Abstract
Nylig MIR-182 har blitt rapportert å være over-uttrykt i prostata cancer (PC) vev, men detaljert funksjonell analyse av MIR-182-5p har ikke blitt gjennomført. Hensikten med denne studien var å: 1. analysere funksjon av MIR-182-5p i prostatakreft, 2. vurdere nytten som en svulst markør, 3. identifisere MIR-182-5p målgener i PC, 4. undersøke potensialet for MIR-182-5p inhibitor som skal brukes i PC-behandling. I utgangspunktet har vi funnet at Mir-182-5p uttrykk var betydelig høyere i prostata kreft vev og cellelinjer i forhold til normal prostata vev og celler. Videre høy MIR-182-5p uttrykk var assosiert med kortere total overlevelse i PC-pasienter. For å studere den funksjonelle betydningen av MIR-182-5p, vi slått ned MIR-182-5p med MIR-182-5p hemmer. Etter MIR-182-5p knock-down, prostatakreft celleproliferasjon, migrasjon og invasjon ble redusert. Vi identifiserte
FOXF2
,
RECK Hotell og
MTSS1
som potensielle mål gener fra Mir-182-5p bruker flere algoritmer som ble bekreftet av 3’UTR luciferase assay og Vest-analyse . Knock-down av MIR-182-5p også betydelig redusert
in vivo
prostata tumorvekst. Som konklusjon er dette den første rapport som dokumenterer at over-ekspresjon av MIR-182-5p er forbundet med prostatakreft progresjon og potensielt nyttig som et prognostisk biomarkør. Også slå ned på MIR-182-5p for å øke uttrykket av tumorsuppressorgener
FOXF2
,
RECK Hotell og
MTSS1
kan være av terapeutisk nytte i prostata kreft behandling .
Citation: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Deng G, Tanaka Y, Tabatabai ZL, et al. (2013) mikroRNA-182-5p fremmer celle invasjon og spredning av Down Regulering
FOXF2
,
RECK og MTSS1
Gener i Menneskelig prostatakreft. PLoS ONE 8 (1): e55502. doi: 10,1371 /journal.pone.0055502
Redaktør: Soumitro Pal, Barnesykehuset i Boston Harvard Medical School, USA
mottatt: 9. oktober 2012; Godkjent: 23 desember 2012; Publisert: 30 januar 2013
Dette er en åpen tilgang artikkelen gratis all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Center for Forskning Resources av National Institutes of Health gjennom Grant Antall RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA Merit omtale tilskudd, VA Program Prosjekt og Yamada Science Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Prostatakreft (PC) er en av de vanligste kreftformen hos amerikanske menn [1]. Årsakene til PC er i stor grad ukjent, selv om flere risikofaktorer som etnisitet, familiehistorie, og alder er assosiert med sykdommen [2]. I tillegg har flere diettbestanddeler blitt knyttet til PC risiko og forebyggelse [3], [4]. Som prostata-spesifikt antigen (PSA) screening har spredd seg, har antallet herdbare pasienter hadde en tendens til å øke. Men et betydelig antall pasienter med lymfeknutemetastaser identifisert under radikal prostatektomi, noe som gjør behandlingen vanskeligere [5].
Nylig en rekke miRNAs har blitt identifisert og rapportert å være viktig i flere kreftformer [6] . MicroRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA omtrent 22 nukleotider i lengde, som er i stand til å regulere genekspresjon både på transkripsjons- og translasjonsnivåer [7]. Mirnas binde seg til det 3′-ikke-translaterte region (UTR) av mål-mRNA og undertrykker oversettelse fra mRNA til protein eller indusere mRNA spaltning, og dermed regulerer ekspresjonen av målgener for eksempel tumor suppressor eller onkogener [8], [9]. Nylig MIR-182 har blitt rapportert å være overuttrykt i prostatakreft [10]. Men har ikke blitt gjennomført funksjonsanalyse av MIR-182-5p i prostatakreft. Derfor hypoteser vi at Mir-182-5p kunne fungere som en onkogen og være en ny molekylær biomarkør i prostatakreft. For å teste denne hypotesen, i første omgang har vi funnet at Mir-182-5p uttrykk var betydelig høyere i prostata kreft vev sammenlignet med normal prostata vev. I tillegg ekspresjonen av MIR-182-5p var signifikant høyere i prostatacancercellelinjer (LNCaP, PC-3, DU145) sammenlignet med normal prostata epitelceller (RWPE-1). For funksjonsanalyse studiene ble MIR-182-5p slått ned ved hjelp av en MIR-182-5p hemmer. Vi brukte også flere algoritmer for å søke etter potensielle tumorsuppressorgener som målgruppe for MIR-182-5p. 3’UTR luciferase assay og vestlige analyser ble utført for å bekrefte direkte interaksjon mellom MIR-182-5p og disse målgener. Endelig har vi etablert stabil lav MIR-182-5p uttrykker cellelinjer og utført
in vivo
studier for å observere eventuelle svulst undertrykkelse effekter i en xenograft naken mus modell.
