Abstract
Bakgrunn
Cancer stamceller (CSC) kjøretur prostatakreft svulst overlevelse og metastasering. Ikke desto mindre er utviklingen av spesifikke terapier mot cscs hindret av mangelen på disse cellene i prostatavevet. Oppheng dyrkingssystemer har blitt rapportert å anrike cscs i primærkulturer og cellelinjer. Men de molekylære mekanismene bak dette fenomenet er ikke fullt utforsket.
metodikk /hovedfunnene
Vi beskriver en prostasphere analyse for anriking av CD133
+ cscs i fire kommersielle PCa celle linjer: 22Rv1, DU145, LNCaP og PC3. Overekspresjon av CD133, som bestemt ved strømningscytometrisk analyse, korrelert med en øket klonogene, kjemoresistent, og invasive potensiale in vitro. Denne fenotype er overensstemmende med den i cscs in vivo. Genekspresjon profilering ble så utført ved hjelp av Kreft Reference panel og NCounter systemet fra NanoString Technologies. Denne analysen avdekket flere oppregulert transkripsjoner som kan bli ytterligere utforskes som potensielle diagnostiske markører eller terapeutiske mål. Videre foreslår funksjonell annotering analyse som ΔNp63α modulerer aktiveringen av utviklingsveier ansvarlig for den økte stammen identiteten til celler som vokser i suspensjonskulturer.
Konklusjon /Betydning
Vi konkluderer med at profilering de genetiske mekanismene som er involvert i CSC berikelse vil hjelpe oss å bedre forstå de molekylære stier som ligger til grunn CSC patofysiologi. Denne plattformen kan lett tilpasses for å berike og analysere faktiske pasientprøver, for å utforme pasientspesifikke behandlingsformer som er rettet spesielt mot cscs
Citation. Portillo-Lara R, Alvarez MM (2015) Anriking av Cancer Stem Phenotype i Sphere kulturer av prostatakreft cellelinjer skjer gjennom aktivering av utviklingsveier mediert av Transkripsjonell Regulator ΔNp63α. PLoS ONE 10 (6): e0130118. doi: 10,1371 /journal.pone.0130118
Redaktør: Gagan Deep, University of Colorado Denver, USA
mottatt: 9 februar 2015; Godkjent: 18 mai 2015; Publisert: 25 juni 2015
Copyright: © 2015 Portillo-Lara, Alvarez. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Mest relevant data er i avisen og dens saksdokumenter fil (S1-fil) som inneholder alle genekspresjon verdier fra våre eksperimenter. Genuttrykk data ble sendt til Gene Expression Omnibus depot fra NCBI. Data kan nås på GEO nettstedet https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under GSE67248 sjonsnummer
Finansiering:. Forfatterne ønsker å takke for støtte fra Zambrano-Hellion Familie ( prosjekt ZH-Stem), Tecnológico de Monterrey (Seed finansiering CAT-122), og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología av México (CONACyT). Forfatterne er takknemlige for (CONACyT) for økonomisk støtte til RPL i form av et doktorgradsstipend
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest vanligste kreftformen i mennesket i verden, og likevel sin etiologi er fortsatt i stor grad uløst. Som tilfellet er i andre epiteliale vev, er cellulær homeostase i voksen prostata opprettholdes ved hjelp hierarkisk organisert celler med forskjellige proliferative potensial [1]. Somatiske SC’er plassert på toppen av dette hierarkiet utstillingen noen unike egenskaper, inkludert: evnen til å fornye seg selv og skille langs flere celle linjene, lokalisert vekst i spesialiserte fysiologiske microenvironments (nisjer), og selv om de er vanligvis sovende, viser de en bemerkelsesverdig proliferativ potensial [2]. Den hierarkiske stamcelle (SC) modell av carcinogenese holder som PCa kommer gjennom endringer av genetiske og epigenetiske faktorer som regulerer proliferasjon av normale SC’er [3]. Disse abnormt uttrykt trasé til slutt føre til transformasjon av normale SC’er til maligne kreftstamceller (cscs). Cscs beholde noen av de egenskapene forbundet med sine ikke-maligne kolleger, og antas å være ansvarlig for startfasen, progresjon og tilbakefall, samt metastatisk sykdom.
