Abstract
Bruken av cellelinjer eller dyremodeller har betydelige ulemper når det arbeider med et sett av heterogene sykdommer som ovarialcancer. Dette har klinisk relevans i at biomarkører utviklet ved hjelp av cellelinje eller dyremodeller er ofte ikke overføres til klinisk setting. I denne studien, beskriver vi utviklingen av en robust protokoll for utvikling av primærkulturer av eggstokkreft som vil overvinne noen av disse vanskeligheter. Kvinner som gjennomgår kirurgi for eggstokkreft ble rekruttert og prøver av ascites og solide svulster innskudd ble brukt til å utvikle primærkulturer. Celler ble karakterisert ved anvendelse av et panel av immunofluorescent antistoffer før bruk, i en rekke tester, inkludert funksjonell vurdering av DNA-reparasjonsbaner. I løpet av fire års perioden, levedyktige kulturer, bekreftet å være epitelial opprinnelse ble samlet inn 156 av 172 (91%) tilfeller rekruttert. Karakterisering ble utført ved hjelp av et panel av antistoffer inkludert pancytokeratin, CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 og vimentin. Senescence skjedde mellom to
nd og åtte
th passasjer i alle kulturer unntatt en der spontan immortalization skjedde. Celler kan med hell dyrkes selv etter en lagringsperiode ved 4 ° C og dyrkede celler var i stand til å anvendes for en rekke applikasjoner, inkludert funksjonelle analyser. Ved funksjonell vurdering var det minimalt med intra-tumor heterogenitet. Det er derfor mulig å utlede levedyktige ovarian cancer cellekulturer i flertallet av pasienter som gjennomgår kirurgi. Celler dyrket direkte fra pasient kreft gi en nøyaktig og svært mangfoldig modell
Citation. O’Donnell RL, McCormick A, Mukhopadhyay A, Woodhouse LC, Moat M, Grundy A, et al. (2014) Bruk av eggstokkreft celler fra pasienter som gjennomgår kirurgi for å generere Primære kulturer kan gjennomgå Funksjonsanalyse. PLoS ONE 9 (3): e90604. doi: 10,1371 /journal.pone.0090604
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 13 november 2013; Godkjent: 02.02.2014; Publisert: 06.03.2014
Copyright: © 2014 O’Donnell et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende årsaken til gynekologisk kreftdødelighet. verdensomspennende [1] og til tross for mye forskning på behandling av eggstokkreft den totale dødeligheten har endret seg lite de siste 20 årene med en 5-års overlevelse på 30-39% [2]. Det har lenge vært anerkjent av klinikere som eggstokkreft er et sett av heterogene sykdommer, men til tross for dette ovarialcancer fortsetter å bli behandlet som en enkelt klinisk sykdom ved anvendelse av en kombinasjon av kirurgi og debulking platinabasert kjemoterapi. Den observerte variasjon i den kliniske adferd av eggstokkreft sammen med de økende data rapportering molekylær heterogenitet antyder at en heterogen modell for studiet av eggstokkreft er lang forsinket. Den nye begrepet personlig medisin basert på biomarkører for respons til nye behandlinger rettet mot spesifikke defekter i svulst DNA reparasjon er bare mulig hvis biomarkører kan testes ved hjelp av en realistisk modell.
Etablerte cellelinjer gir et uvurderlig verktøy for å studere biologiske funksjoner på molekylært og cellulært nivå. Eksisterende humane ovarie cancer-cellelinjer har fordelen av høy proliferativ kapasitet, clonogenecity og forlenget levetid i kultur. Men de fleste har kjøpt betydelige genetiske endringer fra sine celler av opprinnelse, herunder sletting av viktige regulatoriske cellesyklus gener som støtter udødelighet. I tillegg er det som tyder på at mange cellelinjer inneholde betydelige feilidentifisering, duplisering, og tap av integritet [3].