Resultater
miRNA-182 uttrykk er betydelig økt i prostata kreft vev og korrelert med total overlevelse
MiR-182-5p uttrykk nivåer i kliniske prøver (52 prøver) ble bekreftet ved real-time PCR. MiR-182-5p ekspresjon er vist som forholdet mellom tumor (T) /og normal (N) uttrykket (T /N-forholdet) i hver sammenkoblet prøve (figur 1). Hvis således T /N-forholdet er over 1,0, er MIR-182-5p uttrykk bedømt til å være høyere i prostatakreft vev sammenlignet med den i matchet tilstøtende normalt vev. Som vist i figur 1 A, i 5 pasienter (9,7%), T /N-forholdet var mindre enn 1,0, mens i de andre 47 pasienter (90,3%), T /N-forholdet var mer enn 1,0. Derfor MIR-182-5p uttrykk var betydelig høyere i prostata kreft vev sammenlignet med matchede normale prostata vev. Vi delte de 52 pasienter med prostatakreft i to kategorier basert på gjennomsnittlig T /N ratio (2,27) som følger: 1) høy MIR-182-5p uttrykker gruppe (MIR-182-5p T /N ratio høyere enn 2,27), 2 ) lav MIR-182-5p uttrykker gruppe (MIR-182-5p T /N-forholdet lavere enn 2,27). Vi undersøkte sammenslutning av MIR-182-5p og flere kliniske parametere som vist i Figur 1-B. Kaplan Meier plott viste at total overlevelse signifikant kortere i høy MIR-182-5p uttrykker gruppen (p-verdi = 0,0117, Log-rank test) (figur 1-C).
A. Relativ MIR-182-5p uttrykk [hver svulstvev (T) /normal prostata vev (N)] basert på sanntids PCR resultater, B. Sammenhengen mellom MIR-182-5p uttrykk og klinikk-patologisk parametere (alder ved diagnose, PT , Gleason keeper, PSA svikt og total overlevelse) i prostata kreft vev basert på q-PCR resultater. C. Kaplan-Meier plott av over-all overlevelse etter radikal prostatektomi.
miRNA-182-5p uttrykk er betydelig økt i prostata kreft cellelinjer
MiR-182-5p uttrykk var signifikant høyere i prostatacancercellelinjer (LNCaP, PC-3 og DU145) sammenlignet med normal prostata cellelinje (RWPE-1) (figur 2A).
A. Uttrykket av MIR-182-5p var betydelig høyere i tre prostatakreft cellelinjer i forhold til en normal prostata cellelinje (RWPE-1), B. Relativ MIR-182-5p uttrykk (MIR-NC eller MIR-182-5p forløper transfektert RWPE-1 celler), B. celleviabilitet analysen (MIR-NC eller MIR-182-5p forløper transfektert RWPE-1 celler), C. sårtilheling assay (MIR-NC eller MIR-182-5p forløper transfektert RWPE-en celler). Feilfelt representerer ± S.D. (Standardavvik).
Effekt av mikroRNA-182-5p over-uttrykk på celle levedyktighet og migrasjon i en normal prostata cellelinje
For å bekrefte funksjonen av MIR-182- 5p, transfiserte vi MIR-182-5p forløper inn i en normal prostata cellelinje (RWPE-1). Ved 48 timer etter transfeksjon av MIR-NC eller MIR-182-5p forløper til RWPE-1 celler ble MIR-182-5p uttrykk nivå verifisert av real time PCR (endring, 526, fig 2-B.). Deretter celleviabilitet (MTS analyse) og sårtilheling analysene ble utført ved hjelp RWPE-1 celler transient transfektert med miRNA-182-5p forløper. Vi observerte betydelig økt celleproliferasjon (fig. 2-C) og migrasjon (fig. 2-D) i miRNA-182-5p transfektert celler i forhold til Mir-NC transfekterte celler.
