Abstract
Studier har antydet en mulig sammenheng mellom den nylig identifiserte E3 ubiquitin ligase ringfingeren protein 146 (RNF146) og tumor utvikling. Men inntil nå, studier på RNF146 har vært begrenset til poly (ADP-ribosyl) asjon og ubiquitin ligation, mens rollen som RNF146 i tumorbiologi har sjelden blitt rapportert. I denne studien, ble rollen som RNF146 i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) undersøkt. Resultatene viste at ekspresjon av RNF146 ble øket i kliniske prøver lungekreft og cellelinjer. RNF146 uttrykk korrelert med tumorstørrelse, differensiering nivå, lymfatisk metastaser, pTNM iscenesettelse, og prognosen for pasienter i stadium I. RNF146 uttrykket er negativt korrelert med Axin uttrykk, men positivt korrelert med atom uttrykk for β-catenin i NSCLC vev. RNF146 downregulated uttrykk for Axin i lungekreftcellelinjer og indusert uttrykk og kjernekraft distribusjon av β-catenin. Overekspresjon av RNF146 i NSCLC cellelinjer økte nivåer av cyclinD1, cyclinE, og CDK4, fremmet cellesyklus G
0 /G
1-S overganger, og regulert celleproliferasjon. Overekspresjon av RNF146 førte til oppregulert nivåer av matriksmetalloproteinaser 2 og 7 og forbedret lungekreft celle invasivitet, hendelser som ble formidlet av den klassiske Wnt /β-catenin signalveien. Oppsummert dataene i denne studien tyder på at RNF146 regulert utvikling og progresjon av NSCLC ved å styrke cellevekst, invasjon, og overlevelse, noe som tyder på at RNF146 kan være en potensiell behandling mål i NSCLC
Citation. Gao Y, Song C, Hui L, Li Cy, Wang J, Tian Y, et al. (2014) Overuttrykte
RNF146
i ikke-småcellet lungekreft Forbedrer spredning og invasjon av svulster gjennom Wnt /β-catenin signalveien. PLoS ONE 9 (1): e85377. doi: 10,1371 /journal.pone.0085377
Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 05.09.2013; Godkjent: 26 november 2013; Publisert: 14 januar 2014
Copyright: © 2014 Gao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science Foundation National of China (nr 30972967 og 30973502), Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning (nr 20092104110018), program for Liaoning gode talenter i University og Liaoning Provincial Science and Technology planprogram (nr 2012225072). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
E3 ubiquitin ligaser spiller viktige roller i regulering av cellefunksjoner inkludert spredning, cellesyklus arrest og apoptose. De kan også ha tilleggsfunksjoner som avhenger av identiteten deres underlag. For eksempel, hvis en E3 ubiquitin ligase rettet mot et onkogen for degradering, det kan betraktes som en tumor suppressor. Tilsvarende, hvis en E3 uniquitin ligase degraderer en tumor suppressor protein, kan det betraktes som et onkogen. Mange proteiner som inneholder RING-finger-domener har ubiquitin ligase aktivitet, noen som deltar i tumorigenese og tumormetastase. Den nylig identifiserte E3 ubiquitin ligase ringfingeren protein 146 (RNF146) samhandler med poly (ADP-ribose) (PAR) gjennom en PAR-bindende motiv i Trp-Trp-Glu (WWE) domene.
RNF146
genet ligger på menneskelig kromosom 6q22, 33 [1]. RNF146 har nervecellene aktivitet på grunn av sin hemming av Parthanatos via binding med PAR [2]. RNF146 kan lette DNA-reparasjon mot celledød indusert av DNA-skadende midler eller γ-bestråling [3]. Som svar på cellulær skade, RNF146 translocates til kjernen og forbedrer ubiquitinering og nedbrytning av forskjellige nukleoproteiner som deltar i DNA-skade reparasjon. I tillegg, som en poly (ADP-ribosyl) asjon (PARsylation) -rettet E3 ubiquitin ligase, regulerer RNF146 den Tankyrase avhengig nedbrytning av Axin og positivt regulerer Wnt signalveien [1].