Primære celler isolert fra pasienter er ofte vesentlig forskjellig fra etablerte cellelinjer av samme opprinnelse. Evnen til kulturen og karakterisere nylig isolerte OSE (eggstokk flate epitel) og EOC (ovarialcancer) celler fra pasienter gir en viktig eksperimentelt system som har potensial til å ligne pasienten situasjonen mer nøyaktig [4], [5].
Det er to kilder for klinisk materiale som har vært brukt til å generere primære kulturer i eggstokkreft: ascitisk væske og fast tumorvevet. Genuttrykkstudier har indikert ulike biologiske profiler i kreftcellene som stammer fra disse to kildene fra samme pasient i form av metastase, invasjon og angiogenese [6]. Ascitesvæske har flere fordeler fremfor faste tumorvev i generering av primære kulturer. Ascitesvæske er forholdsvis lett å få tak i og dyrkning av de suspenderte cellene er teknisk sett rett frem. Ascitiske kulturer har vist seg å generere en homogen epitelcelle-rik populasjon sammenlignet med de som erholdes fra faste vev. Betydelige andeler av pasienter med eggstokkreft til stede på et avansert stadium og har store volumer med ascitesvæske som kan oppnås under operasjonen eller paracentesis. Men som de fleste pasienter med store volum ascites har svulster i en høy klasse serøs histologisk subtype, vil bare prøvetaking ascites underrepresent de andre histologiske subtyper. Culture of solid tumor, spesielt i fravær av ascites er derfor også nødvendig å ta en representativ gruppe av prøver.
primære cellekultur fra hver kilde kan tilveiebringe en kilde for testing av molekylprofilen og utføre funksjonelle studier av individuelle kreft. De siste årene har foreningen mellom svulst molekylær heterogenitet, overlevelse og /eller respons på behandling har blitt anerkjent [7] og har drevet søk etter biomarkører for å forutsi respons på nye behandlingsformer rettet mot DNA reparasjon trasé deregulerte i eggstokkreft.
Flere metoder for kulturen i primær eggstokkreft celler isolert fra ascites har blitt beskrevet [8]. Disse fremgangsmåter krever imidlertid kompliserte flertrinnsprosedyrer. Dunfield
et al
og Shepherd
et al
beskrive en mer enkel og pålitelig dyrkningsmetode som omfatter å blande ascites direkte med medium som resulterer i epitelial cellekultur [4], [9]. Denne teknikken har blitt bearbeidet av vår gruppe for bruk i forskning på den funksjonelle status av DNA-reparasjonsmekanismer og her vi rapportere vår erfaring med denne teknikken.
Metoder
Etikk uttalelse
studien ble godkjent av lokal etisk komité (UK IRAS North West etikkutvalg – 12 /NW /0202). og alle pasientene gav skriftlig informert samtykke
Reagenser
Rucaparib var en gave fra Clovis (USA) og er en potent inhibitor av PARP-1 og -2 proteiner (med en inhiberingskonstant av mindre enn 5 nM). Alle andre kjemikalier og vev kultur reagenser var fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, UK), med mindre annet er oppgitt.
Cell Culture
Prøvetaking.
Ascites og solid vev ble samlet inn fra samtykket pasienter som gjennomgår kirurgi for kreft i eggstokkene på Queen Elizabeth Hospital, Gateshead, UK. Kliniske opplysninger ble registrert og prøver registreres og behandles i samsvar med Human Tissue Act. Prøvene ble tildelt en PCO (Primary Kultur Ovary) referansenummer for å beholde anonymiteten.
Prøve transport og forberedelser.
Ascites ble sugd direkte fra pasienten inn i et sterilt sugeflaske. Fast tumor ble plassert i en steril universell inneholdende kulturmedium (RPMI 1640 medium supplert med 20% FCS, 20 mM L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin) forvarmet til 37 ° C. Prøvene ble fraktet fra sykehuset til laboratoriet umiddelbart i samsvar med UK Kategori B forskrifter UN3373.
Primær Kultur fra ascites.
