Abstract
makrofagin er en negativ prognostisk faktor for de fleste kreftformer, men gastrointestinale svulster synes å være et unntak. Virkningen av makrofager for kreft progresjon avhenger av deres fenotype, som kan variere mellom M1 (pro-inflammatorisk, defensiv) til M2 (tolerogene, pro-tumoral). Gastrointestinale kreft ofte bli en ektopisk kilde til gastrins og makrofager presentere reseptorer for disse peptidene. Formålet med denne studien er å analysere hvorvidt gastrins kan påvirke mønsteret av makrofag infiltrering i kolorektale svulster. Vi har undersøkt forholdet mellom gastrin ekspresjon og mønsteret av makrofaginfiltrering i prøver fra kolorektal kreft og påvirkning av disse peptidene på fenotypen av makrofager differensiert fra humane, perifere monocytter in vitro. Det totale antall makrofager (CD68 + celler) var lik i tumoral og normale omgivende vev, men antall M2 makrofager (CD206 + celler) var signifikant høyere i tumoren. Imidlertid er mange av disse tumor-assosierte M2 makrofager korrelerte negativt med immunreaktiviteten for gastrin-peptider i tumor epitelceller. Makrofager differensiert fra humane, perifere monocytter i nærvær av progastrin viste lavere nivåer av M2-markører (CD206, IL10) med normale mengder M1-markører (CD86, IL12). Progastrin induserte lignende virkninger i modne makrofager behandlet med IL4 for å oppnå en M2-fenotype eller med LPS pluss IFNy å generere M1-makrofager. Makrofager differensiert i nærvær av progastrin presentert en redusert ekspresjon av wnt ligander og redusert antall og økt celledød av ko-dyrkede kolorektal kreft epitelceller. Våre resultater tyder på at progastrin hemmer kjøpet av en M2-fenotype i humane makrofager. Denne effekten virker på kreft assosiert makrofager kan modulere kreft progresjon og bør tas i betraktning når analysere den terapeutiske verdien av gastrin immunoneutralization
Citation. Hernández C, Barrachina MD, Cosín-Roger J, Ortiz-Masiá D, Alvarez, Terrádez L, et al. (2014) Progastrin undertrykker Alternative Aktivering av humane makrofager og modulerer deres innflytelse på tykktarmskreft Epitelceller. PLoS ONE 9 (6): e98458. doi: 10,1371 /journal.pone.0098458
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 04.12.2013; Godkjent: 04.05.2014; Publisert: 05.06.2014
Copyright: © 2014 Hernández et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Educación y Ciencia /FEDER [stipend nummer SAF2007-064201], Ministerio de Ciencia e Innovacion [tilskuddsordninger tall SAF2010-20231, SAF2010-16030 og RYC-2011-09571], Ministerio de Sanidad y Consumo [stipend nummer PI11 /00327], CIBERehd [stipend antall CB06 /04/0071] og Generalitat Valenciana [stipend antall PROMETEO /2010/060]. Carlos Hernandez erkjenner støtte fra «Ramon y Cajal «program fra Ministerio de Ciencia e Innovación av Spania (RYC-2011-09571). Jesús Cosín-Roger er støttet av FPU stipend fra Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Makrofager er en betydelig del av svulster og vise en rekke funksjoner avhengig av det lokale miljøet. De kan være pro-inflammatorisk og hjelpe til å generere adaptive immunresponser (klassisk aktiverte makrofager, M1) eller tolerogene /anti-inflammatorisk (alternativt aktiverte makrofager, M2) [1], [2]. Tumorassosierte-makrofager (TAM) ofte ligne M2-makrofager, og derfor, i stedet for å slåss mot kreftceller, disse leukocytter fremme tumorvekst ved å dempe immunresponsen og gjennom sekresjon av vekst- og angiogene faktorer, så vel som enzymene som er nødvendige for celle invasjon. Som en følge av dette er tilstedeværelsen av TAMs blitt korrelert med en redusert overlevelse hos pasienter med f.eks melanoma, bryst, nyre eller blærekreft. Situasjonen synes å være forskjellig i enkelte kreft prosesser som påvirker den gastrointestinale traktus. Hos pasienter med kolorektal kreft eller gastrisk en høyere makrofagin korrelerer med en bedre prognose [3]. Årsakene til dette differensial rollen av makrofager i nettopp disse sykdommene er langt fra klart, men fra den nåværende kunnskap kan man konkludere med at kolorektal /gastrisk tumormikromiljøet markerer en annen likevekt i funksjonen av infiltrerte M1 og M2 makrofager, med M2 makrofager utøve en defekt opposisjon til de medfølgende M1-fagocytter [4], [5]. Imidlertid er mekanismene som er ansvarlig for denne effekten er ikke kjent.