Effekt av mikroRNA-182- 5p slå ned på celle levedyktighet, invasjon og migrasjon i PC-cellelinjer
Vi brukte to prostata kreft cellelinjer (PC-3 og DU145) med høy MIR-182-5p uttrykk for videre eksperimenter siden MIR-182 -5p ekspresjon var signifikant høyere i disse cellelinjene. Ved 48 timer etter transfeksjon av inhibitor-NC eller MIR-182-5p inhibitor i PC-3 og DU145 cellene, Mir-182-5p knock-down ble verifisert av real time RT-PCR (0,003, 0,034, henholdsvis) (Fig . 3-A). Celleviabilitet (MTS-analyse), ble migrering og invasjon analysene ble utført (fig. 3-B, 3-C, 3-D) og vi har observert en signifikant reduksjon i celleformering (fig. 3-B), invasjon (Fig. 3 C) og migrasjon (fig. 3-D) i miRNA-182-5p knockdown PC-3 og DU-145 celler sammenlignet med inhibitor-NC transfekterte celler.
To prostatakreft cellelinjer (PC-3 og DU145) ble transient transfektert med enten MIR-182-5p hemmer eller MIR-negativ kontroll (MIR-NC-hemmer). A. Relativ MIR-182-5p uttrykk (MIR-NC-hemmer eller MIR-182-5p hemmer transfektert PC celler), B. Celleviabilitet assay (MIR-NC-hemmer eller Mir-182-5p hemmer transfekterte PC-celler), C. Invasion analysen, D. sårtilheling analyse (24 timer). Feilfelt representerer ± S.D. (Standardavvik).
MIR-182-5p direkte regulerer FOXF2, RECK og MTSS1
Vi identifiserte tre tumorsuppressorgener (
FOXF2
,
RECK, MTSS1
) som potensielle mål gener for Mir-182-5p basert på tre algoritmer (miRDB, TargetScan, microRNA.org).
FOXF2 mRNA har to potensielle bindingssteder for MIR-182-5p innenfor sin 3 «UTR (fig. 4-A). Den relative luciferase-aktivitet er vist som et forhold mellom ildflue og Renilla luciferase-aktivitet for hver prøve. Mellom de to områdene, ble den relative luciferaseaktiviteten betydelig redusert ved posisjon 670 i MIR-182-5p forløper transfekterte celler (Fig. 4-B). RECK mRNA har en potensiell bindingssete (posisjon 812) for MIR-182-5p innenfor sin 3 «UTR (Fig. 4-A). Den relative luciferaseaktivitet ble signifikant redusert når stillingen 812 konstruksjonen ble anvendt i MIR-182-5p forløper transfekterte celler (Fig. 4-B). MTSS1 mRNA har fire potensielle bindingssteder for Mir-182-5p innenfor sitt 3’UTR og den relative luciferase aktiviteten ble betydelig redusert i posisjon 1909 i MIR-182-5p forløper transfekterte celler (Fig. 4-B). Med muterte plasmider (vist som «M»), var det ingen signifikant forskjell i luciferaseaktivitet mellom kontroller og MIR 182-5p-forløper transfektanter (fig. 4-B). Siden målet genet protein uttrykk er lav i PC-3 og DU145, utførte vi Western analyse for å observere eventuelle endringer i protein uttrykk med MIR-182-5p hemmer. Som vist i fig 4-C, ble protein ekspresjon av målgener signifikant økt etter MIR-182-5p inhibitor transfeksjon (fig. 4-C). Dette resultatet tyder på at FOXF2, Reck og MTSS1 mRNA er direkte mål av MIR-182-5p.