Cell kultur ble utført ved hjelp av aseptisk teknikk i en containment nivå II laminær flyte mikrobiologisk sikkerhetskabinett. 20 ml av ascites ble tilsatt til 20 ml oppvarmet kulturmedium (RPMI med 20% FCS, som ovenfor) i T75-kolber (Corning, USA) og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2, 95% luftfuktighet . Mediet ble aspirert og 13 ml oppvarmet friskt medium ble erstattet på dag 3 til 5. mediet ble erstattet hver 4 til 5 dager inntil cellene nærmet konfluens. Celler ble passert, frosset og opptint som tidligere beskrevet [10]. Cellekulturer ble satt i karantene i en primær inkubator å avvente formell patologisk eksamensresultater, og for å sikre at infiserte prøvene ikke ble introdusert i generelle kultur.
Primær kultur fra solid tumor.
En gang i laboratoriet, den faste tumoren ble dissekert i ~3 mm
3 stykker ved hjelp av en steril skalpell og overført til T25 kolber inneholdende tilstrekkelig collagenase /dispase (Roche, UK) oppløsning (1 mg /1 ml i fullstendig medium) for å fordype prøven. Cellene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C på en orbital-rystemaskin (IKA-Vibrax-VKR) ved 2 x g. Cellesuspensjonen ble overført til en universell beholder, sentrifugert ved 400 x g i 5 minutter, vasket PBS, resuspendert i fullstendig medium og plassert i en T25-kolbe i 30 minutter for å tillate fibroblast såing. Epiteliale cellesuspensjonen ble overført til en T25 kolbe for pågående cellekultur.
Kultur optimalisering
Direkte dyrknings på dekkglass.
Tid fra samlingen til funksjonell vurdering kan være opp til 14 dager. For å redusere lengden på kultur og håndtering før bruk, ble media og ascitesvæske (01:01 v:v) lagt direkte på sterile dekkglass for umiddelbar analyse.
Cytospinning.
ascitic væsken ble cytospun direkte på objektglass etter optimalisering av sentrifugehastighet, prøvevolum og anrikning av ascitesvæske ved hjelp av tilsetning av rødt cellelyseringsbuffer. Etter cytospining, slides ble lufttørket, fiksert med 100% metanol og lagret ved -20 ° C for senere karakterisering.
Karakterisering
Ovariekreft er et sett av heterogene sykdommer. I tillegg inneholder ascitesvæske en rekke celletyper og en enkelt markør er derfor For lite til å skille en pålitelig måte ovarialcancer celler fra andre celletyper. En karakterisering panel bestående av cellekultur morfologi, immunfluorescens farging av fikserte celler, samt standard patologisk og immunhistokjemi undersøkelse ble kombinert for å sikre nøyaktig epithelial karakterisering av hver kultur.
morfologi.
Morfologiske egenskaper ble studert under en Olympus CK40 invertert mikroskop ved 20 × forstørrelse. Bilder ble tatt med VisiCam programvare (VWR, USA).
immunfluorescens.
Standard teknikker for immunfluorescens ble brukt til å farge for pancytokeratin, epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM), kreft antigen 125 (ca125 ), epitelial relatert antigen (MOC-31), D2-40 og vimentin, tabell 1. Ingen av de positive markørene er jevnt uttrykt i alle EOC-celler, men tolkes i kombinasjon muliggjøre valg av egnede kulturer.
Formell histopatologi
Formell patologisk og cytologisk undersøkelse av ascitic og solide vevsprøver fra pasienter som donerer PCO prøvene ble utført og brukes til ytterligere å karakterisere kulturer.
Når alle karakteristikker var i tråd med epitelial eggstokk opprinnelse, prøvene ble deretter anvendt i påfølgende eksperimenter. Hvor resultatene var uforenlig med epitelial opprinnelse, ble kulturene forkastet.
Imagestream
X karakterisering
Etablert PCO kulturer og ferske ascites.
