Abstract
Tykktarms krypter er stereotype konstruksjoner med distinkte stamcelle, voksende, og differensierende avdelinger. Kolorektal kreft utlede fra colonic krypten epitel, men i motsetning til dette danner morfologisk disarrayed kjertler. I denne studien undersøkte vi i hvilken grad kolorektal kreft phenocopy colonic krypt arkitektur og således bevare strukturell organisering av normal tarmepitelet. En undergruppe av tykktarm kreft viste krypten-lignende lommer med høy WNT aktivitet og kjernefysisk β-catenin på ledende svulst kanten, ved spredning, og forbedret Cytokeratin 20 uttrykk i de fleste differensiert tumor epithelia av svulsten sentrum. Denne arkitekturen sterkt avhengig av vekstbetingelser, og var fullstendig reproduserbar i mus xenotransplantater av dyrkede primære og tykktarmskreftceller. Full crypt-lignende organisasjon var forbundet med lav svulst klasse og var en uavhengig prognostisk markør for bedre overlevelse i en samling av 221 kolorektal kreft. Våre funn tyder på at full aktivering av bevarte tarm morfogenetiske programmer i tykktarmskreft krever
in vivo
vekstmiljøer. Videre ble crypt-lignende arkitektur knyttet til mindre aggressiv tumorbiologi, og kan være nyttig for å forbedre dagens tykktarmskreft gradering ordninger
Citation. Cernat L, Blaj C, Jackstadt R, Brandl L, Engel J, Hermeking H, et al. (2014) kolorektal kreft Mimic Structural Organisering av Normal Tykktarms krypter. PLoS ONE 9 (8): e104284. doi: 10,1371 /journal.pone.0104284
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 6 april 2014; Godkjent: 07.07.2014; Publisert: 11 august 2014
Copyright: © 2014 Cernat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Støttet av en bevilgning fra Wilhelm Sander-Stiftung (til DH) og European Social Fund-Project 107 /1.5 /S /78702 (til LC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal cancer (CRC) er avledet fra normal tykktarmsslimhinne ved et godt karakterisert, trinnvise akkumulering av mutasjoner som transformere normale epitelceller i tumorceller med malign oppførsel [1]. Normal kolon mukosa blir ganske enkelt arrangeres, i hovedsak som et ark av epitelceller med infoldings danner stereotype krypter [2]. Hver krypten inneholder forskjellige funksjonelle lommer med stamceller ved krypten basen, med ansvar for kontinuerlig fornyelse av alderen epitelceller, en voksende transittforsterkende sone som strekker seg til midten av krypten, og mest modne epitelceller mot krypten apex [3]. Eksperimentelle data, hovedsakelig avledet fra murine tynntarms krypter, tyder på høy kanonisk WNT signaleringsaktivitet innenfor stamcellelinjen ved krypten basen [4], [5], mens modne celler ved krypten apex er kjennetegnet ved ekspresjon av differensieringsmarkører, slik som Cytokeratin 20 (CK20) [6].
i motsetning til vanlig colonic slimhinne, den strukturelle organisering av CRC er mye mindre godt forstått. CRC danne tumormasser i stedet for ark av celler, med varierende grad av morfologisk disarrayed epiteliale kjertler [7]. Men disse svulstene ikke ut til å være helt uorganisert. kan observeres En gradient mellom mindre differensierte tumorceller på den fremre kant svulst, og flere kjertel differensierte celler i tumoren sentrum i de fleste CRC [8], [9]. I tillegg tumorceller på den fremre kant tumor vanligvis uttrykker sterke kjerne β-catenin, noe som indikerer høy WNT signaleringsaktivitet, og har vært omstridt for å representere en progenitor-celle populasjon av operasjonelt definert tykktarmskreft stamceller [10], [11]. Tvert imot, ble ekspresjon av CK20 foreslått å merke mer differensierte tykktarmskreftceller, siden dets ekspresjon var gjensidig utelukkende med antatte tarmkreftstamcellemarkører [11], [12]. Sammen er disse dataene antyder en viss grad av strukturell organisasjon innen CRC, med kreft stamceller ved ledende svulst kanten og differensiering mot svulsten sentrum.
