyt uttrykk for IGFBP7 i fibroblaster
for å avklare forholdet mellom TGF-β og Wnt signalveien, behandlet vi fibroblaster med TGF-β1, og funnet ut at det også økt nivå av c-myc , CCND1 og DKK1; Videre vil dette oppregulering ble delvis inhibert av SB431542 (figur 5A-5C). Disse resultater ble oppnådd på proteinnivået, som Dvls proteiner er positive mediatorer av Wnt signal plassert nedstrøms for de frizzled reseptorer og på oppstrømsiden av β-catenin. Dvl3 ble oppregulert ved TGF-β1 behandling (figur 5D), som indikerer at Wnt signal ble aktivert i løpet av interaksjonen, og denne endringen ble reversert ved den TGF-β antagonist SB431542, hvilket antyder at med TGF-β signaleringsaktivering, Wnt signale ble også aktivert. Vi har derfor funnet at det foreligger en ny krysstale mellom Wnt og TGF-β signalering som var Dvl2 /3-Smad2 /3-avhengig.
A-D. Fibroblaster ble utsatt for SW620-S eller TGF-β1 i nærvær av 10 uM SB431542 for 6days, og mRNA-ekspresjon av Wnt signal målgener c-Myc (A), CCND1 (B) og DKK1 (C) ble bestemt ved Q-PCR. mRNA-ekspresjon ble normalisert til den av GAPDH i den samme celleekstrakter. Ekspresjon av Dvl3 ble påvist ved Western blot (D). Proteinekspresjon ble normalisert til den av β-aktin i den samme celleekstrakt. *
P
0,05 mellom SW620-S-behandlede fibroblaster og kontrollgruppe. **
P
. 0,05 mellom TGF-P1-behandlet fibroblaster og kontrollgruppen
+
P
0,05 mellom SW620-S-behandlet fibroblaster med eller uten SB431542.
#
P
0,05 mellom TGF-P1-behandlet fibroblaster med eller uten SB431542. E. modell av høy ekspresjon av IGFBP7 indusert av tumorcelle-fibroblast-interaksjoner. F. TGF-β signal aktivering opp-regulerer Smad2 /3 og Dvl2 /3, fulgt av opp-regulering av Wnt målgener c-myc, CCND1 og DKK1, slik at IGFBP7 blir over-uttrykt.
diskusjon
Disse forsøk har vist at supernatanten fra SW620 cellelinje (SW620-S) indusert IGFBP7 i fibroblaster hovedsakelig gjennom ko-regulering av TGF-β /ALK5 /Smad2 signalering og kanonisk Wnt signal . Dette er den første bevis på mekanismen som ligger under høy IGFBP7 ekspresjon i fibroblaster i løpet av tumor-stroma interaksjoner. Vår hypotese er at IGFBP7 er en av de nedstrøms målgener av TGF-β /Smad2 og kanonisk Wnt signalering, selv om den nøyaktige plasseringen av IGFBP7 fortsatt trenger videre etterforskning.
I denne studien har vi vist at CRC celler induserte en høy uttrykk for IGFBP7 (figur 5E). Som IGFBP7 er en tumor suppressor, har det meste av forskningen på IGFBP7 fokusert på selve tumorcellene. I en tumor xenograft modell, for eksempel, over-ekspresjon av IGFBP7 hemmet veksten av melanom [33]. Hvorfor gjør svulstcellene skiller ut faktorer som induserer IGFBP7 som igjen undertrykker sin egen vekst? Dette kan være et resultat av motstanden i fibroblaster til tumorcellene. Hva er betydningen av den høye uttrykk for IGFBP7 i fibroblaster? I dag er dette vanskelig å vurdere, fordi det er lite forskning på hvilken rolle IGFBP7 i tumor stroma. IGFBP7 ble funnet sterkt uttrykt i karene i glioma [34]; den kan kommunisere med ekstracellulære matriks-protein for å fremkalle adhesjon og migrering av endotelceller [35], [36]. Pen og kolleger rapporterte også at IGFBP7 i endotelceller kan indusere angiogenese [18]. Andre funnet at IGFBP7 sannsynligvis deltar i aktivering og proliferasjon av fibroblaster [37]. Disse observasjonene tyder på at IGFBP7 i tumorceller i stroma kan spille en helt annen rolle fra IGFBP7 i stromale celler av svulster. Våre upubliserte data viste at IGFBP7 kan korrelere med aktivering av fibroblaster, men den detaljerte betydningen av sin høye uttrykk i fibroblaster er fortsatt ukjent og krever videre undersøkelser.