PCO celler, dyrket ved hjelp av metoder ovenfor, ble trypsinisert fast med 0,4% paraformaldehyde i 20 minutter ved 4 ° C, og permeabilised med BD Phosflow Perm /vask i (BD Biosciences, USA, 01:10 v:v destillert vann).
for ferske ascites, ti ml bukvæske ble filtrert for å utelukke større avfall (180 um pore nylonfilter, Millipore, UK). Som ascitesvæske er hyppig forurenset med blod, tilsetning av et fikseringsmiddel inneholdende rød cellelyseringsbuffer (01:05 v:v BD Phosflow Lyse /Fix røde cellelyseringsbuffer, BD Biosciences, USA) aktivert uttømming av røde blodceller. Celler ble permeabilised med BD Phosflow Perm /vask jeg og prøven ytterligere beriket med utarming av hvite blodlegemer ved hjelp EasySep Menneskelig CD45 Nedbryting Kit (STEMCELL teknologier, Frankrike), i henhold til produsentens anvisninger.
Alle prøvene ble deretter inkubert med immunoflourescent-merkede antistoffer i 12 timer ved 4 ° C, inkludert pancytokeratin, EpCAM, CA125, DRAQ5 nukleær flekk og felles leucicytoe antigen (CD45) for å identifisere hvite blodlegemer. Prøvene ble behandlet ved hjelp Imagestream
X (Amnis, USA) med IDEER programvare brukt til å kvantifisere andelen av celler som uttrykker de tre epiteliale markører, samt gi en vurdering av co-uttrykk.
Vekst og Cytotoksisitet assays
SRB.
A rutine sulforhodamin B (SRB) assay ble brukt for å vurdere cytotoksisitet og cellevekst, slik som tidligere beskrevet [11]. I korthet ble cellene sådd ut i en konsentrasjon på 1000 celler /brønn og etter tilslutning, behandlet med forskjellige konsentrasjoner av rucaparib i 10 dager før fiksering, beising og spektrofotometer vurdering.
klonogene analyser.
klonogene analysene anses gullstandarden for vurdering av cytotoksisitet. 50.000 celler /brønn ble sådd ut på en 6 brønners plate i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av det cytotoksiske middel før reseeding i konsentrasjoner på 2500, 5000 og 10.000 celler for hver behandling. Celler ble inkubert ved 37 ° C i 14 dager. Mediet ble aspirert, platene ble vasket i PBS og deretter festes ved hjelp av Carnoy sin fikseringsmiddel (eddiksyre: metanol 1:3 v /v).., Etterfulgt av farging med 1% krystallfiolett
Agar clonogenics
50,000 celler ble utsådd i brønner inneholdende media og behandlet som ovenfor i 24 timer i agarose media. Cellene ble deretter trysinised, vasket og på nytt utsådd i semifast agarose (Promega, UK) media, ved en rekke forskjellige konsentrasjoner og inkubert i 14 dager. Koloniene ble farget med 3- (4,5-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT).
Cell transfeksjon
Luciferase uttrykker plasmid pGL2 (Promega, USA ) ble transfektert ved bruk av to metoder. For det første ble produsentens protokoll (Invitrogen, USA) for å transfektere celler med lipofektamin TM LTX med Pluss reagens anvendt for å transfektere PCO kulturer med 1-6 ug av DNA per brønn. Dernest 250 mL av PCO cellesuspensjon som inneholder 1 × 10
6 celler /ml ble blandet med 1-5 ug pGL2 plasmid i 4 mm electroporation kyvetter (Eurogentec, Belgia). Electroporation ble utført med en EPI-2500 electroporator på 100-500 volt. De transfektanter fra begge metodene ble høstet 48 timer etter transfeksjon og analysert for luciferase aktivitet.