Vurderer disse funnene og kjente avdelinger innenfor tarm krypter, vi her undersøkt, for å hvilken grad CRC phenocopy normal colonic krypter. Vi kategoriserer graden av crypt-lignende arkitektur i en kolorektal kreft sak samling med langsiktige oppfølgingsdata og vise at
in vitro Hotell og
in vivo
vekstvilkår sterkt påvirke dette strukturelt .
Materialer og metoder
Histologi og Immunohistochemistry
Formalin fast, parafin innebygd normal menneskelig colonic slimhinner, primær CRC vev, xenografttumorer og Matrigel innebygd tumorcelleklumper ble kuttet til 5 um seksjoner, deparaffinized, og antigener ble hentet i TRS6 (Dako Cytomation) i 20 min i en mikrobølgeovn. Heft kulturer av Caco2 og SW1222 celler ble dyrket på dekkglass, fast i formalin, og permeabilized i 2% TritonX-100. Lysbilder eller dekkglass ble deretter inkubert sekvensielt med mus anti-β-catenin (BD Transduction Laboratories, 1:200), kanin anti-Ki67 (Cell Signaling, 1:200) og geit anti-CK20 (Santa Cruz Biotechnology, 01:50 ) i 1 time hver ved romtemperatur, vasket med PBS, og deretter med FITC-konjugert esel anti-geit (Jackson Immunoresearch, 1:200), AlexaFluor 555 konjugert geit anti-mus, og AlexaFluor 405-konjugert geit-anti-kanin (Invitrogen; 1:500). For visualisering av kjernefysisk β-catenin i normale colonic krypter, ble kjerner kontra med DAPI (Vector Laboratories). Confocal fluorescens bilder ble tatt på en LSM 700 laserskanning mikroskop med ZEN-programvare (Carl Zeiss). For konvensjonelle og dobbel farging, prediluted mus anti-β-catenin (Ventana Medical Systems) og /eller mus anti-CK20 (Progen; 1:200) ble brukt, og farging ble utført på en Ventana Benchmark XT Autostainer med Ultra Universal DAB og alkaliske fosfatase detection kits (Ventana Medical Systems). Isotype-kontroller ble inkludert for alle antigener.
Cell kultur og mus xenografter
Caco2 celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection og SW1222 celler ble hentet fra Ludwig Institute for Cancer Research (Ny York, USA). Adherente cellekulturer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Biochrom), supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 1 x Penicillin-Streptomycin. Sfæroide kulturer ble dyrket i StemPro hESC SFM medium i nærvær av 20 ng /ml EGF og 10 ng /ml bFGF (Life Technologies) i ultra-lav feste kolber (Corning). Vital vev av en sporadisk primær colon adenokarsinom ble ervervet gjennom Stiftung menneskelig vev Cell Research (HTCR, München, Tyskland), deles opp i enkeltcellesuspensjoner ved bruk av kollagenase IV (Worthington Biomedical) og DNase I (Sigma-Aldrich), som tidligere beskrevet [10], og utvidet i sfæroide kulturer. For videre analyser, ble kuler av cellelinjer og primære kreftceller høstet ved sentrifugering ved 200 g, resuspendert i Matrigel, fast i paraformaldehyde, og deretter klemt mellom HistoGel lag (ThermoScientific) for parafin innebygging. For xenograft vekst, 10
6-celler fra adherente cellekulturer eller 10
5 sfæroide-avledede primær kolon kreftceller ble suspendert i 100 pl av en 1:01 blanding av PBS og vekstfaktor-utarmet Matrigel (BD Bioscience) før subkutan injeksjon i 6-8 uker gamle NOD /SCID (NOD.CB17-Prkdc
SCID, The Jackson Laboratory) mus. Dyrene ble huset i patogenfrie mikro-isolator bur og avlivet når xenotransplantater nådde en diameter på 1 cm. Xenografttumorer deretter ble fjernet, formalinfiksert og parafininnebygd. Tre uavhengige xenotransplantater ble underkastet ytterligere undersøkelse for hver cellelinje eller primær tumor. Eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av dyr ble gjennomgått og godkjent av Regierung von Oberbayern.