Mest adenomatøse polypper, kolorektal og gastrisk tumorer uttrykker ectopically det gastrin-genet. Men disse kreftceller ikke er av en endokrin natur og hovedsakelig syntetisere hormonet forløper progastrin [6] – [8], som har proliferativ virkning på kreftceller [9]. Selv om progastrin kan bindes med lav affinitet til gastrin CCK-2-reseptorer, og denne interaksjonen kan bidra i noen grad til sin biologiske aktivitet [10], vises progastrin vekst-fremmende effekten å være hovedsakelig formidlet av et ikke-konvensjonelt reseptoren nylig identifisert som annexin II [9]. Vi har observert at gastrin utøver en pro-inflammatorisk aktivitet ved CCK-2-reseptorer [11] – [13], som er uttrykt i makrofager og endotelceller, mens annexin II er sterkt uttrykt på overflaten av makrofager, hvor det tjener som en patogen gjenkjenningselementet og medierer makrofagaktivering [14].
Vårt hypotese var at gastrin-peptider lokalt produsert in colonic tumorer kan påvirke funksjonen av infiltrerte makrofager og, på denne måte, modulering av immunrespons mot sykdom. Vi observerte at uttrykket av mage peptider i kolorektal kreftceller korrelerer med en redusert infiltrasjon av M2-makrofager og viste at progastrin modulerer modningsprosess av humane makrofager in vitro, og undertrykker anskaffelse av en M2-fenotype. Progastrin også redusert sekresjon av Wnt ligander av M2-makrofager og økt sin evne til å indusere apoptose av tykktarmskreft epitelceller.
Metoder
Pasienter
Tjueen curatively resected tykktarmskreft pasienter (tabell 1) ble valgt tilfeldig fra pasienter operert på Hospital de Manises. Ingen av dem hadde noen preoperativ radio /kjemoterapi. Umiddelbart etter reseksjon, ble et stykke inneholdende tumor og omgivende normalt vev fiksert i formalin og innstøpt i parafin. Erfarne patologer dokumentert histopatologiske karakteristikker av svulster, inkludert tumorstadium, differensiering klasse, størrelse, lymfe /angioinvasion, perinevral invasjon og spredning til lymfeknuter. Tumorstadium ble definert i henhold til TNM staging system. Studien ble godkjent av Institutional Review Board of The Hospital of Manises (Valencia). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Inmunohistochemistry
Serial seksjoner (4 mikrometer) av prøver som inneholder svulsten og normal slimhinne fra hver pasient ble farget for gastrin, Wnt1, CD68 som en makrofag markør, CD86 som en M1-makrofag markør eller CD206 som et M2-makrofag markør. Prøvene ble underkastet forskjellige metoder for antigen gjenfinning avhengig av epitopen (tabell 2). Endogen peroksidaseaktivitet ble undertrykket ved neddykking i 0,3% hydrogenperoksyd. Når blokkert med 5% hesteserum ble snittene inkubert over natten (4 ° C) med den tilsvarende primære antistoff (tabell 2). En hest-anti-muse /kanin biotinylert antistoff (Vector Laboratories, CA, USA, 1:200) ble anvendt som et sekundært antistoff. Vectastain Elite ABC Kit system (Vector Laboratories, CA, USA), etterfulgt av DAB Forbedret flytende substrat System for Immunhistokjemi (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) ble anvendt for utvikling. Alle vev ble motfarget med hematoksylin og spesifisiteten av immunfarging ble bekreftet hvis analoge vevssnitt viste et fravær av farging etter anvendelse av ikke-immun immunoglobulin av den samme isotype og i samme konsentrasjon som det primære antistoff, eller etter å utelate det sekundære antistoff.