Videre PCO kulturer ble transfektert hjelp MISSION ™ shRNA lentiviral transduksjon partikler (Sigma-Aldrich, USA), som per produsentens protokoll.
homolog rekombinasjon assayet
Cellene ble sådd ut på glass dekkglass og behandlet med 2Gy ioniserende stråling og rucaparib ved 10 uM konsentrasjon etter 24 timer for å indusere dobbeltstrengbrudd (DSB). Alle forsøkene ble utført sammen med ubehandlede kontroller med tilsvarende 0,1% DMSO. Cellene ble deretter fast og rehydrert før farging med 1:100 monoklonalt anti-γH2AX (Upstate, Millipore Corp., USA) og 1:100 geitepolyklonalt anti-Rad51 (Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., USA) antistoffer med passende sekundære fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer, som beskrevet tidligere [5].
bilde J telling programvare [12], [13] ble brukt til å telle γH2AX og Rad51 nucleic foci. Celler ble klassifisert som homolog rekombinasjon (HR) kompetent hvis det var mer enn en to gangers økning i Rad51 foci etter DNA-skade, bekreftet av en to gangers økning i γH2AX.
Resultater
generasjon primærkulturer fra ascites
ascites ble samlet inn fra 172 eggstokkreft pasienter som gjennomgår primær (67%) eller forsinket primær kirurgi (etter tre til fire sykluser av platina-basert neo-adjuvant kjemoterapi; 33%) mellom 2008 og 2013 . Levedyktige kulturer ble generert på 166/172 (97%) tilfeller. Erytrocytter og cellerester fra ascites ikke holder seg til kultur kolbe og ble fjernet etter media endring. Generelt utseende av hver kultur ble det av en brostein monolag mønster, figur 1 (A), som beskrevet av Dunfield
et al product: [4]. Ascitesvæske er sammensatt av flere cellulære komponenter og for å bekrefte eks veksten av kreftceller karakterisering av dyrkede celler er nødvendig. Immunoflourescent karakterisering av kulturene ble utført ved anvendelse av panelet av antistoffer mot detetct ekspresjon av pancytokeratin CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 og vimentin, figur 1 (B-F). 10/166 (6%) ble avvist da de ikke klarte å vise mer enn 95% cytokeratin positivitet. Den generelle suksessrate derfor for å lage ascitiske epitelceller primærkulturer fra pasienter som gjennomgår kirurgi var 156/172 (91%). Rutinemessig histopatologisk undersøkelse av FFPE vev fra hver pasient ble utført, tabell 2. Den mest dominerende histologisk subtype var høy klasse serøs kreft
A:. Lysfelt demonstrere brostein mono; immunoflourescent bilder med antistoffer rettet mot: B: FITC-anti-pancytokeratin; C: Alexafluor 596 anti-CA125; D: Alexflour 488 anti-EpCAM; E: Alexafluor 596 anti-MOC 31; F: Alexaflour 596 anti-vimentin
I en undergruppe av prøvene ble immunoflourescent vurdering av CA125 uttrykk i PCO prøven sammenlignet med ca125 uttrykk på immunhistokjemisk analyse av FFPE vev fra samme pasient Figur 2. Sammenheng av resultatene fra de to vurderingene ble sett i 8/11 (72%) tilfeller. I de resterende tre tilfellene, viste to IHC uttrykk for CA125 bare, mens en viste IF uttrykk bare
PCO 158 A:. Immunhistokjemisk påvisning av CA125 i FFPE vev; B: Immunofluourescent påvisning av CA125 med Alexaflour596 fra tilsvarende primærkultur
Cellular morfologi ble studert over tid, og det ble sett på som de fleste kulturer var av brostein morfologi, men sent passasje celler (vanligvis etter passasje 4 /5) utviklet en mer mesenchymale fenotype, blir langstrakt og viser en markert redusert vekst. Senescence skjedde mellom 2. og 8. passasjer, oftest mellom 4. og 5
th, og gjør således ytterligere karakterisering ved sen passasje umulig. Kulturer ble ansett som mislykket når ingen vekst ble sett etter 28 dager. En kultur spontant udødeliggjort og har blitt dyrket i mer enn 20 passeringer. Det er ikke klart hvorfor kultur fra ascites ikke lykkes i en del av tilfellene, hvorfor begynnende alderdom opptrer ved variable passasjer eller hvorfor bare en kultur har udødeliggjort. Det er sannsynlig, men at dette er en følge av mangel på viktige faktorer som er nødvendig for vekst som er forsynt
in vivo
av de komplekse interaksjoner i svulsten mikromiljøet, og som mangler i kunstig kultur miljø.