A. FOXF2, RECK og MTSS1 3’UTR posisjon og utfyllende MIR-182-5p sekvens. B. 3’UTR Luciferase assay (MIR-NC og MIR-182-5p forløper), Feilfelt representerer ± S.D. (Standardavvik). C. Protein uttrykk for FOXF2, RECK, MTSS1, MMP-2 og beta-tubulin i MIR-NC-hemmer eller MIR-182-5p hemmer transfektert prostatakreftceller (PC-3, DU145).
Vi har også bekreftet aktiv MMP-2-protein ekspresjon, siden det er en nedstrøms effektor av RECK. Som vist i fig 4-C, ble spaltet MMP-2 (aktiv type) protein ekspresjon signifikant redusert i MIR-182-5p inhibitor transfekterte celler.
MIR-182-5p inhibitor effekt på tumorvekst i en in vivo naken mus modell
for å kunne observere MIR-182-5p hemmer effekter på tumorvekst i nakne mus, brukte vi en lentiviral basert system, og etablert stabil lav MIR-182-5p uttrykke PC-3 celler og kontroller (fig. 5-A). Vi brukte 8 mus (4 mus, stabilt lav MIR-182-5p, 4 mus, kontroll) og observerte at stabil lav MIR-182-5p uttrykker cellelinjer hadde betydelig redusert tumorvolumet i nakne mus sammenlignet med kontroller (Fig 5-. B). Siden vi ikke kunne påvise tumor i en av de lave MIR-182-5p uttrykk grupper, ble det utelukket fra forsøket. Vi målte mikroRNA nivåer i xenografttumorer (MIR-182-5p-hemmer og hemmer-NC), og fant ut at Mir-182-5p uttrykk var betydelig lavere i MIR-182 hemmer xenografter sammenlignet med inhibitor-NC xenografter (Fig. 5-B). Typiske brutto utseende bilder av svulster er vist i fig. 5-C. Som vist i figur 5-D, protein uttrykk for de tre målgener (FOXF2, RECK, MTSS1) var signifikant høyere i stabilt lavt MIR-182-5p uttrykke xenograft tumor vev.
A. Tid registrering av tumorstørrelse i MIR-NC og MIR-182-5p hemmer xenografter. B. Relativ MIR-182-5p uttrykk ved injeksjon av celler og høsting av xenografter. Feilfelt representerer ± S.D. (Standardavvik). MiR-182-5p uttrykk var betydelig lavere i MIR-182-5p hemmer gruppe. C. Typisk brutto utseende naken mus svulster i kontroll- og MIR-182-5p hemmer grupper. D. Uttrykk for FOXF2, RECK og MTSS1 protein i tumorxenotransplantater.
Effekt av over-uttrykk for RECK og MTSS1 på prostatakreftceller (PC-3 og DU 145) -funksjonen
for å undersøke funksjonen av RECK og MTSS1, overexpressed vi RECK og MTSS1 i prostatakreftceller som ble bekreftet ved å måle mRNA (fig. 6-A) og protein uttrykk nivåer (fig. 6-B). Deretter utførte vi flere funksjonelle analyser. Som vist i figur 6, celle-levedyktighet (fig. 6-C), invasjon (fig. 6-D) og migrasjon (fig. 6-E) ble signifikant hemmet i RECK og MTSS1 transfektert prostata kreftceller.
ved 24 timer etter transfeksjon av enten pCMV6-tom, pCMV6-RECK eller pCMV6-MTSS1 inn i prostatakreftceller (PC-3 og DU 145), Reck og MTSS1 ekspresjonsnivåene ble verifisert ved sanntids RT-PCR (A) og Western analyse (B) C. Celleviabilitet analysen, D. Invasion analysen, E. Sårtilheling analysen Feilfelt representerer ± SD (Standardavvik).
Effekt av FOXF2 siRNA knockdown på celleproliferasjon, invasjon og migrasjon i prostata kreft celler
Etter FOXF2 siRNA slå ned (Fig. 7-A), der var ingen forskjell i celleformering mellom Si-NC og si-FOXF2 transfekterte PC-celler (fig. 7-B). Men celle invasjon og sårtilheling var signifikant økt i si-FOXF2 transfektert PC-celler (fig. 7-C, Fig. 7-D).
A. FOXF2 proteinekspresjon (Si-NC eller si-FOXF2 transfekterte celler PC). B. Celleviabilitet assay (Si-NC eller si-FOXF2 transfekterte celler PC). C. invasjon analysen, D. sårtilheling analysen (8 timer), Feilfelt representerer ± S.D. (Standardavvik).