cscs er også antatt å være ansvarlig for utvikling av resistens overfor konvensjonell terapi [4,5]. Tradisjonell radio- og chemo-terapeutiske agenter er unnfanget under oppfatningen at alle celler i en svulst er fenotypisk like. Imidlertid cscs stole på iboende mekanismer som gjør dem forholdsvis mer elastisk enn terminalt differensierte celler, inkludert deres sakte prolifererende natur, høy ekspresjon av ATP-bindende kassett (ABC) membran transportører, og motstand mot DNA-skade og oksidativt stress [6]. Derfor CSC-spesifikke terapier har potensial til å utrydde sykdommen på sitt opphav, og til overs ikke-tumorigent SC’er, og dermed minimere de negative effektene forbundet med ellers nondiscriminating behandlinger.
Aktuelle metoder for isolering og studier av cscs er basert på uttrykk for overflatemarkører først identifisert i normal prostata SC’er (CD44
+ /α
2β
1
hi /CD133
+) [7]. CD133 i særdeleshet, har vært mye brukt som en biomarkør for isolering av celler som oppviser en stilk-lignende fenotype i en rekke normale og maligne vev [8,9]. Det isolerte Studiet av cscs tillater analyse av molekylære mekanismer som er ansvarlige for ondartet celleoverlevelse, atskilt fra de som forekommer i terminalt differensierte tumorceller eller i ikke-tumorigene SC populasjoner. Ikke desto mindre, har utviklingen av terapeutiske strategier basert på CSC-målretting vært begrenset på grunn av mangel på egnede eksperimentelle modeller.
humane primære tumorprøver (PTS) anses for å være den mest nøyaktige gjengivelse av tumoren in vivo . Imidlertid kompleksiteten av fysiologisk sammenheng påvirker ofte tolkningen av resultatene. I motsetning til dette humane kreftcellelinjer (CCLS) er mer dynamisk verktøy som kan brukes til å dissekere de mange forskjellige molekylære prosesser som er involvert i kreftutvikling. Selv PTS er fortsatt favoriserte over CCLS, gjør deres svært begrenset tilgang in vitro modeller «go-to» valg for mange forskningsgrupper over hele verden.
Nyere studier har vist at CCLS er lik in vivo ondartede svulster, som de består også av organisatoriske hierarkier med ulik grad av differensiering [10-12]. Strømningscytometri-analyse av PCA-cellelinjer angir at selv etter å ha forplantet seg i mange år, har de fremdeles inneholde påvisbare mengder stilk-lignende celler, om enn ofte ved ekstremt lave prosenter. Pfeiffer et al. rapportert at CD133
+ celler i DU145 cellelinje utgjør ca 0,01% av den totale befolkningen, mens DuCaP, LAPC-4, LNCaP, PC3, og 22Rv1 gir ingen påviselig CD133 uttrykk når analyseres via fluorescens aktivert celle sortering (FACS ) [1. 3]. Således, selv om CCLS representerer en svært tilgjengelig og praktisk alternativ til PTSs, forblir isolering av cscs fra denne kilde er vanskelig på grunn av de små antall av udifferensierte celler som finnes i kommersielle cellelinjer.
Suspensjon kultursystemer blir i økende grad brukt til berike udifferensiert cellepopulasjoner i PTSs og CCLS. Celler formeres ved hjelp av ikke-heftende underlag og serum-frie medier vokse som tredimensjonale sfæroide cellegruppene (tumorspheres) som fremmer spredning av stamcelle fenotyper [14,15]. Dette er et komplekst fenomen som sjeldne udifferensierte celler stimuleres til å drive symmetrisk divisjon å utvide SC rommet. Selv om flere variasjoner av tumorsphere analysen er rapportert, de genetiske mekanismer som utløser stamcelleproliferasjon in sfæroide kulturer har ikke blitt fullt ut undersøkt.