Et representativt område (objektiv 40X, 6 felt, 0,22 mm
2) fra tumorvevet eller tilstøtende normalt kjertelvev ble valgt for kvantitativ analyse av makrofag infiltrasjon. Gastrin farging i hver prøve ble evaluert og en poengsum for intensitet fra 1 til 4 ble tilordnet. Bare kreft epitelceller omsatt, gastrin-antistoff og intensiteten av fargingen var meget homogen gjennom hele epiteliale tumor rommet. Alle prøver ble behandlet i parallell og en observatør, uvitende om pasienten antall og forskjellig fra den person som behandles og analysert makrofag immunostainings, tildelt en poengsum for hver pasient basert på intensiteten av fargingen ble observert i tre bilder som representerer forskjellige deler av svulst.
Cellekultur kultur~~POS=TRUNC
Humane perifere blodmononukleære celler ble isolert fra friske donorer ved Ficoll tetthetsgradient-sentrifugering. Monocytter ble sådd ut på vevskulturskåler og modnet til makrofager ved dyrking i X-Vivo 15-medium (BioWhittaker) supplementert med 1% humant serum og 20 ng /nl av rekombinant humant M-CSF (Peprotech) ved 37 ° C i 5% CO
2 for opptil 6 dager. For å oppnå en M1 polarisasjon, ble celler inkubert med 1 ug /ml LPS (fra Escherichia coli 0111: B4, Sigma-Aldrich) pluss 20 ng /ml human rekombinant IFNy (Peprotech) for de siste 24 timer. M2 polarisering ble oppnådd ved behandling av cellene med 20 ng /ml human rekombinant IL4 (Peprotech) for de siste 48 timene av dyrkingen periode. Modningsprosess samt aktiverings behandlinger ble utført i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av progastrin (10
-11-10
7M, Abgent).
Caco-2 celler (American Type Culture Collection, VA, USA) ble dyrket i MEM-medium (Sigma-Aldrich) supplert med 20% inaktivert bovint fosterserum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 100 mM natrium pyruvat og 1% ikke-essensielle aminosyrer.
Caco-2-celler ble ko-dyrket med monocytt-avledede makrofager ved hjelp av Transwell innsatser (Corning Incorporated, MA, USA) med et 0,4 pm porøst membran [12] . Monocytter ble sådd på følgende innsatser og differensiert til makrofager i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av progastrin. På dag 6 etter såing, ble skivene plassert på toppen av Caco-2-celler (t = 0) og ble opprettholdt i ko-kultur i 24 timer.
Nærværet av det overflatemolekyler CD86 (M1) og CD206 (M2) i dyrkede makrofager ble analysert ved fluorescens mikroskopi (mikroskop IX81, Olympus, Hamburg, Tyskland). Makrofager ble inkubert med Hoescht for å identifisere kjerner og med fluorescensmerkede antistoffer mot slike mål (tabell 2). Fluorescens ble analysert med den statiske cytometri programvare ScanR (mer enn 5000 celler /brønn). Sikret konsentrasjonen av cytokiner IL12 (Th1) og IL10 (Th2, antiinflammatorisk) i cellesupernatanter ble bestemt ved hjelp av ELISA (Diaclone)
antall Caco-2 celler etter co-kultur ble talt i en Newbauer kammer. Apoptose i disse celler ble undersøkt ved flowcytometri som bivariate Annexin V /PI-analyse (apoptose Detection Kit, Abcam).
Total RNA fra makrofager eller Caco-2-celler ble isolert ved hjelp av ekstraksjon kit (Illustra RNAspin Mini GE Healthcare Life Science) og cDNA ble oppnådd med stats Script RT reagent Kit (Takara bioteknologi). Real-time PCR ble utført med stats Script Reagens Kit Perfekt Real Time (Takara Bioteknologi) i en termo cycler LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Spesifikke oligonukleotider ble utformet i henhold til sekvensene vist i tabell 3. Den relative genekspresjon ble uttrykt som tidligere beskrevet [15].
Statistisk analyse
Data er uttrykt som middelverdier ± S.E.M.. og ble sammenlignet med variansanalyse (en vei-ANOVA) med en Newman-Keuls post hoc-korreksjon for multiple sammenligninger eller en t-test når det passer. En P-verdi 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. De kliniske sammenhenger i humane prøver ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient.