CRC prøvetaking og statistikk
CRC prøver fra pasienter som gjennomgikk forsettlig kurativ kirurgisk reseksjon mellom 1994 og 2006 på LMU ble trukket fra arkivene til institutt for patologi. Oppfølgingsdata ble registrert av München Kreftregisteret. Prøver og data ble anonymisert, og behovet for samtykke ble frafalt av institusjonelle etiske komité for Det medisinske fakultet i LMU. Inklusjonskriteriene ble lokalisert kolorektal adenokarsinomer med fravær av nodal (N0) eller fjernmetastaser (M0) ved diagnosetidspunktet (UICC stadium I og II). Tumorvev ble montert i microarray (TMA) med 6-representant på 1 mm kjerner, inkludert kreft kanter og kreftsentre i hvert enkelt tilfelle. Den siste samlingen besto av 221 CRC tilfeller som i 41 tilfeller (19%) av pasientene hadde dødd av deres svulst i oppfølgingsperioden. Overlevelsesdata ble sensurert da saksoppfølging ble avviklet eller pasienter døde av andre enn CRC grunner. Case egenskaper er oppsummert i tabell 1. TMA glir deretter ble utsatt for enkle og doble stainings for β-catenin og CK20, som beskrevet ovenfor. Hele vevssnitt av enkeltsaker med heterogen β-catenin og CK20 distribusjon ble brukt for trippel immun fluorescens analyser. Kreft spesifikk overlevelse ble analysert av Kaplan-Meier metoden og grupper ble sammenlignet med log-rank test. Statistikken ble beregnet ved hjelp av SPSS (IBM).
Resultater
Crypt-lignende funksjonelle rom og aksedannelse i endetarmskreft
For å visualisere ulike funksjonelle avdelinger innenfor normal colonic krypter og CRC, etablerte vi trippel immun fluorescens stainings for β-catenin, proliferation- relatert Ki-67 antigen (Ki67) og Cytokeratin 20 (CK20). Som forventet, konfokal avbildning av normal colonic krypter indikert WNT aktive avdelinger med atom uttrykk for β-catenin i krypten base, en Ki67 uttrykker transitt forsterke sonen av prolifererende epiteliale stamfedre, og mest differensierte epitelceller uttrykker CK20 mot krypter «toppunktene (Figur 1A). Spesielt, visualisering av svak, men tydelig kjernefysisk β-catenin i krypten basen kreves høy forstørrelse og svak kjernekraft kontra (figur 1A, Figur S1). Vi deretter underkastet primær CRC for den samme trippel farging protokoll. I likhet med tidligere funn [8], [9], sterke kjerne ekspresjon av β-catenin ble begrenset til tumorceller ved den fremre kant tumor og inkludert morfologisk udifferensierte tykktarmskreftceller infiltrerende omgivende stromale vev (figur 1B). Interessant, og tvert imot for å atom β-catenin, CK20 farging var mest intens i mer sentralt og kjertel differensiert tumor epitel, nabo tumor nekrose (figur 1B). Ki67 ble funnet mellom disse sonene og ble redusert i tumorceller med sterk CK20 uttrykk (figur 1B). Disse funnene indikerer at, til tross for disarrayed kjertel formasjon, tykktarm kreft bevare en viss grad av strukturelt og aksedannelse funnet i normale colonic krypter.
Triple immunfarging for β-catenin (βCat), Ki67 og CK20. (A) Tykktarms krypter viser kjernefysisk β-catenin uttrykk på basen deres, Ki67 strekker seg til midten av krypten, og CK20 på toppen. Visualisering av kjernefysisk β-catenin kreves kontra med DAPI og høy forstørrelse (
venstre panel innfelt
). Røde og blå søylene avgrense krypten deler med og uten kjernefysisk β-catenin, henholdsvis. (B) kolorektal kreft vise en lignende organisasjon med kjernefysisk β-catenin på svulsten kanten (
pilspisser
), CK20 uttrykk i svulsten sentrum (
piler
), og Ki67 i mellom.