Våre resultater viste at IGFBP7 uttrykk i fibroblaster er nært beslektet med TGF-β utskilt av CRC-celler. Dessuten er det uttrykk for IGFBP7 ikke bare tidsavhengig, men også doseavhengig med hensyn til TGF-β. Antistoffet og inhibitor av TGF-β bekreftet dette resultat. Det har blitt rapportert at TGF-β signalering har også regulert ekspresjon av IGFBP7 i hjerne endotelceller [18], et ytterligere eksempel på en stroma-celledelen. Og vi vet, TGF-β /Smad3 signalering har vært ansett som tumor-suppressor i løpet av tumorprogresjon, siden TGF-β-indusert CDKN1A (P16) og CDKN2B (P15) ekspresjon er korrelert med tumorinhibering [38]. Finner imidlertid andre undersøkelser at CTGF og PAI-1, nedstrøms målgenet av TGF-β /Smad3 signalering, er korrelert med en høy risiko for metastaser i brystkreft [39]. Det tyder på TGF-β /Smad3 kan inverst fremme invasjon og migrasjon i sent stadium av tumordannelse [40], [41]. Derfor spekulerer vi at TGF-β utskilt av kreftceller fremme IGFBP7 uttrykk i fibroblaster kan redusere tumor suppressor rolle for fibroblaster i svulstvev.
Forholdet mellom IGFBP7 og Wnt signal er ikke undersøkt, og vår studie er den første som viser at Wnt signal kan regulere uttrykk for IGFBP7 i fibroblaster. Det har blitt rapportert at Wnt /β-catenin signale regulerer differensiering av fibroblaster, noe som antyder at Wnt /β-catenin signalisering er en viktig regulator av fibroblast fenotype [42]. Dette tyder på at Wnt signale kan påvirke IGFBP7 gjennom mediere differensiering status av fibroblaster.
Wnt signalering er kjent for å bli aktivert når fibroblaster aktiveres av TGF-β [43]. Her la vi merke til at Wnt signal aktiveres under IGFBP7 induksjon i fibroblaster av TGF-β. Det er merkelig at med unntak av c-myc og CCND1, uttrykk for DKK1 var også oppregulert av TGF-β. Vi vet at DKK1 er en kanonisk antagonist av Wnt signalering. Disse publiserte funn er derfor i strid med våre resultater. Men i tillegg bør vi være oppmerksom på at DKK1 er også målet genet av Wnt signal [28]. Dette kan være en negativ tilbakekoblingsmekanisme mellom de to signalveier. Disse to signaler kan samarbeide under IGFBP7 induksjon i fibroblaster. Med hensyn til hvordan de samarbeider: Vi fant at de ble koblet sammen med Smad2 /Dvl3. Det er flere forklaringer på samspillet mellom disse to signalveier. En modus for interaksjon mellom Wnt /β-catenin og TGF-β /Smads signaler er samspillet mellom Smads og β-catenin /TCF4 [44]. En annen modus kan være av Wnt5a indusere dannelsen av Mark2 /Dvl3 /Smad4 komplekse [45]. Enda en annen modus kan være Wnt3a fremme en kreft-assosiert fibroblaster-lignende fenotype i fibroblaster, delvis gjennom TGF-β /Smad2 aliserte aktivering av en β-catenin-avhengig mekanisme [46], noe som indikerer at Wnt og TGF-β signalering er koblet av Smad. Fra våre resultater, i fibroblaster, aktivering av Wnt indusert av TGF-β var mest sannsynlig gjennom oppregulering av Smad og Dvl3. Vi konkluderer derfor med at Dvl3 kan være en roman poeng av krysstale mellom TGF-β og Wnt signalveier i fibroblaster. Smad2 /3 og Dvl2 /3 kan danne en slags forbindelse som kan knytte TGF-β og Wnt signalering (figur 5F). Det har blitt rapportert at TGF-β og Wnt signale co-regulere bestemmelse av mesenchymal stamcelle skjebner i brystceller, inkludert induksjon av kreft stamceller. Derfor kan kombinasjonen av disse to signalveier være en mekanisme bak noen forhold som fibrotiske sykdommer [47] -. [49]