Kultur vekst
en vekstrate på 30 PCO kulturer, dyrket i RPMI media supplert med 20% FCS, ble målt ved SRB analyser ved hjelp av tidlig passasje cellene til å generere doblingstidene. Dobling ganger mellom PCO kulturer ble svært variabel med en median dobling tid på 100 timer (område 79 til 195 timer), Figur 3. Imidlertid celler fra samme kultur testet på ulike passering viste minimal variasjon i dobling tid (gjennomsnittlig forskjell på 0,9 timer ; SEM 4.8). Ingen sammenheng ble påvist mellom vekst, histologisk subtype eller stadium av sykdommen på presentasjonen. Den relativt langsomme veksthastighet sett kan også være en konsekvens av den articial culturee miljø og mangel på faktorer fra svulsten micronvironment.
Middelverdien og standardavvik for 6 gjentas for hvert tidspunkt er plottet, normalisert til en dag.
Primær kultur fra solid svulst
parallelt med ascites ble solid vev samlet inn fra 11 pasienter og behandlet som beskrevet. Etablering av cellekulturer fra vev-eksplantater ble oppnådd i 100% av tilfellene. Eksplantering morfologi ble tapt 72 timer etter seeding som celler kjøpt et enkeltlag brostein utseende med tiden og passaging. Kulturer viste en lignende morfologisk utseende til de som stammer fra ascitic cellekultur, Figur 4. fibroblast forurensning ble minimert ved plating cellene for 30 minutters inkubasjon før du fjerner epithelial rik supernatanten og replating, Figur 5.
A: Passage 0 etter 48 timer; B: Passage 0 etter 72 timer; C: Passage en 14 dager
A: epithelial cellevekst fra supernatanten fjernet 30 minutter etter første plating (× 20 forstørrelse); B: Celler man følger under den innledende 30 minutters inkubasjon var nesten helt fibroblastisk (× 10 forstørrelse)
Prøvetransport
Transport optimalisering
Place av prøvetakingen.. er ofte fjernt fra laboratoriefasiliteter. For å kunne bruke denne modellen i samarbeids translasjonell arbeid vellykket etablering av kultur Følgende transport må vurderes. Vi sammenlignet derfor suksessen til kulturen karakterisering og funksjonelle analyser følgende forskjellige transportmetoder
Gruppe 1 – friske ascites (n = 10):. Transport til laboratoriet med behandling i løpet av 6 timer etter innsamling, ved hjelp av metoden beskrevet i det foregå .
Gruppe 2 – romtemperatur prøver (n = 7). ascites ble lagret ved romtemperatur i en steril beholder i 24 timer før blanding 01:01 med media i en kolbe som ovenfor
Gruppe 3 – Nedkjølt prøver (n = 10): ascites ble lagret ved 4 ° C i 24 timer før blanding 01:01 med medium som ovenfor
Gruppe 4 – Frosne prøver (n = 6). sammenkoblede sett med 50 ml porsjoner av bukvæske ble sentrifugert ved 400G i 5 minutter. De resulterende cellepelletene ble frosset, lagret ved -80 ° C og -120 ° C og tint ved 6 uker og 6 måneder.
Vellykkede kulturer ble oppnådd fra alle transportgrupper imidlertid i tilfeller med forsinket kulturen det var å foretrekke for å opprettholde kulturer ved 4 ° C. Det var ingen forskjell i morfologi av kulturene dyrket fra hver gruppe, tabell 3.
ascitisk cellepelletene (gruppe 4) som er lagret ved -80 ° C og -120 ° C, ble tint ved 6 uker og 6 måneder. Kulturer ble vellykket vokst fra begge lagringsforhold etter 6 uker med ingen forskjell observert i morfologi, vekst eller funksjonsanalyse. Men etter seks måneders lagring, ble det observert en signifikant forskjell i suksess for etterfølgende kultur fra de to tilstandene. Ascitic pellets lagret ved -120 ° C var vellykket dyrket i 83% tilfeller. Ingen kulturer lagret ved -80 ° C kan være vellykket vokst.
dekk kulturer
Den morfologiske utseende dekkcellekulturer var beslektet med parallelle kulturer behandlet etter standardmetoden. Immunoflourescent karakterisering var konsistent på tvers av alle PCO tilfeller mellom dekk og tradisjonelle metoden kulturer. Optimal immunoflourescent farging for karakterisering ble oppnådd hvis det utføres mer enn 24 timer etter seeding.