Diskusjoner
Flere microRNAs har blitt identifisert som onkogene i prostata kreft basert på deres økt uttrykk i prostata kreft vev eller prostatakreft cellelinjer [10], [ ,,,0],11] – [14]. Funksjonelle analyser har blitt utført med noen av disse onkogene microRNAs. For eksempel har MIR-21 er rapportert å fremme invasjon og apoptose motstand i prostatakreftceller [15], [16] og MIR-125b fremmet vekst av prostatakreft xenograft tumorer ved å målrette pro-apoptotiske gener [14]. MiR-373 og MIR-520C har også blitt rapportert å fremme tumorinvasjon og metastase i prostata kreft [12].
En rapport har vist at MIR-182 er en tumor suppressor i en lungekreft cellelinje [17 ], mens MIR-182-5p er blitt rapportert å være et onkogen i flere krefttyper [18] – [23]. Segura et al rapporterte at avvik MIR-182-5p uttrykk forfremmet melanoma metastaser [18]. Liu et al fant at Mir-182-5p overekspresjon økt tumor transformasjon og svulst invasivitet
in vitro Hotell og forbedret metastaser
in vivo
i eggstokkreft celler [21]. Derfor er bare to rapporter har vist at MIR-182-5p er et onkogen basert på funksjonsanalyse i melanoma og eggstokk-kreft [18], [21].
I likhet med våre resultater, to andre studier funnet MIR-182 -5p uttrykk for å være betydelig høyere i prostata kreft vev i forhold til normal prostata vev [10], [22], men de ikke utfører funksjonsanalyse. I vår studie, observerte vi at Mir-182-5p uttrykk var betydelig høyere i prostata kreft vev og prostatakreftcellelinjer i forhold til normal prostata vev og cellelinjer. Interessant fant vi at høy MIR-182-5p uttrykk ble korrelert med kortere total overlevelse etter radikal prostatektomi i prostatakreftpasienter. Dermed vår neste mål var å belyse hvorvidt MIR-182-5p fungerer som et onkogen i prostatakreft. For å løse dette spørsmålet, vi først transfektert MIR-182-5p inn i en normal prostata cellelinje (RWPE-1) og observerte at MIR-182 økt celledeling og såret helbredende evner. Vi har også utført
in vitro
funksjonelle analyser ved hjelp av en MIR-182-5p inhibitor i prostatakreftceller. Siden MIR-182-5p uttrykk var høyere i alle tre prostata kreft cellelinjer (LNCaP, PC-3, DU145) i forhold til normal prostata epitelceller, brukte vi de to høyeste MIR-182-5p uttrykker cellelinjer (PC-3 og DU145) for funksjonell knockdown-analyser. Som forventet, ble redusert MIR-182-5p knockdown celle proliferasjon, migrering og invasjon i disse cellelinjene. Som det tidligere har blitt rapportert at Mir-182-5p overekspresjon forfremmet melanom metastase og var onkogene i naturen, våre resultater tyder også på at Mir-182-5p kan være et onkogen i prostatakreft cellelinjer.
Vår neste Målet var å identifisere målgener av MIR-182-5p siden microRNAs utøve sine effekter ved å regulere uttrykket av andre målgener. Vi brukte flere algoritmer (miRDB, microRNA.org, TargetScan) og identifisert tre mulige målgener (FOXF2, RECK, MTSS1). Som vist med 3’UTR luciferase assay og Vest-analyser, de tre mulige målgener (FOXF2, RECK, MTSS1) uttrykk ble regulert av MIR-182-5p.