Modern genekspresjon analyseverktøy tillater studiet av transkripsjonelle forandringer med økt sensitivitet og spesifisitet sammenlignet med konvensjonelle microarray-baserte tilnærminger som er begrenset av store teknologiske utfordringer [16]. For eksempel, leverer NCounter Nanostring system digital avlesning av hvert molekyl av et mål-mRNA ved å bruke minimum mengder av utgangsmaterialet, og uten behov for cDNA-syntese [17]. Kort fortalt gjør dette systemet bruk av par av fangst og reporter sonder som er skreddersydd til hver mRNA mål sekvens. Etter hybridisering, blir transkripsjon /probe-komplekser immobilisert, innrettet i et elektrisk felt, identifisert, og nummerert på grunnlag av fargekodede koder som er koplet til reporter-proben.
Kopling dynamikken i in vitro modeller med høy -throughput genuttrykk profilering kan hjelpe i utviklingen av mer effektive CSC-målrettede terapeutiske strategier. Her har vi tilpasset en tumorsphere kultur protokoll for effektiv anrikning av CD133
+ cscs i fire kommersielle PCA cellelinjer: 22Rv1, DU145, LNCaP og PC3. Alle cellelinjer var i stand til å danne svært prolifererende og selvfornyende kuler når belagt i serumfritt, forankringsuavhengig forhold som vi brukte. Vi viser at CSC-tilknyttede funksjoner (f.eks CD133 uttrykk, samt økt proliferative, krenkende, og kjemoresistent potensielle) ble betydelig anriket i alle prostasphere kulturer. Genuttrykk profilering av foreldre og beriket kulturer som bruker NCounter NanoString systemet avdekket flere oppregulert transkripsjoner som deltar i etableringen av ondartet stammen fenotype. Videre foreslår funksjonell annotering at CSC-berikelse observert i prostasphere kulturer skjer via aktivering av utviklingsveier modulert delvis av transkripsjonsregulator ΔNp63α.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur protokoller
Alle cellelinjer ble kjøpt direkte fra ATCC. Celler ble brukt på følgende passasje tall: 22Rv1, passasje 11; DU145, passasje 16; LNCaP, passasje 13; PC3, passasje 18. For genuttrykk profilering eksperimenter, PC3 cellene ble dyrket i 6-brønners ultra-lave vedlegg kultur plater med EpiGRO menneskelige prostata Komplett Media Kit (hpcm, Millipore). For resten av forsøkene ble de fire cellelinjene formert ved anvendelse av tre forskjellige kultur protokoller: a) DMEM-FBS: monolagskulturer i DMEM-F12 (Gibco) supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) og 100 U /100 pg /ml penicillin-streptomycin (Gibco); b)-PLUS DMEM: ikke-klebende sfære (prostasphere, PS) kulturer dyrket i 6-brønn ultra-lave vedlegg kultur plater (Corning) med DMEM-F12 supplert med 20 ng /mL hEGF (Gibco), 20 ng /mL bFGF (Gibco), 1x B27 uten vitamin A (Invitrogen), 1x Insulin-Transferrin-Selen A (Invitrogen) og 100 U /100 pg /ml penicillin-streptomycin; og c) hpcm-PLUS: sfære kulturer i hpcm, ytterligere supplert med 20 ng /mL hEGF og 20 ng /mL bFGF. Monolagskulturer ble opprettholdt ved en maksimal samløpet nivå på 80%, og kulturmediet ble byttet ut hver 48 time. Prostasphere kulturer ble sådd ut ved en densitet på 2×10
4 celler /ml og vekstmedium ble fullstendig erstattet hver 96 timer på dag 4, og 8. Sperre og prostasphere kulturer ble formert i 12 dager ved 37 ° C ved 95% relativ fuktighet i en 5% CO
2 og 95% luftatmosfære. Ved slutten av dyrknings protokollen, ble cellene vokser i monolags og suspensjonskulturer enzymatisk dissosiert ved hjelp av 0,05% trypsin-EDTA-løsning (Gibco) og StemPro Accutase (Gibco), henholdsvis, i henhold til instruksjonene fra fabrikanten.