Cytospinning
De optimale parametre for å balansere maksimal celle tilslutning med bevaring av kjernefysisk morfologi var 200 ul ascitesvæske (konsentrasjon av 10 x 10
4 celler pr ml) cytospun ved 80 x g i 5 minutter. Til tross for tiltak for å utarme ascitesvæske prøve av uønskede ikke-epitelceller og rusk, forble lysbilder sterkt forurenset, bekreftet av sub-optimal cytokeratin flekker og dårlig CA125 uttrykk. Forurensning gjort vurdering av morfologi, immunoflourescent karakterisering og funksjonell vurdering av HR status mislykket.
Imagestream
X vurdering av PCO kulturer
Innføring av Imagestream
X-teknologi med sin evne til å kombinerer flowcytometri med høy oppløsning immunoflourescent mikroskopi tillot evaluering av ekspresjon av et antall immuno-merkede markører innenfor individuelle celler samtidig ved høy hastighet og høy oppløsning. Immunoflourescent påvisning av de tre epitelovarialcancer markører (pancytokeratin, EpCAM og CA125), vurdert ved hjelp av standard fast immunfluorescens og Imagestream
X-teknologien var konsekvent i 13/15 tilfeller (87%), Tabell 4. I tillegg Imagestream
X aktivert kvantifisering av prosent uttrykk og vurdering av co-uttrykk.
Imagestream
X vurdering av ferske ascites prøver
ti ml fersk ascites ble samlet og analysert fra syv eggstokkene kreftpasienter som bruker Imagestream
X. Celler ble klassifisert som epithelial om de var kjernedannet, negativ for CD45 og positivt for EpCAM, CK eller CA125. Den epiteliale cellepopulasjon i hvert ascitisk prøven kan bli delt inn i et antall av sub-populasjoner basert på mønsteret av antistoff merking, figur 6a og b, og viste stor inter-tumor heterogenitet. Andelen av celler flekker positivt for EpCAM var svært variabel med en median på 52% (0-98%). Det var ingen korrelasjon mellom Imagestream
X bestemmes ekspresjon av epitel-markører og den status som bestemmes av faste immunofluorescens (ROC-kurve, som ikke er vist, AUC på 0,5). Det er mulig at noen av disse subpopulasjoner kan representere ikke-epiteliale celler (dvs. mesothelial celler), men det er også mulig at de er faktisk epitelceller og gjennomgår fenotypiske endring som følge av dyrkningsmetode; eller at dyrkingsmetoden positivt velges ut subpopulasjoner. Celle sortering med påfølgende molekylære profilering av hver av subpopulasjoner vil avklare dette, og at ytterligere molekylære forskjeller i undergrupper av EOC å bli utforsket
A:. ImagestreamX celle tomt på representative celler som viser de tre store mobil undergrupper innenfor ascitisk fluid,; i) CK positiv bare, ii) CK og CA125 positiv og iii) EpCAM, CK og CA125 positiv. B: Under populasjoner identifisert i epiteliale cellepopulasjonen i EOC ascitesvæske (n = totalt antall epitelceller identifisert i 10 ml av ascites)
Cell transfeksjon
A. antall funksjonelle analyser krever at transfeksjon av vektorer i celler [14], [15]. Til tross for optimalisering, både Lipofectamine og electroporation transfeksjonsmetoder ikke klarte å gi en høy nok transfeksjon effektivitet for funksjonelle analyser.