Av de tre målgener (RECK, MTSS1, FOXF2), RECK overekspresjon ble rapportert å redusere celle invasjon ved å hemme MMP inkludert MMP-2 [24]. RECK ekspresjon har blitt rapportert å bli nedregulert i flere kreftformer, inkludert prostata kreft [24]. I vår studie, observerte vi at MIR-182 inhibitor nedsatt aktiv-MMP-2 uttrykk i prostatakreftcellelinjer samt oppregulering av RECK protein. I tillegg undersøkte vi RECK funksjon med over uttrykker det i prostata kreft cellelinjer (PC-3 og DU 145). Som vist, RECK hemmet celle migrasjon og invasjon i prostatakreftceller. Rabien et al viste at RECK overekspresjon redusert invasiv potensialet DU 145 celler [25] og deres resultater er lik vår. Men vi observert at RECK hemmet celledeling i to prostatakreft cellelinjer (PC-3 og DU 145), mens Rabien et al fant ingen effekt av RECK på celleproliferasjon i DU-145 celler. Imidlertid RECK har blitt rapportert å redusere celleproliferasjon i andre kreft [26], [27]. Dermed ytterligere forsøk er nødvendig for å avklare disse forskjellene. Så langt MIR-21 og MIR-222 har blitt funnet å målrette RECK i prostatakreft og magekreft [28], [29] men det har vært noen rapporter om MIR-182-5p og RECK. Men våre resultater viser at Mir-182-5p direkte regulerer RECK uttrykk i prostatakreftcellelinjer.
MTSS1 (metastase tumor suppressor-1) ble først identifisert som en tumor suppressor genet i blærekreft [30]. Nylig funksjon av MTSS1 ble undersøkt i prostatakreftcellelinjer og ble funnet å signifikant undertrykke cellemigrering og proliferasjon [31]. I tillegg MIR-182 er meldt ned-regulere MTSS1 og fremme metastasering av leverkreft [32], et resultat svært lik vår.
FOXF2 har blitt rapportert å nedregulere MMP-1 og up-regulere TIMP3, en kjent inhibitor av MMP [33]. Videre FOXF2 reduserer Wnt5a [34], som virker gjennom ikke-kanoniske Wnt signalveier å fremme angiogenese og celle overlevelse. Wnt5a uttrykk i prostata kreft vev er korrelert med høy Gleason score og biokjemiske prostatakreft tilbakefall [35]. Knockdown og overekspresjon av Wnt5a i menneskelig prostata kreft cellelinjer redusert og stimulert henholdsvis invasjon aktivitet [35]. Videre Wnt5a indusert ekspresjon av metalloproteinase-1 (MMP-1) i prostatakreft [34], [35]. I vår studie, FOXF2 slå ned økt celle invasjon og migrasjon i prostata kreft cellelinjer. Dermed våre resultater tyder på at onko-MIR-182-5p kan være involvert i reguleringen av disse invasjon og metastatisk suppressor gener. Nylig MIR-301 ble definert som et onkogen, og det ble rapportert å megle spredning via regulering FOXF2 i brystkreft [36]. Bortsett fra MIR-301, har ingen studier vist direkte regulering av FOXF2 av en miRNA.
Vi har også undersøkt om mulig bruk av MIR-182-5p inhibitor som en potensiell PC behandling. For å oppnå dette, brukte vi en
in vivo
naken mus xenograft modell med stabil lav MIR-182-5p uttrykker prostatakreftceller for denne studien. Tumorvolumet i nakne mus ble signifikant redusert i lav MIR-182-5p uttrykkende celler sammenlignet med kontrollceller. I tillegg nivåene av FOXF2, RECK og MTSS1 var signifikant høyere i xenograft vev fra lav MIR-182-5p uttrykker prostatakreftceller. Disse resultatene indikerer at knockdown av MIR-182-5p økt uttrykk av disse tumor suppressor målgener
in vitro Hotell og
in vivo
. Siden vi fokusert på tre mål gener (
Reck
,
MTSS1 Hotell og
FOXF2
) og undersøkt bare 52 kliniske prøver, vil ytterligere undersøkelser være nødvendig for å belyse rollen som MIR -182-5p i prostatakreft og dens bruk i kliniske applikasjoner.
i konklusjonen dette er den første rapporten som dokumenterer at overuttrykk av MIR-182-5p er assosiert med prostatakreft progresjon og potensielt nyttig som en prognostisk biomarkør. I tillegg banket ned av MIR-182-5p med inhibitor kan være av terapeutisk nytte for å øke uttrykket av tumorsuppressorgener FOXF2, Reck og MTSS1 i prostatakreftceller.
Materialer og metoder
Etikk Statement
Formalin fiksert, parafininnstøpte (FFPE) prostatakreft prøver ble innhentet fra San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF komité for menneskeforskning (Godkjenningsnummer: H9058-35751-01).