Resultater
M2 makrofag antallet økes i tumorområdet
Vi først analysert mengden og fenotype av makrofager i de ikke-tumor og tumor områder av kolorektal kreftpasienter. Immunhistokjemi for CD68 (makrofag markør), CD86 (M1 makrofag markør) og CD206 (M2 makrofag markør) ble utført i biopsiprøver fra kolorektal karsinom resections. Av notatet, antall makrofager var lik i tumor og normal omkringliggende vev, men antall M1 og M2 makrofager var signifikant forskjellig mellom de to områdene (figur 1). Tumor stroma inneholdt et lavere antall CD86 (+) celler enn lamina propria i normalt vev. I kontrast, ble et høyere antall CD206 (+) celler oppstått i tumorvevet sammenlignet med vanlig omkringliggende vev, noe som tyder på at tumor utvikling favoriserer differensiering av monocytter til M2 makrofager.
immunoreaktivitets til CD68 (MF markør, A-B), CD86 (M1-MF markør, C-D) og CD206 (M2-MF markør, E-F) ble analysert i kolorektal cancer (B, D, F) og friske omliggende mucosa (A, C, E ). (G) Kvantitativ analyse av positive celler for disse molekylene i et representativt område på 0,22 mm
2 (Skala bar = 0,2 mm). Barer representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 21). ** P 0,01 og *** P. 0,001 vs tilsvarende verdi i normal slimhinne
Gastrin uttrykk økes i svulsten, men negativt korrelert med antall M2 makrofager
Søke etter meklere som kan modulerer fenotype av makrofager inn i svulsten vi studerte rollen som gastrin peptider på uttrykk for ulike makro markører i biopsiprøver. Siden gastrin antistoffet anvendt i denne studien gjenkjenner både gastrin og gastrin-forløpere, som progastrin, vi kan ikke skille mellom ulike gastrin-peptider, men vi har observert utstrakt immunreaktivitet i tumor epitelceller biopsier analysert. Farging i hver prøve ble evaluert og en poengsum for intensitet fra 1 til 4 ble tilordnet (figur 2A). Ingen korrelasjon ble observert mellom gastrin nivåer i tumorer og antall av totalen (CD68 + -celler) eller M1 (CD86 + celler) makrofager, enten i tumoren eller i normalt vev (figurene 2B og 2C). Overraskende nok antall M2 makrofager i tumoral og normalt vev korrelerte negativt med gastrin uttrykk. Denne korrelasjonen var mer signifikant i svulsten, der peptidet blir syntetisert. Tatt sammen tyder disse data på at gastrin-peptider syntetisert av tumorceller reduserer antall M2 makrofager, uten å påvirke det totale antall makrofagen.
totale antallet makrofager (CD68 + celler, B), M1-makrofager (CD86 + celler, C), og M2-makrofager (CD206 celler, D), i tumor og normale omgivende vev ble analysert i forhold til gastrin ekspresjon i tumorvevet (A, score 1 til 4, målestokk = 0,2 mm). En negativ og signifikant korrelasjon observert mellom intensiteten av gastrin farging og antall M2-makrofager i normal slimhinne og tumorvevet (D).
Progastrin senker differensiering av makrofager mot en M2 fenotype
Vi antok at progastrin kunne være ansvarlig for effekten observert på makrofag fenotype, fordi tykktarm kreft celler mangler de enzymene som er nødvendige for fullstendig gastrin modning [7]. For å undersøke om progastrin kan modulere differensiering av makrofager til en M1 eller M2-fenotype vi behandlet humane perifere monocytter hentet fra friske frivillige med flere konsentrasjoner av progastrin og forlot dem til å skille. Statiske Cytometry forsøk utført med spesifikke fluoriserende antistoffer viste at progastrin redusert ekspresjon av M2-markør CD206 i monocytt-avledede makrofager selv ved den laveste konsentrasjon analysert. Derimot ble ingen endringer i uttrykket av M1-markør CD86 oppdaget. I tillegg målte vi den konsentrasjon av IL-12 og IL-10 i supernatanten av monocytt-avledede makrofager etter 6 dager med differensiering i nærvær av økende doser av progastrin. Den gastrin-forløperen fremkalte en signifikant reduksjon av IL-10-sekresjon, men forandret ikke IL-12 nivåer (figur 3). Våre data indikerer at progastrin inhiberer ekspresjonen av M2-markører i løpet av makrofag differensiering uten å påvirke ekspresjonen av M1-markører.