Wnt signal veien er svært aktive i lungekreftceller, som fører til metastase og proliferasjon av disse cellene [4]. Wnt signalisering kan bli abnormt aktiveres ved hjelp av forskjellige mekanismer, og en hovedfunksjon er å inhibere proteolyse av β-catenin, noe som er kontrollert av fosforylering [5]. Gratis β-catenin kan gå inn i kjernen og aktivere målgener av Wnt. Steady-state nivåer av Axin er svært viktig, da dette stillas protein initierer dannelsen av β-catenin degradering kompleks. Forskere har vist at overføringen av PAR til rester av Axin katalysert av Tankyrase fører til PARsylation av Axin [1], [6]. RNF146 deltar i nedbrytningen av PARsylated Axin gjennom sin PAR-bindende motiv. Denne interaksjonen fører til ødeleggelse av den β-catenin degradering kompleks, aggregering av intracellulær β-catenin, og økt signalisering gjennom Wnt sti [1].
Til tross for mange studier på RNF146, den nøyaktige rolle i tumorgenese fortsatt uklart . I denne studien, ble rollene til RNF146 i lungekreft undersøkt.
Materialer og metoder
NSCLC vevsprøver
Primær NSCLC prøver og kontroll vev ble samlet inn fra 133 pasienter . Normal lunge Prøver ble tatt fra lungevev mer enn 5 cm fra kreft reseksjon området. Prosedyrer fant sted på den fjerde Affiliated Hospital of China Medical University. Pasientene mottok ikke noen stråling eller kjemoterapi før operasjonen. NSCLC iscenesettelse var basert på TNM klassifisering av ondartede svulster, Seventh Edition [7]. Overlevelsestiden ble beregnet fra betjenings dag til død via evaluering av tilbakefall og metastasering eller inntil den siste oppfølging dato. Friske prøver ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. For forsøk med menneskelig vev, ble godkjenning innhentet fra institusjonelle gjennomgang komiteen i Kina Medical University. Skriftlig informert samtykke ble gitt i henhold til Helsinkideklarasjonen.
Antistoffer og reagenser
kanin anti-human RNF146 polyklonale antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge Science Park). Anti-Axin og anti-β-catenin antistoffer ble kjøpt fra BD Transduksjon Laboratories (San Jose, CA, USA). Anti-CyclinA, anti-CyclinB, anti-CyclinD1, og anti-PRB antistoffer var fra Cell Signaling Technology, Inc. (Boston, MA, USA). Anti-CDK4, Anti-CDK6, anti-TIMP-1, Anti-CyclinE, siAxin, siβ-catenin, og siTCF4 var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mot RhoA, RHOB, RhoC, og Rock1 var fra Proteintech (Chicago, IL 60612, USA). Antistoffer mot CDK2, P21, matriksmetalloproteinase 2 (MMP2), MMP7, og MMP9 var fra NeoMarkers (Palo Alto, California, USA). Anti-P27 og anti-P53 var fra Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, USA). De rekombinante overekspresjon plasmider pEX4-hRNF146 og pGPHI-shhRNF146 og kontroll tomme plasmider ble konstruert ved GenePharma (Shanghai, Kina). Immunhistokjemisk sekundære antistoff kit ble kjøpt fra Dako (København, Danmark).
Cellelinjer og cellekultur
Den normale bronkial epitelcellelinje HBE, den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer A549 og H1299 var kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De menneskelige NSCLC cellelinjer LK2, LH7, LTE, og SPC ble kjøpt fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. Cellelinjer ble dyrket i Kaighn s Modifikasjon av Hams F-12 medium, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 eller Dulbeccos modifiserte Eagle’s-F12-medium med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 100 enheter /ml penicillin og 100 enheter /ml streptomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA) ved 37 ° C med 5% CO
2.
immunhistokjemisk farging
Parafin seksjoner med en tykkelse av 4 um ble fremstilt og immunhistokjemisk farget med seg, som beskrevet tidligere [8] – [9]. Parafin prøver ble inkubert med anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:200), og anti-β-catenin (1:200) antistoff ved 4 ° C over natten. PBS-ruges prøver ble brukt som negative kontroller.