immunofluorescent merking, cellesortering og flowcytometri analyse
Dissosierte celler ble fluorescensmerkede i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av to monoklonale antistoffer: Anti-human CD133 /2 (293C3) -PE (Miltenyi Biotec) og Anti-human CD44 PE-Cyanine5 (eBioscience). Magnetisk aktivert cellesortering (MACS) ble utført ved anvendelse av anti-fykoerytrin mikroperler (Miltenyi Biotec) og CD133 /2 (293C3) -PE monoklonalt antistoff i henhold til produsentens instruksjoner. Flowcytometri analyse ble utført med en FACSCanto II flowcytometer med en 488-nm laser. Et minimum av 10
4 hendelser ble registrert for hver avlesning. Anti-mus IgG2b-PE isotypekontroll (Miltenyi) og ufargede celler ble brukt som kontroller. Forsøk ble utført i triplikat og gjentatt tre ganger.
NCounter NanoString genekspresjon profilering.
Total RNA ble ekstrahert fra PC3 prostaspheres og renset ved anvendelse av RNeasy Mini eller Micro sett avhengig av mengden av utgangsmaterialet (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. Integriteten av renset RNA prøver ble undersøkt ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer på 260/280 nm. Påvisning av mRNA transkripter ble deretter utført i multipleksede hybridisering reaksjoner ved bruk av NanoString NCounter Analysis System. To forskjellige NCounter genuttrykk CodeSets ble brukt for analyse: GX Menneskelig Cancer Reference Kit bestående av 230 kreftrelaterte gener, og skreddersydde ITESM kodesett som består av 14 PCa-relaterte gener (NanoString Technologies). Datainnsamling og normalisering ble utført ved hjelp av nSolver Analyse programvare versjon 2.0 (NanoString Technologies). Gjennomsnittlig fold endringer (forholdstall, n = 3) av hvert gen ble beregnet ut fra normaliserte data og rangert hjelp av Microsoft Excel. Gener med en fold endring 1.5 ble valgt ut for videre analyse (tabell 1). Generelle definisjoner for hvert gen ble hentet fra GeneCards leksikon webside (www.genecards.org) [18].
Prostasphere selvfornyelse analysen
Prosentandelen av celler i beriket kulturer i stand til å generere nye prostaspheres ble bestemt ved utsåing av cellene ved en densitet på 1×10
3 celler /ml i HPCM-PLUS media. På dag 10 av kultur, kulene ( 100 mikrometer) ble scoret, skilt, og sub-dyrket under de samme betingelsene. Denne prosessen ble gjentatt to ganger for å oppnå 2
nd og 3
rd genererings prostaspheres på dag 20 og 30, respektivt. Sfære formasjon effektivitet (SFE) ble beregnet som antall prostaspheres generert av antall celler seeded, multiplisert med 100. Eksperimenter ble utført i triplikat og gjentatt tre ganger. Påfølgende eksperimenter ble utført ved hjelp av første generasjon sfærer bare
Colony forming celle (KFK) analyser
Opphengs KFK analysene ble utført ved hjelp av StemXVivo metylcellulose konsentrat. (R 1,5). gjennom funksjonelle berikelse analyse
Statistical Analysis
Resultater for kontinuerlige variabler er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (stdDev). Pairwise multiple sammenligninger ble utført ved anvendelse av en enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey HSD-test (* P 0,05). Alle analyser ble utført ved hjelp av JMP versjon 9.0.