Humane perifere monocytter ble avledet til makrofager i nærvær eller fravær av progastrin og fenotypen av det resulterende makrofager evaluert ved å analysere følgende parametre: ekspresjon av CD86 (A, C, n = 3); ekspresjon av CD206 (B, D, n = 3); sekresjon av IL12 (F, n = 4); og sekresjon av IL10 (G, n = 4). Barer representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05 og ** P. 0,01 vs tilsvarende verdi i kjøretøy-behandlede celler
For å studere effekten av progastrin på IL4-mediert differensiering av makrofager mot et M2-fenotype vi inkuberes fullt differensiert monocytt-avledede makrofager med IL-4 og forskjellige doser av progastrin i to dager. Basale makrofager behandlet med IL-4 viste en signifikant økning i ekspresjonen CD206, en ikke-signifikant økning i IL-12-sekresjon og lignende IL-10-produksjon enn kontrollene. Progastrin vesentlig redusert induksjon av CD206 ved IL-4 og IL-12 øket sekresjon til nivåer betydelig høyere enn de som ble observert i kontrollceller, mens sekresjon av IL-10 var uendret. Imidlertid differensiering av makrofager mot en M1-fenotype ble ikke påvirket av progastrin. Behandling med LPS pluss IFNy økt ekspresjon av CD86 og sekresjon av både IL12 og IL10 i makrofager, men progastrin ikke endre noen av disse parameterne (figur 4).
Menneskelige monocytt-avledede makrofager ble stimulert med LPS pluss IFNy for å oppnå en M1-fenotype eller med IL4 for å oppnå M2-makrofager i nærvær eller fravær av progastrin, og den resulterende fenotype undersøkt ved å analysere følgende parametre: ekspresjon av CD86 (A, n = 3); ekspresjon av CD206 (B, n = 5); sekresjon av IL10 (C, D, n = 5); og sekresjon av IL12 (E, F, n = 5). Barer representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05 vs tilsvarende verdi i kjøretøy-behandlede celler;
+ P 0,05 og
++ P. 0,01 vs tilsvarende verdi i kontrollceller
Progastrin nedregulerer Wnt ligander i makrofager og øker celledød i co-kultivert Caco2 celler
Neste vi analysert om modulering av makrofag fenotype ved progastrin kan påvirke de omkringliggende kreftceller. Vi har nylig rapportert at M2-makrofager syntetisere og utskille wnt ligander som kan modulere ko-dyrket epitelcelle oppførsel [16] og i den foreliggende undersøkelse observerte vi immunoreaktivitet for Wnt1 i cellene i tumor stroma. Kvalitativ vurdering av ekspresjonen av denne Wnt ligand indikerer at mengden av positive celler avtar som gastrin produksjon i kreftceller øker (figur 5A). En årsakssammenheng mellom begge faktorer er påpekt av våre in vitro studier som viser at makrofager maturated i nærvær av progastrin utgjøre en betydelig redusert mRNA-ekspresjon av tre forskjellige wnt ligander (Wnt1, Wnt3a, og Wnt5, figurene 5B-5D). Funksjonell relevansen av nedregulering av de tre Wnt ligander i makrofager er demonstrert ved at Caco2 celler co-dyrket med progastrin behandlet makrofager uttrykte mindre Lgr5 mRNA enn Caco2 celler co-dyrket med kontrollmakrofager (figur 5E). Disse data tyder på at effektene av progastrin i makrofag-avledete wnt ligander modulere Wnt signalveien i området tumorceller.
Immunreaktiviteten til Wnt1 i stroma av kolorektal cancer i forhold til ekspresjon av gastrin i det samme vev (skala bar = 0,2 mm) (A); og effekten av tilstedeværelsen av progastrin under differensiering av humane, perifere monocytter til makrofager på mRNA-ekspresjon av tre forskjellige wnt ligander i disse makrofager (B-D, n = 5) og mRNA-ekspresjon av Lgr5 i ko-dyrket Caco-2-celler (E , n = 7). Barer representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05 og ** P . 0,01 vs tilsvarende verdi i vehikkelbehandlede celler
Videre er ko-kultur av Caco-2 med progastrin-behandlede makrofager resulterte i en betydelig reduksjon i total antall epitelceller sammen med en øket hastighet av apoptose (figur 6).