To patologi leger vurderte de farge resultater på en semikvantitativ skala. Fem høy forstørrelse feltene ble tilfeldig valgt fra hver seksjon, og 100 kreftceller i hvert felt ble talt å vurdere intensiteten og omfanget av RNF146 farging. Et negativt resultat ble gitt en score fra 0 (ingen flekker), svakt gule flekker ble registrert som en 1, gul ble scoret som en to, og dype brune flekker ble registrert som et 3. Prosent score ble tildelt som følger: 5 % 0; 5-25%, en; 26-50%, 2; 51-75%, 3; ≥75%, 4. To uavhengige skårer ble multiplisert sammen for å få pasientens farge koeffisient, som ble kategorisert som «low uttrykket» for fargelegging koeffisienten 4 og «high uttrykk» for fargelegging koeffisient ≥4. Axin og β-catenin ble bedømt som tidligere beskrevet [8] -. [9]
Cell Transfeksjon
Cellene ble sådd ut på 24-brønners plater ved tilnærmet 50% konfluens og transfektert med plasmid eller siRNA 24 timer senere. Transfeksjon av lungekreftcellelinjer A549 og LTE ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. For kotransfeksjonseksperimenter, 1 til 1,5 ug ko-transfektert eller tom vektor og 45 pmol siRNA ble tilsatt til blandingen transfeksjon. Etter 5 timer ved 37 ° C og 5% CO
2, ble fullstendig medium tilsatt til blandingen transfeksjon. Transfeksjon effektivitet ble bestemt av Western blot.
RT-PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol (Invitrogen) i henhold til instruksjonene i TAKARA RNA PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) . GAPDH uttrykk fungerte som den interne kontrollen. Primersekvensene var: RNF146: frem: 5′-GGACGTCGCAGGAAGATTAAG-3 «og omvendt: 5′-CAATGGAGGTGTCTGGTGCT-3′; Axin: fremover: 5»-GACTTGCTGGACTTCTGGTT-3 «og omvendt: 5′-TGTACTTTCGGTAGATGGCT-3′; P-catenin: forover: 5»-CTAAACAGGAAGGGATGGAAG-3 «og omvendt: 5′-ACAGATGGCAGGCTCAGTGAT-3′; GAPDH: fremover: 5»-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3 «og omvendt: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3». PCR-produkter for RNF146 (376 bp), Axin (109 bp), β-catenin (221 bp), og GAPDH (153 bp) ble forsterket med 30 PCR-sykluser.
Western Blot
Celler ble lysert i buffer inneholdende 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotinin og 1 mM PMSF. Totalt protein ble høstet, og 60 ug ble separert ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Proteiner på PVDF-membraner ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbufret saltvann med Tween (PBST), inkubert med primært antistoff ved 4 ° C over natten, og deretter inkubert med sekundære antistoffer ved romtemperatur i 2 timer. Membraner ble utviklet med forbedret kjemisk væske (ECL) (Thermo Fisher Scientific), og resultatene ble registrert ved hjelp av et Bioimaging system (UVP Inc., Upland, CA, USA). Protein uttrykk nivåer ble evaluert ved bruk av β-actin som en lasting kontroll.
immunfluorescens Farging
Celler dyrket på glass dekkglass ble fiksert med 4% paraformaldehyde og behandlet med 0,2% Triton X-100. Etter vasking med PBS ble cellene blokkert med ikkeimmunisert dyreserum ved 37 ° C i 30 minutter, og deretter inkubert med primære antistoffer anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:100), og anti-β-catenin (1:100) ved 4 ° C over natten. Negative og positive kontroller ble inkludert i alle forsøk. Celler ble inkubert med FITC eller TRITC merkede sekundære antistoffer (1:100, Chemicon, USA), ved 37 ° C i 30 minutter. Etter vasking med PBS, ble cellene inkubert med 0,1% 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen) ved 37 ° C i 10 minutter. Cellene ble vasket med PBS og observert under et fluorescens mikroskop.