Resultater
22Rv1, DU145, LNCaP og PC3 er i stand til å vokse som selvfornyende kuler som kan serielt dyrket in vitro
Tumorsphere dannende evne ble evaluert med en seeding tetthet av 2×10
4 celler /ml i 6-brønnen ultra-lave festeplater som inneholder to hpcm-PLUS ml medium. Alle fire PCA cellelinjer dannet sfæriske kolonier etter dag fire av kultur. Sperre adherente kulturer ble formert samtidig med en maksimal samløpet nivå på 80%. Dag 12 tumorspheres og monolagene (figur 1A) ble dissosiert og analysert for ekspresjon av det CSC-assosierte biomarkører CD133 og CD44. Ekspresjon av CD44 ble påvist heterogent ved høye nivåer i PC3 og DU145 celler, mens minimal til ingen påvisbar ekspresjon ble observert i 22Rv1 og LNCaP-celler (S1A Fig). Fig 1B viser at CD133 ble observert konsekvent på ekstremt lave nivåer ( 0,5%) i alle cellelinjer. Panelet viser også at i motsetning til foreldre kulturer, andelen av CD133
+ hendelser økt betydelig (
p
0,05) i alle prostasphere kulturer av 22Rv1 (0,067% ± 0,058% til 4,267% ± 1,419%), DU145 (0,433% ± 0,252% til 2,433% ± 0,709%), LNCaP (0,033% ± 0,058% til 4,033% ± 1,966%), og PC3 (0,133% ± 0,058% til 4,467% ± 1,358%) -celler . Prostaspheres raskt nådd diametre 100 mikrometer ved dag 12 av kultur (Fig 2A). De 22Rv1 og DU145 cellene dannet kompakt og runde-formet kuler med godt avgrensede kanter, mens LNCaP og spesielt PC3 cellene dannet mer uregelmessige strukturer bestående av større enkeltceller. Sfæren dannende effektivitet (SFE) ble evaluert for første- (dag 10), andre-(dag 20), og tredje- (dag 30) generasjon kuler. SFE alltid økt (
p
0,05) med hver ny generasjon i alle cellelinjer (figur 2B). Interessant, direkte observasjon av PC3 og DU145 celler dyrket i suspensjon avdekket ytterligere spirende fra prostaspheres på dette punktet (S1B fig). Denne observasjonen antyder potensialet dannelsen av forgrening strukturer fra etablerte sfærer.
A) Mikroskopisk undersøkelse av foreldre monolag (ADH) ved siden av prostasphere-beriket (SUS) kulturer. ADH kulturer i DMEM-FBS oppviser karakteristiske epithelial morfologi, og er i nær kontakt med hverandre. SUS kulturer i hpcm-PLUS vise heterogene morfologi, alt fra trange, runde-formet kuler (22Rv1 og DU145) til større mer uregelmessige strukturer (LNCaP og PC3). Bildene er representative for 12 dager gamle enkeltlag og primære sfære kulturer. Scale bar = 200 mikrometer. B) flowcytometrisk analyse av ferske isolert foreldre (ADH) og prostasphere (SUS) celler for identifikasjon av CD133
+ subpopulasjoner. Representative prikkplotter av PE-merket CD133
+ (293C3) celler. Prosentene som vises tilsvarer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
A) Morfologisk karakterisering av primære prostaspheres dyrket i hpcm-PLUS. Alle PCA cellelinjer dannet merkes kuler etter dag fire av kultur. 22Rv1 og DU145 kuler består av mindre og mer tettpakket sammen celler. LNCaP og PC3 cellene ser større og mer løst organisert. Scale bar = 100 mikrometer. B) Sphere dannende effektivitet (SFE) av prostasphere kulturer. PCA-celler ble sådd ut ved en densitet på 1×10
3 celler /ml i 6-brønners ultralave festeplatene i HPCM-PLUS og inkubert i 10 dager. De resulterende prostaspheres kan bli serielt passert in vitro for opptil tre generasjoner (G1-G3). SFE av kuler økt jevnt i alle PCA cellelinjer med hver generasjon. Ingen videre forsterkning ble forsøkt på dette punktet. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, hver i triplikat. Scale bar = 100 mikrometer. (*
p
0,05)
CD133
+ prostasphere celler utvise økt clonogenicity både tilhenger og halvfaste kolonidannende celler (KFK) analyser
kolonidannende effektivitet (CFE) av foreldre kulturene samt prostasphere-avledede celler ble analysert i parallell i halvfast (figur 3A) og adherente (figur 3C) CFC-analyser. CFE verdier for monolags og prostasphere kulturer var tilsvarende analyser, men vi observerte en gjennomgående høyere antall individuelle kolonier i semisolid (Fig 3B) sammenlignet med heft forhold (figur 3D). Alle fire prostasphere-beriket cellelinjer vises høyere clonogenicity i begge analysene i forhold til sine ikke-beriket kolleger (
p
0,05). PC3 celler utstilt høyeste clonogenicity for tilhenger og halvfaste analyser. CFE-verdier var gjennomgående høyere i CD133
+ celler (
p
0,05) sammenlignet med foreldre og usorterte prostasphere celler for alle cellelinjer, med unntak av LNCaP cellelinje. Vi var ikke i stand til å observere en statistisk signifikant forskjell mellom CD133
+ celler og usorterte prostaspheres (
p
0,05) i tilhenger CFC analysen. Men CD133
+ LNCaP celler synes å være mer klonogene enn usorterte prostaspheres ved bruk av suspensjon variant av analysen.