Scale barer
, 100 mikrometer.
xenograft modeller av tykktarm kreft gjengir hele spekteret av crypt-lignende organisasjon
Deretter analyserte vi en primær tykktarmskreft og tykktarm kreft cellelinjer under forskjellige vekstbetingelser
in vitro Hotell og
in vivo
. Heft
in vitro
cellekulturer fra SW1222 og Caco2 tykktarmskreft cellelinjer avdekket noen grad av tumorceller heterogenitet for kjernefysisk β-catenin, Ki67 og CK20 som var mer fremtredende i lav tetthet enn i løpende kulturer (Tall 2aeller D). Lav tetthet SW1222 kulturer også utstilt noen rudimentær formasjon med litt forbedret CK20 uttrykk og redusert Ki67 spredning innenfor koloni sentre, og sterkere kjernefysisk β-catenin flekker på kolonien kanten (Figur 2A) sentripetal aksen. I Caco2 celler, differensial uttrykk for CK20 og kjernefysisk β-catenin dukket opp mer tilfeldig fordelt (Figur 2C). For å vurdere om tredimensjonal veksten ville gi høyere grad av strukturelt og tumorcelle heterogenitet
in vitro
, dyrket vi begge cellelinjer og primære tykktarm kreft celler som ikke-heftende kuler. I likhet med våre funn i tilhenger kulturer, observerte vi noen svulst celle heterogenitet for alle tre merkene (Tall 2E-G). Men selv om primærtykktarmskreft sfærer viste dannelse svak sentripetal akse med forbedret sentral CK20 farging (figur 2G), ingen full strukturell organisasjon, som vi hadde funnet i primærtykktarmskreft vev, ble observert. Vi deretter injisert begge cellelinjer og primære tykktarm kreft celler i immun kompromittert mus for subkutan tumordannelse
in vivo
. Tvert til vår
in vitro
funn, disse svulstene dannet kjertelstrukturer med full grad av tumorcelle heterogenitet og distinkte atom β-catenin, Ki67 og CK20 positive avdelinger (Tall 2H-J), etterligne de som finnes i primære CRC, og minner om vanlig kolon krypten arkitektur. Sammen er disse funn indikerte at tredimensjonal vekst og omgivende vev stromal er nødvendig for å eksponere hele tumorcelle heterogenitet og aksen dannelse i CRC.
Triple immunfarging viser mangel på full strukturell organisasjon i adherente vevkulturer av (A) lav tetthet og (B) konfluent SW1222, og (C) med lav tetthet og (D) konfluente Caco2 tykktarmskreftceller, så vel som i sfæroide kulturer av (E) SW1222, (F) Caco2, og (G) primær kolonkreftceller . Tvert imot, subkutane transplantater av (H) SW1222, (I) Caco2, og (J) primær kolonkreftceller danner kjertlene med organisert ekspresjon av kjernefysisk β-catenin ved tumor kanten (
pilspisser
) og CK20 uttrykk i svulsten center (
piler
).
Scale barer
, 100 mikrometer.
Klassifisering og kliniske relevansen av crypt-lignende organisasjon i kolorektal kreft
For å bestemme frekvensen av crypt-lignende organisasjon i CRC brukte vi et tilfelle samling av 221 primærsvulster og brukt dobbel immunfarging for β-catenin og CK20, merking begge ytterpunktene av normal colonic krypten avdelinger. Analyser av disse tilfellene viste 5 forskjellige typer tykktarm kreft: Den største gruppen (type A) viste organisert uttrykk for kjernefysisk β-catenin på ledende svulst kanten og forbedrede CK20 innen svulsten sentrum (figur 3). Av notatet men når den behandler saker av denne typen på seriesnitt, observerte vi ytterligere forsterket CK20 uttrykk i de fleste infiltrerende tumorceller i ledende svulst kant, overlappende med kjernefysisk β-catenin i de fleste av disse tilfellene (figur S2). De andre tumorer manglet denne organisasjon til en viss grad (figur 3), enten ved fravær av kjernefysisk β-catenin (type B), fravær av forbedret CK20 i tumoren sentrum (type C), fravær av redusert atom β-catenin i tumoren center (type D), eller fravær av både kjernefysisk β-catenin og CK20 uttrykk (type E). Vi deretter undersøkt disse typer for assosiasjoner med tumorspesifikk overlevelse. Interessant, Kaplan-Meier plott avslørt beste resultatet for CRC med fullt crypt-lignende strukturell organisasjon, basert på kjernefysisk β-catenin og CK20 uttrykk (type A) som var betydelig bedre, når statistisk testet mot alle andre typer kombinert (figur 4). Vi deretter undersøkt type A svulster for assosiasjoner med andre kliniske variabler og fant en signifikant sammenheng med lav svulst klasse, mens det var ingen signifikant sammenheng med andre variabler som alder, kjønn og T kategori (tabell 1). Til slutt, når testing type A svulster mot andre for å overleve prediksjon i multivariate analyser, full strukturelt viste seg å være en uavhengig prognostisk markør for bedre kreftspesifikk overlevelse (tabell 2). Disse funnene viser at CRC ligne krypten liknende lommer og aksen dannelse i varierende grad og implisere at høy strukturell likhet med vanlige kryptene i kolon kan være forbundet med mindre aggressiv oppførsel tumor.