Men cellene fortsatte å vokse i puromycinet medier etter transfeksjon hjelp MISSION ™ shRNA lentiviral transduksjon partikler som tyder på vellykket transfeksjon. Langsiktig transfeksjon kan ikke vurderes på grunn av kort sikt levetid av PCO kulturer.
Funksjonell homolog rekombinasjon analyser og cytotoksisitet
RAD51 analysen for HR DNA reparasjon status ble vellykket utført i alle primærkulturer som ble dyrket med hell fra alle transportkonsern. HR status for kulturer fra samme PCO donor ved hjelp av direkte plating på dekkglass og ascitiske kulturer var alle konsekvent. Dyrking direkte på dekkglass reduseres tiden det tar fra samlingen for å bestemme HR-status fra ca 14 til 5 dager.
Som forventet GI
50-verdier etter behandling med rucaparib for hver PCO kultur var variabel, men en klar differensiering av sensitive og resistente prøvene ble sett som tidligere beskrevet [5]. I de fleste tilfeller, som forventet, PCO prøver med defekt HR status var følsomme for rucaparib, mens de med kompetente HR status var resistente, Tabell 5.
Til tross for optimalisering av flere standard klonogene teknikker, koloni formasjonen ble ikke sett, og derfor klonogene analyser forlatt i PCO kulturer. Cellelinje arbeid har tidligere vist en lineær sammenheng mellom resultatene fra SRB og clonogenics og derfor SRB ble vedtatt som standard teknikk i denne studien [16].
Diskusjoner
Evnen til å generere og bruke primære kulturer av eggstokkreft har flere fordeler fremfor andre modeller inkludert etablerte cellelinjer og dyremodeller. Det er nå erkjent at mange cellelinjer i langtidskultur vil gjennomgå ytterligere genetiske avvik gjør dem forskjellig fra deres vev av opprinnelse. Videre er selv et stort panel av cellelinjer ikke kan rekapitulere enorm heterogeniteten som er sett i ovarialcancer. Mange dyremodeller er bare xenotransplantater utnytte disse cellelinjene, og dermed beholde det samme sett av problemer. Transgene musemodeller har en tendens til å ha blitt generert ved å integrere et lite antall mutasjoner [17] og derfor ikke vise den massive kromosomal instabilitet som er en anerkjent kjennetegn på eggstokkreft [18].
Her har vi beskrevet vår egne funn for å generere primærkulturer av eggstokkreft, ved hjelp av celler avledet fra både ascites og solide forekomster av sykdom. Evnen til å kultur fra begge disse materialene er viktig som, avhengig av klinisk setting, kan bare en av disse materialene er tilgjengelige. For eksempel, i residiverende sykdom er det ikke uvanlig å se ascites i fravær av store faste avsetninger i motsetning til den initiale presentasjon setting der bare faststoff sykdom kan være til stede. Vi har rapportert en sekvensiell sett av prøver å demonstrere suksess rate for å generere kulturer. 156/172 (91%) prøver samlet resulterte i en levedyktig kultur av epitelceller. Dette tallet er tilstrekkelig høy til å rettferdiggjøre mulig bruk av disse teknikkene i rutinemessig klinisk praksis hvis diagnostiske tester ble utviklet for bruk med dette materialet.
Ofte og faktisk i vår egen sak, det kan være betydelige geografiske avstanden mellom operasjonsstuen og diagnostisk laboratorium. Evnen til å transportere prøver uten tap av integritet er derfor viktig, og vi har beskrevet teknikker viser at disse prøver trygt kan opprettholdes ved enten 4 ° C eller -20 ° C i opp til 24 timer før dyrkning. Videre er evnen til å lagre kulturer lang sikt i flytende nitrogen gjør at muligheten for samarbeid om forskning eller
post hoc
diagnostisk analyse.
Spesielt ved høy scene når svulster formidles gjennom bukhulen og utover, vil mange tumorer demonstrere signifikant intra-tumor heterogenitet [19], [20], men ofte er disse endringene er mer relatert til lokal stromal reaksjon enn til tilstedeværelse eller fravær av sentrale driver mutasjoner [21].