Dyr
Alle dyr omsorg var i samsvar med retningslinjene i San Francisco Veterans Affairs Medical Center og studien ble godkjent av San Francisco VA IACUC (Protocol nummer~~POS=HEADCOMP: 08-003-01). Animal brukere har fullført opplæringsprogrammer for å håndtere og arbeide med mus gjennom AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) før dyreforsøk. Totalt 8 nakne mus (stamme BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) ble anvendt, og utgangspunktet prostatakreftceller ble injisert subkutant og tumorstørrelse ble overvåket som nevnt på side 7. Etter at tumorvekst ble musene avlivet med en overdose av isofluran ved inhalering. Deretter xenograft vev ble fjernet.
Kliniske prøver
Totalt 52 pasienter med patologisk bekreftet prostatakreft ble inkludert i studien (Veterans Affairs Medical Center i San Francisco). Prøver ble hentet fra pasienter etter skriftlig informert samtykke. Detaljert pasientinformasjon er vist i tabell 1.
Cell kultur
Normal prostata epitelceller (RWPE-en, ATCC nummer-CRL-11609) og prostatakreft cellelinjer (LNCaP; ATCC nummer-CRL-1740, PC-3, ATCC nummer-CRL-1435, DU145; ATCC nummer-HTB-81) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Prostatakreft-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. RWPE-1 celler ble dyrket i keratinocyte-SFM (GIBCO /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Når kjøpt, ble faste bestander av celler fremstilt og alle cellene ble lagret ved -80 grader inntil bruk. Celler ble anvendt for eksperimenter i løpet av 6 måneder.
Total RNA og protein utvinning
RNA (mikroRNA og total-RNA) ble ekstrahert fra formalinfiksert, parafin-innleiret (FFPE) human prostatakreft ( n = 52) og passet tilstøtende ikke-kreft normal prostata vev (n = 43) eller benign prostata hyperplasi (BPH) (n = 9) ved hjelp av en miRNeasy FFPE-kit (Qiagen) etter laser fange mikro disseksjon basert på en patolog vurderinger. RNA (mikroRNA og total-RNA) ble også ekstrahert fra humane cellelinjer ved hjelp av en miRNeasy mini-sett (QIAGEN) og ekstrahert fra xenograft vevene homogenisert i 1 ml TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og deretter renset med RNeasy kolonner (QIAGEN). Å fordøye DNA, ble en Qiagen RNase-Free DNase kit brukes. Celler ble lysert med RIPA-buffer (Pierce, Brebieres, Frankrike) inneholdende proteaseinhibitorer (Sigma, St. Louis, MO). Protein ble hentet fra xenograft vev ved hjelp Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) (Thermo Scientific, Rockford, IL). Protein kvantifisering ble gjort ved hjelp av en BCA proteinanalyse kit (Pierce, Brebieres, Frankrike).
mikroRNA og mikroRNA inhibitor transfeksjon
Anti-MIR ™ miRNA hemmer [negativ kontroll (MIR-NC-hemmer) eller MIR-182-5p inhibitor (MIR-182-5p hemmer), Ambion] ble transient transfektert inn i kreftceller med SIPORT NeoFX Transfeksjon Agent (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. Forhånds MIR ™ miRNA forløpere [negativ kontroll (MIR-NC) eller HSA-MIR-182-5p (MIR-182-5p), Ambion] ble transfektert inn i celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Celleviabilitet, celle invasjon og sårtilheling analysen
Celleviabilitet ble målt 3 dager etter transfeksjon (MIR-NC-hemmer /MIR-182-5p hemmer transfektant) med MTS (CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay, Promega). Data er gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter. Cell invasjon ble utført med CytoSelect 24-brønnen celle invasjon analysen kit (Cell BIOLAB, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfekterte celler (MIR-NC-inhibitor /mir-182-5p inhibitor transfektant-48 timer) ble resuspendert i kulturmedium uten FBS og plassert i det øvre kammer i tre eksemplarer. Etter 48 timers inkubasjon ved 37 ° C (5% CO2), ble celler som migrerer gjennom membranen farget. Resultatene ble uttrykt som invaderte celler kvantifisert ved OD 560 nm. Sårheling Analysen ble utført med CytoSelect 24-brønnen til sårbehandling analysesett i henhold til produsentens instruksjoner. For å generere et sår felt, transfekterte celler (MIR-NC-hemmer eller MIR-182-5p inhibitor transfektant-48 timer transfeksjon) ble dyrket inntil de dannet et monolag rundt innsatsen. Etter fjerning av innsatsen, ble en 0,9 mm åpent sår felt som genereres og cellene ble tillatt å migrere fra hver sin side av gapet. Lukking av sår ble målt og prosent lukke ble målt. [Prosent nedleggelse rate (%) = migrert celleoverflate /totalt areal x100)].