Vi vet at parakrint signalmolekyler skilles ut av CRC celler under kreft stroma interaksjoner inkluderer TGF -β, Wnt og noen andre faktorer, og at disse kan endre nabo fibroblaster. Vi vet også at fibroblaster i tumor stroma er ansvarlig for syntese av MMP og kollagenfibre. MMP hjelp kreftceller invadere kjelleren membranen, mens kollagen fibrene gir kreftceller med en praktisk fysisk grunnen over hvilke å migrere [50]. Dette er grunnen til fibroblaster i tumor stroma har blitt kalt «Distant inntrengerne og Migrators» [51].
Alt i alt, er svulsten-stroma interaksjoner en kompleks prosess. I løpet av denne prosess, kan tumorceller utskiller faktorer for å endre differensiering av normale fibroblaster, og de endrede fibroblaster i retur utskiller faktorer som påvirker utviklingen av tumorinvasjon og migrasjon. Vi har presentert data som viser mekanismen for hvordan IGFBP7 kan være involvert i dette samspillet, og dette samspillet, med vekt på involvering av stromale tumor fibroblaster, kunne danne fokus for en roman terapeutisk tilnærming til forvaltningen av kreft.
støtte Informasjon
Figur S1.
HT29-S og Løvø-S indusere høy uttrykk for IGFBP7 i fibroblaster. Semi-kvantitativ analyse av IGFBP7 mRNA-ekspresjon nivå bestemt ved RT-PCR i fibroblaster som er utsatt for HT29-S (A) og LoVo-S (B) for 0, 2, 4 og 6 dager. MRNA-nivået ble normalisert til den av GAPDH i den samme celleekstrakter. *
P
0,05 mellom HT29-S /Løvø-S-behandlede fibroblaster og kontrollgruppen (0 per dag)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085340.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
β-catenin aktiveres under oppregulering av IGFBP7 i fibroblaster. A. Fibroblaster ble behandlet med SW620-S eller TGF-β i 6 dager og ekspresjon av Wnt aliserte protein β-catenin ble påvist i fibroblaster ved hjelp av Western blot. Proteinekspresjon ble normalisert til den av β-aktin i den samme celleekstrakt. *
P
0,05 mellom TGF-P1-behandlet fibroblaster og kontrollgruppe. B. Fibroblaster ble behandlet med SW620-S eller TGF-β i 6 dager og β-catenin (rød) og DAPI (blå) ble påvist i fibroblaster ved immunofluorescens-mikroskopi (Original forstørrelse x 1000)
doi:. 10,1371 /journal .pone.0085340.s002 product: (TIF)
Tabell S1.
Q-PCR primere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085340.s003 plakater (DOC)
Takk
Vi vil gjerne takke for Dr. Brian Eyden (Manchester) for engelsk språk redigering, stimulere til diskusjon og revisjon av manuskriptet. Vi takker professor Mao-De Lai og laboratorie medlemmer for hjelp og råd gjennom dette arbeidet.