virkningene av human monocytt-avledede makrofager oppnådd i nærvær eller fravær av progastrin på antall (A) og hastigheten av apoptose ( B) av Caco-2-celler ble analysert i en ko-kultursystem (24 h, n = 4). Barer representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05 vs tilsvarende verdi i kjøretøy behandlet makrofager,
+ P 0,05 og
++ P 0,01 vs celler inkubert med en tom innsats (w /o MF)
diskusjon
Denne studien viser at makrofager infiltrere kolorektal tumorer har en annen fenotypisk profil enn de som er til stede i normalt vev rundt kreft lesjon, med en høyere andel av de anti-inflammatoriske M2-makrofager og betydelig lavere antall klassisk aktiverte M1-makrofager. Interessant, våre resultater indikerer at gastrin ekspresjon i tumorvevet utøver en negativ innflytelse på antall tumorale M2-makrofager.
ekspresjon av gastrin i tumor epitelceller korrelerer negativt med antallet tumor M2-makrofager og vår in vitro resultatene tyder på en årsakssammenheng mellom begge faktorer. Humane makrofager ble oppnådd ved å dyrke perifere monocytter i nærvær av progastrin viste redusert ekspresjon av CD206. Videre har dette peptid vesentlig hindret ekspresjon av CD206 når modne makrofager ble stimulert med Th2 cytokin IL4 å indusere en M2-fenotype. I motsetning til dette ble progastrin ikke påvirke ekspresjon av kostimulerende molekyl CD86 enten i hvilebetingelser eller i makrofager stimulert med LPS pluss IFNy for å utvikle en M1-fenotype. Progastrin påvirker også mønster av cytokinsekresjon. Makrofager maturated i nærvær av dette peptid frigjort lavere mengder av de anti-inflammatoriske cytokin IL10 og samtidig opprettholde normal frigivelse av Th1-indus IL12. I IL4-stimulerte makrofager, virkningene på cytokinsekresjon var forskjellig, men i samme retning. I dette tilfellet, IL10 frigivelse var upåvirket mens peptidet lettes IL12 sekresjon. Således er det expectable at disse makrofager som er under påvirkning av progastrin i kreftvev presentere en avstumpet anti-inflammatorisk, immunosuppressiv profil.
Denne virkning er i tråd med den tidligere beskrevne proinflammatorisk virkning av gastrin [11 ]-[1. 3]. Vi observerte at gastrin bidrar til inflammasjon indusert av Helicobacter pylori hos rotter sannsynligvis via CCK-2-reseptor-aktivering i makrofager, mens stimulering av denne reseptoren aktiverer humane endotelceller for å fremme adhesjon monocytt. CCK-2-reseptorer kan binde alle gastrin-peptider, selv om deres affinitet for moden gastrin er vesentlig høyere enn det som vist for progastrin. Handlingene til sistnevnte kan alternativt overføres av nylig karakterisert ikke-konvensjonelle reseptor annexin-II [9]. Begge typer reseptorer er til stede i makrofager og begge veier fremme makrofagaktivering [14]. Dermed de foreliggende resultatene forsterke forestillingen om at gastrin peptider tendens til å bidra til betennelse selv om annen mekanisme kan være involvert i hvert enkelt tilfelle.