kvantitativ real-time RT-PCR
kvantitativ real-time RT-PCR ble utført i tre eksemplarer med en Applied Biosystems Prism 7500 Fast Sequence Detection System bruker TaqMan universell PCR Master mix henhold til produksjon protokoll (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). De TaqMan prober og primere ble kjøpt fra Applied Biosystems. RNU48 ble anvendt som endogene kontroll. Nivåer av RNA uttrykk ble bestemt å bruke 7500 Fast System SDS programvareversjon 1.3.1 (Applied Biosystems).
Western analyse
Totalt celle protein (15-20 mikrogram) ble benyttet for Western blotting . Prøvene ble løst i 4-20% Nøyaktige Protein Gel (Pierce, Brebieres, Frankrike) og overført til PVDF membraner (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Membranene ble neddykket i 0,3% skummet melk i TBS inneholdende 0,1% Tween 20 i 1 time og probet med primær polyklonalt og monoklonalt antistoff mot FOXF2 (# ab23306, Abcam, Cambridge, MA), RECK (# 3433, Cell Signaling Technology), MTSS1 (# 4385, Cell Signaling Technology), MMP-2 (# 4022, Cell Signaling Technology) og beta-tubulin (# 2128, Cellesignalering signale~~POS=TRUNC Technology) over natten ved 4 ° C. Blottene ble vasket i TBS inneholdende 0,1% Tween 20 og merket med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundær anti-mus eller anti-kanin-antistoff (Cell Technology signalering, Beverly, MA). Proteiner ble forsterket av kjemiluminescens (Amersham ECL pluss Western Blotting deteksjonssystem, Fairfield, CT) for visualisering. De protein uttrykk nivåer ble uttrykt i forhold til beta-tubulin nivåer.
Plasmid konstruksjon og 3’UTR-luciferase assay
Vi konstruerte individuelle plasmider for hvert bindingssete i 3’UTR av mRNA fra potensielle mål gener basert på microRNA.org informasjon. Da fikk vi bekreftet MIR-182-5p binding til 3’UTR av målet genet mRNA ved luciferase assay med MIR-182-5p forløper. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor ble brukt til å utføre 3’UTR luciferase assay (Promega, Madison, WI, USA). Primersekvensene som brukes til plasmid innsatser er vist i tabell 2. I et totalvolum på 20 ul, 5 ul av hver av 100 uM forover primer og revers primer, 2 ul av 10 x annealing-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 10 mM EDTA) og 8 ul vann ble tilsatt til en 200 ul PCR-rør og inkubert ved 95 ° C i 5 minutter og deretter plassert i romtemperatur i 1 time. Oligonukleotidene ble ligert inn i
PME
I-
Xba
jeg stedet pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor. Colony direkte PCR ble utført for innsatsen anerkjennelse bruker REDTaq (Sigma, St. Louis, MO, USA). Primerne anvendt for PCR var som følger: forover primer, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 «; revers primer, 5»-gcagccaactcagcttcctt-3 «. PCR-parametrene for sykling var som følger: 94 ° C i 3 minutter, 30 sykluser med PCR ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 10 minutter og 4 ° C i 10 minutter. PCR-produktet ble kuttet med Noti (Takara /Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Størrelsene på vektorer som inneholder innsatser var omtrent 200 bp og 100 bp ved elektroforese siden NotI gjenkjenningssekvensen ble innlemmet i primere.
For MIR-182-5p forløper transfeksjon, prostata kreft celler var co- transfektert med MIR-NC og pmirGLO eller MIR-182-5p og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspresjonsvektorer bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