MTT-analysen
Transfekterte celler og kontrollceller ble platet ut på 96-brønners plater ved 10
3-celler per brønn og dyrket i 24 timer. Celleproliferasjon ble detektert med celletelling leder-8-løsning (Dojindo, Gaithersburg, MD) i henhold til produsentens instruksjoner. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay ble gjentatt i 4 påfølgende dager. optiske tetthetsverdier ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Spectra Thermo, Männedorf, Sveits) ved en absorbans på 550 nm.
sårhelende Assay
Hver brønn i en 6-brønns plate ble podet med 5 × 10
5 celler, dyrket i 24 timer, og riper med en spydspiss. Cellene ble vasket med PBS, og dyrket i serumfritt medium ved 37 ° C og 5% CO
2. Prøver ble høstet og fotografier ble tatt ved 0, 6, 12 og 24 timer. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger og gjennomsnittsverdiene ble beregnet.
Transwell
Cellesuspensjoner av 100 ul inneholdende 2,5 x 10
6 celler /ml ble tilsatt til det øvre kammer av en transwell innsats, og 600 ul medium inneholdende 10% føtalt bovint serum ble plassert i det nedre kammer. A-polykarbonat mikroporøs membran med en diameter på 8 um adskilt øvre og nedre kammer. Celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 til 6 timer. Etter vasking med PBS ble cellene fiksert med metanol ved romtemperatur i 15 minutter. Til slutt ble de behandlede celler farget med hematoksylin, fotografier ble tatt, og fargede cellene ble tellet. For å måle invasiv kapasiteten av celler, på forhånd avkjølt medium uten serum og Matrigel (BD Biosciences, USA) ble blandet i et volumforhold på 1:07, og ble tilsatt til det øvre kammer. Volumet av blandingen væsken var 100 ul. Cellene ble behandlet i 3 timer ved værelsestemperatur, og resultatene ble oppnådd etter at cellene ble dyrket i 24 timer.
Cell Cycle Assay
Celler ble sådd ut ved 5 x 10
6 celler per 6 cm kultur fatet, dyrket i 12 timer, og transfekterte. Celler ble synkronisert ved serum sult i 20 timer. Celler ble opprettholdt i medium inneholdende 10% serum i 24 timer. Celler ble høstet og fiksert i kald 70% etanol. Etter vasking med PBS, ble cellene inkubert med 0,1 mg /ml RNaseA (Roche Indianapolis, IN) ved 37 ° C i 30 minutter og behandlet med 5 mg /ml propidiumjodid i 30 minutter. Til slutt ble de behandlede cellene analysert ved flowcytometri.
Statistical Analysis
Databaser ble satt opp ved hjelp av Excel. Dataanalyse ble utført ved bruk av SPSS17.0. Relasjoner mellom uttrykk for RNF146, Axin, β-catenin, og kliniske og patologiske faktorer ble vurdert av
χ
2
test og Fisher test. Kaplan-Meier overlevelseskurver og Log-rank ble brukt til å oppdage og vurdere forskjeller. Andre data ble sammenlignet med
t
-test. Data fra tre uavhengige eksperimenter ble vist som
± s
. En
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
RNF146 Overuttrykte i NSCLC
For å undersøke uttrykket av RNF146 i NSCLC, 20 sammen. NSCLC og ikke-kreftceller vevsprøver ble oppsamlet, og RT-PCR og Western blot ble anvendt for å analysere RNF146 mRNA og protein ekspresjonsnivåene, respektivt. Ekspresjon av mRNA RNF146 i NSCLC prøvene var høyere enn for de ikke-kreft lungevev (
P =
0,030) (figur 1A). Resultatene av Western blot og immunhistokjemisk farging bekreftet at RNF146 protein uttrykk ble økt i NSCLC (
P =
0,014,
P =
0.000) (figur 1B), i samsvar med RT-PCR resultater. Ekspresjon av RNF146 ble også analysert i HBE og NSCLC-cellelinjer. Ulike uttrykk nivåer av RNF146 ble observert blant de NSCLC cellelinjer (figur 1C). Ekspresjonen av RNF146 mRNA og protein i både HBE og LK2 (squamous) cellelinjer var lave. Ekspresjonen av RNF146 protein i LTE (adenokarsinom) og LK2 (plateepitel) cellelinjer var moderat, og ekspresjon av RNF146 protein i A549 og H1299 (adenokarsinom) cellelinjer var høy. Dataene indikerte at ekspresjonen av RNF146 ble øket i de kliniske prøvene NSCLC og lungecancercellelinjer.