Dobbeltimmunfarging for β-catenin (
brun
) og CK20 (
rød
). (Type A) Full strukturell organisasjon med kjernefysisk β-catenin på svulsten kanten (
pilspissen
) og CK20 innen svulsten sentrum (
pil
). (Type B) Fravær av kjernefysisk β-catenin. (Type C) Fravær av sentrale CK20. (Type D) Fravær av redusert kjernefysisk β-catenin i svulsten sentrum. (Type E) Fravær av både kjernefysisk β-catenin og CK20. Frekvensen av disse typene er gitt i tabellen.
(A) Kaplan-Meier-plott for de forskjellige typer av kolorektal kreft, som angitt ved bokstaver på kurvene. (B) Type A pasienter med kolorektal kreft (
øvre kurven
) viser signifikant (log-rank test) bedre overlevelse sammenlignet med andre typer (
lavere kurve
). Forholdstall på kurvene angir antall hendelser over antall pasienter per gruppe.
Diskusjoner
Her viser vi at CRC phenocopy normal colonic krypten arkitektur. I motsetning til vanlige krypter, disse svulstene vokser invasiv og danne morfologisk disarrayed kjertler [7]. Imidlertid kan ulike avdelinger med høy WNT aktivitet på ledende svulst kanten, ved spredning, og forbedret CK20 uttrykk mot svulsten sentrum bli identifisert. Siden normal colonic krypter har en kjent WNT drevet stamcelle på basen deres, modning i epitelceller med sterk CK20 uttrykk på toppen [4] – [6], våre funn støtter ideen om tykktarm kreft etterligne disse funksjonelle avdelinger, med kolon kreft stamceller ved den ledende kant tumor, og sentripetal tumorcelledifferensiering, slik som tidligere ble antatt [13]. Men våre data indikerer også betydelige avvik til normal colonic krypten arkitektur, siden ikke alle CRC viste hele spekteret av crypt-lignende compartmentalization. Videre CRC med merkbar avdelinger viste ofte forsterket CK20 ikke bare i sentrale kreft områder, men i tillegg til ledende svulst kant, samtidig med sterke kjerne β-catenin og høy WNT aktivitet. Selv om disse resultatene impliserer at morfogenetiske programmer av intestinale epitelceller fremdeles er aktiv i kolorektal kreft i en viss grad, markører for terminal differensiering i normal tarmen trenger ikke nødvendigvis å være begrenset til fullt differensierte tumorceller av tarm neoplasmer.