A) Representative mikrografer av henge kolonier fra foreldre (ADH) og CD133
+ celler. B) Halv-harde koloni-dannende celle (CFC) assay. Foreldre (ADH) og prostasphere (SUS) kulturer ble skilt på dag 12 av kultur. CD133
+ celler ble isolert via MACS bruker 293C3 antistoff. 1×10
3 celler fra hver tilstand ble sådd i 35-mm petriskåler med StemXVivo metylcellulose konsentrat blandet med DMEM-FBS eller hpcm-PLUS. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± stdDev. (*
p
0,05). C) Representative mikrografer av heft kolonier fra foreldre (ADH) og CD133
+ celler. D) Heft koloni-dannende celle (CFC) assay. Celler ble behandlet som beskrevet før for halvfast CFC-analysen. Deretter 1×10
3 celler ble sådd i 35-mm petriskåler med DMEM-FBS eller hpcm-PLUS. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± stdDev. (*
p
0,05).
Prostasphere kulturer er mer motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske stoffet Docetaxel
cscs er antatt å være ansvarlig for PCa motstand mot kjemoterapeutiske medikamenter. Vi vurderte basal chemoresistance av foreldremonolagscellene ved å inkubere alle cellelinjer med økende konsentrasjoner av Docetaxel (0,625 til 10 ug /ml) i 24 timer (Figur 4A). Celleviabilitet redusert konsekvent, men 22Rv1 og LNCaP celler utstilt en høyere følsomhet for stoffet. Vi observerte en differensial respons ved 5 og 10 ug /ml Docetaxel; Derfor brukte vi disse konsentrasjonene for nærmere vurdering av chemoresistance av prostaspheres. Chemoresistance til begge konsentrasjoner av Docetaxel økt betraktelig (
p
0,05) fra det som ble observert i foreldrecellelinjer i alle tumorsphere kulturer (figur 4B). Prostasphere-avledede DU145-celler, spesielt, viste den høyeste cellelevedyktighet på begge konsentrasjoner: 85,58% ± 7,32% ved 10 ug /ml, og 91,35% ± 8,74% ved 5 ug /ml. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom CD133-sortert og usortert prostasphere kulturer.
A) Etablering av basal følsomhet av foreldre kulturer til Docetaxel. 1×10
4 celler fra 12-dagers gammel monolagskulturer ble inkubert med 100 ul DMEM-FBS ved en sluttkonsentrasjon på 10, 5, 2,5, 1,25 og 0,625 pg /ml Docetaxel. 22Rv1 og LNCaP celler klynge sammen og viser en høyere følsomhet til stoffet i forhold til DU145 og PC3 celler. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± stdDev. B) Evaluering av chemoresistance av foreldrenes og prostasphere celler. 1×10
4 celler fra heftende (A) og prostasphere (S) kulturer ble inkubert med 100 ul DMEM-FBS eller HPCM-PLUS media, ved en sluttkonsentrasjon på 5 og 10 ug /ml Docetaxel. Prostasphere celler DISPLAY betydelig økt chemoresistance til Docetaxel. Figuren viser andelen av levedyktige celler i forhold til ikke-behandlet kontrollgruppe. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± stdDev (*
p
0,05).