Påvirkningen av makrofager på kreft progresjon er på grunn av deres effekt på immunrespons mot svulst, men også til en direkte lokal virkning på de omliggende epiteliale kreftceller. Makrofager kan være en kilde til Wnt ligander [17], den onkogene sti aktivert i de fleste kolorektal kreft og en betydelig bidragsyter til kreftcelle stemness [18], [19]. Sekresjon av disse faktorene er spesielt relevant i en subpopulasjon av TAMs som synes å spille en særlig rolle i tumor invasivitet ved å fremme angiogenese og tumorcellemigrering gjennom Wnt-signalisering [20], [21]. Wnt1 ble påvist i cellene i tumor stroma og dens tilstedeværelse tendens til å minke, som nivået av gastrin i tumoren øket. Vi har nylig observert at utskillelsen av Wnt ligander er spesielt økt i M2 makrofager, som fremmer Wnt /β-catenin signalveien og den påfølgende proliferativ aktivitet i co-kultivert tykktarmskreftceller [16]. Våre resultater viser at foreliggende makrofager maturated i nærvær av progastrin uttrykker lavere mengder av tre forskjellige wnt ligander og fremkalle en betydelig reduksjon i antallet av co-dyrkede Caco-2-celler. Denne effekten oppstår med en samtidig reduksjon i uttrykket i disse colonic celler av Lgr5, en Wnt target gen [22] som forsterker Wnt /β-catenin signal [18]. Dessuten, makrofager maturated i nærvær av progastrin har en tendens til å øke apoptose hastigheten i Caco-2-celler, en virkning som også kan være forbundet med redusert Wnt signalering [23]. Således er de fenotypiske endringer indusert av progastrin i makrofager modifisere deres innflytelse på tykktarmskreft epitelceller som resulterer i et redusert antall av disse celler sannsynligvis ved en kombinasjon av redusert spredning og økt apoptotisk celledød. I tillegg har redusert produksjon av wnt ligander indusert av progastrin kan også bidra til de beskrevne fenotypiske endringer indusert av dette peptid siden en autokrin virkning av Wnt5a i makrofager for å redusere ekspresjonen av IL12 i respons til bakterielle produkter blitt beskrevet [24].
fra våre resultater kan vi slutte at gastrins, ved å hemme anskaffelse av et M2-fenotype i lokale makrofager, kan regulere kreft progresjon. Det er klart at M2 makrofager stimulere veksten av kolon-kreft-epitelceller in vitro og eksperimentelle studier viser at M2-makrofager i tumoren fremme koloncancer i mus [25] – [27]. I humane kolorektale cancere, synes virkningen av M2-makrofager mer komplisert og påvirkes av flere faktorer som deres romlige fordeling [4], den relative mengde av M1 makrofager [5] eller stadium av sykdommen [4]. Selv om deres tilstedeværelse har blitt sett på som en negativ prognostisk faktor av noen forfattere [28], andre foreslår at M2 makrofager har en mindre farlig effekt på human kolorektal kreft enn i andre innstillinger og peker på ideen om at noen lokale faktor spesielt til stede i denne typen av tumorer kan være å nedregulere deres tumor-fremmende virkning [4], [5], [29]. Husk at M1 og M2 makrofager er ikke clonally ulike sett av celler, men ytterpunktene av et bredt spekter av mellom fenotyper og at klassifiseringen av en celle som en M2 makrofag kan være forutinntatt av molekylær markør valgt i hvert tilfelle, lanserer vi ideen om at disse makrofager identifisert som M2 i disse studiene kan være mindre skadelig på grunn av progastrin.
En direkte proliferativ funksjon progastrin på epitelceller har blitt tydelig demonstrert i isolerte celler og mus, og eksperimentelle studier med transgene dyr foreslå at overekspresjon av gastrins i nærvær av DNA-skadende midler forbedrer carcinogenesis. Dette bevis har bedt flere farmakologiske strategier for å nøytralisere aktiviteten til gastrin peptider, med vellykkede resultater i murine modeller, men dessverre er det få og ubestemt resultater hos pasienter [30]. Våre funn tyder på at, i det minste i mennesker, kan progastrin spille en mangesidig rolle i progresjonen av kolorektale svulster, som sin proliferativ aktivitet på epitelceller ville bli motarbeidet av et potensielt anti-tumoral virkning som utøves på makrofager. Relevansen av denne effekten på immunceller for den globale aktiviteten progastrin venter evaluering av fremtidig forskning.
Konklusjoner
Vår studie viser at gastrin peptider syntetisert av kolon kreftcellene har makrofager som sine mål og sannsynligvis påvirke inflammatoriske infiltrat av tumoren, noe som i sin tur påvirker progresjon av kreft. Inhiberingen av M2-polarisering indusert ved progastrin ville motvirke deres proliferative aktivitet og, selv om det er vanskelig å anslå størrelsen på denne effekten bør denne observasjonen tas i betraktning ved analyse av den terapeutiske verdi av gastrin immunoneutralization [31].
takk
Vi takker Brian Normanly for sin engelske språket redigering og Hematologisk service av Hospital Clínico Universitario de Valencia for utvinning av blodprøver.