Sammenligning annen kultur og vekstforhold for tykktarmskreftceller, observerte vi fullt utviklede og compartmentalized kjertelstrukturer i
in vivo
xenografttumorer bare. Gjentagelse av strukturer, etterligne normal colonic krypt arkitektur og full gradient dannelse av minst og mest differensierte tykktarmskreftceller, kan derfor kreve signalering fra en tumor mikromiljøet [8], [14], som mangler i standard kultursystemer. Disse funnene har viktige implikasjoner for studier som fokuserer på spesifikke tumorcelle subpopulasjoner, siden svulst celle sammensetning i vanlig eller sfæroide kulturer kanskje ikke tilstrekkelig gjenspeiler situasjonen i primære svulster. Interessant men når vokst som xenografttumorer, selv etablerte tykktarmskreft cellelinjer dannet fullt utviklede krypten lignende strukturer og compartmentalization, ligner primære tykktarm kreft. Dette tyder på at, til tross for noen forventede genetiske endringer i passert cellelinjer [15], ved bruk av koloncancer cellelinje xenotransplantater ikke kan være dårligere enn ved bruk av primær kolonkreft for studier på tumorcellepopulasjoner, som tykktarmskreft stamceller [12] [16]. I denne sammenheng vekstvilkår
in vivo
kan være mer relevant enn kilden til tykktarmskreftcelle, enten avledet fra etablerte kulturer eller primære svulster.
Når du ser på assosiasjoner til kliniske parametre, vi knyttet crypt-lignende strukturelle organisering av CRC til bedret overlevelse og lav svulst klasse. Mens prognose av disse svulstene best kan estimeres ved oppsetningen, som beskriver omfanget av sykdommen [17], og histopatologisk tumor gradering uavhengig vært knyttet til sykdom utfall og gjenspeiler den totale grad av tumor-celledifferensiering [18]. Flere graderingssystemer basert på ulike sider av tumor morfologi er blitt foreslått, men på grunn av dårlig reproduserbarhet, en forenklet to-lags system, bare med tanke kjertel dannelse, er for tiden foretrekkes, og klassifiserer disse tumorene til lave og høye klasse neoplasmer [19] . Selv om dette karakterskala er allment akseptert og ansett som en konsekvent prognostisk faktor ved College of American Patologer, betyr det ikke integrere eksistens og distribusjon av forskjellige tumorcellepopulasjoner som kan påvirke prognosen. På den annen side er nylig frem tilnærminger for å vurdere CRC prognose, slik som stamcelle markør uttrykk [20], [21] eller mikroRNA profilerings [22], så langt enten mangler generell aksept eller har forbeholdet av å være kostbart og teknisk krevende. Siden i vår studie, crypt-lignende organisasjon tjente godt i å forutsi sykdom utfallet, foreslår vi at denne tilnærmingen kan integrere morfologiske aspekter av kjertel formasjon med markører som indikerer funksjonelle kreft avdelinger. P-catenin og CK20 uttrykket kan robust vurderes i tykktarm kreft prøver og integrering av disse parametrene i rutinediagnostikk kan derfor forbedre histopatologiske tykktarmskreft gradering. I tillegg til disse betraktninger, kan våre funn også forklare tidligere inkonsistente data om kliniske korrelater med atom β-catenin [23], [24], tumorcelle-proliferasjon [25], [26], og CK20 ekspresjon i tykktarmskreft [27] , [28]. Hvis disse markørene angir funksjonelle og strukturelle avdelinger innenfor disse svulstene, er det mulig at rommet organisasjonen er mer relevant for tumorbiologi og gjenspeiles i klinisk utfall enn enkel rommet størrelse.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Økt WNT-aktivitet på basis av normale colonic krypter. Mens β-catenin etiketter epiteliale cellemembraner som en del av adherens veikryss, høy forstørrelse indikere ytterligere kjernefysisk β-catenin uttrykk ved krypten base (
svart pilspisser
). Mangel på atom uttrykk med dominans av blå kontra er sett i epitelceller over krypten base (
blå pilspisser
). .
Venstre panel
viser høyere forstørrelse av området eske i
høyre panel
doi: 10,1371 /journal.pone.0104284.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
CK20 uttrykk er ikke begrenset til tumor sentrum av type A kolorektal kreft. Seriesnitt viser, i tillegg til økt CK20 farging i tumoren sentrum (
piler
), forbedret farging for CK20 på svulsten kant, overlappende med atom β-catenin (
pilspisser
). Dette mønsteret ble funnet i 61% av type A kolorektal kreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104284.s002 plakater (TIF)
Takk
Vi er takknemlige for A. Sendelhofert, A. Schäfer og M. Melz for eksperimentell og guidede turer og takke Stiftung menneskelig vev og Cell Research (HTCR) for å gi tykktarmskreft vev.