CD133
+ prostasphere celler viser en økt invasiv potensial i forhold til foreldre monolagkulturer in vitro
Avansert PCa har en tendens til å spre seg til ben og lymfeknuter. Derfor, utførte vi en Transwell invasjon analyse for å bestemme den metastatisk potensial av foreldre og anrikede kulturer. Etter inkubasjon i 48 timer, antall celler som invaderte gjennom Transwell innsatsen var betydelig høyere for de prostaspheres enn for foreldre monolagcellene (
p
0,05) (figur 5A). Deretter undersøkte vi videre rollen til CD133
+ -celler i migrasjon av PCA-celler, og følgelig, etablering av metastatiske lesjoner. Den CD133
+ celler i alle cellelinjer var betydelig mer omfattende enn de usorterte prostaspheres (
p
0,05). Interessant, CD133
+ DU145 cellene utstilt høyeste invasiv potensial (416,55 ± 40,161 /felt). Fig 5B viser representative photomicrographs av tilfeldige felt med invaderende celler fra tilhenger, prostasphere, og CD133
+ celler.
A) Transwell invasjon analysen. 1×10
5 foreldre (ADH), prostasphere (SUS), og CD133
+ celler ble sådd i 200 mL serum-free DMEM-F12 uten fenol rødt på Transwell inserts belagt med 50 ul Geltrex LDEV fritt redusert vekstfaktor basalmembran matrix. Celler ble tillatt å invadere gjennom matriksen i 24 timer. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± stdDev. (*
p
0,05). B) Representative bilder av Transwell innsatser viser invadere celler farget med krystallfiolett løsning.
Identifikasjon av overuttrykt gener i prostasphere-beriket kulturer og CD133
+ -celler
Gene uttrykk profilering av kreftvev har potensiale til å forbedre dagens diagnostiske og prognostiske klassifikasjoner, og for å avsløre innsikt i den underliggende patofysiologi CSC. Her ønsket vi å identifisere overuttrykte gener i magnetisk sorterte og usorterte PC3 prostasphere celler, i forhold til foreldre monolagkulturer. Genekspresjon data ble sendt til Gene Expression Omnibus depot fra NCBI og kan nås på GEO hjemmeside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under GSE67248 sjonsnummer. Tabell 1 viser oppregulert transkripsjoner (ratio 1,5) i CD133 + sortert og usortert prostasphere celler (se tabell A i S1 File for hele datasettet). Figur 6A viser den hierarkiske gruppering av de relative brette endringene i 244 genene analysert, i løpet av 12 dagers dyrking. Denne grafisk fremstilling viser hvordan kultur forhold indusere globale endringer i genuttrykk gjennom tiden. Funksjonell merknad clustering av oppregulert gener med tilsvarende biologisk funksjon inkludert: proteiner inneholder spådd glykosyleringsstedene og sekvenser rettet mot dem til sekretoriske vei, membranassosierte proteiner, proteiner som deltar i celle adhesjon og celleoverflatestruktur organisasjon og proteiner med tyrosin kinase aktivitet.
A) Varme kart som viser fold endringer i genuttrykk fra prostaspheres på dag 4 (P2), dag 8 (P3), dag 12 (P4), og isolert CD133
– (P4_N) og CD133
+ (P4_P) fraksjoner i forhold til foreldre kulturer på dag 0. Verdier tilsvarer den log2 transformerte forhold av anordningen (n = 3). Figuren viser oppførselen til 244 gener analysert i hele tids cellene holdes i kultur. B) Gene ontologi (GO) analyse av oppregulert transkripsjoner i CD133
+ celler. GÅ Biologiske prosesser anriket på CD133
+ celler er alle relatert til utviklingsveier (
p product: * 0,01). Kanten bredde reflekterer den relative overlapping mellom nodene (% delte gener). Kanten farge koder antall delte medlemmer mellom hele GO kategorien og brukerdefinert bakgrunn (CodeSets). Sfære størrelse er i forhold til antall av gener knyttet til denne kategorien. C) Molekylære interaksjoner av transkripsjonsregulator ΔNp63α med oppregulert gener oppdaget i CD133
+ celler.
ATM
,
TP63
,
IGFBP3
,
NOTCH1
,
BRCA2
,
IL1A Hotell og
top2
gener er oppregulert i CD133
+ celler og synes å megle nedstrøms aktivering av utviklings molekylære stier. Den ΔNp63α tetramer er vist i midten av figuren som er kjent for fysisk å interagere med disse genene.