Påvisning av mRNA og protein ekspresjon av RNF146 i 20 NSCLC-og kontrollprøver ved hjelp av RT-PCR (A) og Western blot (B). T: tumorprøver; N: matchet normalt vev; M: Marker. (C) mRNA og protein uttrykk for RNF146 i HBE cellelinje og de menneskelige NSCLC cellelinjer LK2, LH7 (plateepitel kreft), H1299, LTE, A549, og SPC (adenokarsinom). GAPDH og β-aktin fungerte som internkontroll. (D) Uttrykk og distribusjon av RNF146 i NSCLC ved immunhistokjemi. D1, RNF146 ble ikke uttrykt i normal bronkial og alveolær epitel. D2, RNF146 ble uttrykt i cytoplasma av lungekreftceller, og svak RNF146 ekspresjon ble påvist i den tilstøtende bronkialepitelet. D3 og D5 viste svak RNF146 flekker i godt differensiert plateepitelkarsinom og adenokarsinom. D4 og D6 viste sterk RNF146 flekker i dårlig differensiert plateepitelkarsinom og adenokarsinom. (E) Forholdet mellom RNF146 uttrykk og prognosen for NSCLC pasienter. E1 viste sammenheng mellom RNF146 uttrykk og prognose for stadium I pasienter (
P
0,05). E2 og E3, ingen sammenheng mellom RNF146 uttrykk og prognose for stadium II og stadium III pasienter (
P
0,05).
For å undersøke hvilken rolle RNF146 i NSCLC videre, det relasjoner mellom protein uttrykk og kliniske patologiske egenskaper ble analysert. Det var sammenheng mellom uttrykket av RNF146 og tumorstørrelse (
P
= 0,044), histologisk type (
P =
0.005), dårlig differensiering (
P
= 0,002) , lymfatisk metastase (
P
= 0,009), og pTNM scenen (
P
= 0,015). Men RNF146 uttrykk var ikke korrelert med alder eller kjønn på NSCLC pasienter (tabell 1, figur 1D). Videre Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at overekspresjon av RNF146 var korrelert med overlevelsen av lungekreft pasienter i stadium I (
P
= 0,016). Det var ingen sammenheng mellom RNF146 uttrykk og overlevelsestiden hos alle pasienter (
P =
0,616) eller pasienter med stadium II (
P
= 0,437), eller stadium III NSCLC (
P =
0.520) (figur 1E).
Expression of RNF146, Axin, og Nuclear Fordeling av β-catenin
Som en E3 ubiquitin ligase, regulerer RNF146 den Tankyrase -avhengig nedbrytning av Axin og positivt regulerer Wnt signalveien [1]. For å undersøke sammenhengen mellom RNF146, Axin, og β-catenin, ble uttrykk for Axin og β-catenin i 133 NSCLC prøvene oppdaget av immunhistokjemiske metoder og korrelasjoner av proteinene ble beregnet. RNF146 var negativt korrelert med Axin uttrykket (
P =
0,003), men det ble ikke korrelert med redusert ekspresjon av β-catenin i membraner eller økt ekspresjon av β-catenin i cytoplasma (
P =
0,524). Høy RNF146 uttrykk var positivt korrelert med kjernefysisk β-catenin farging (
P =
0,047) (tabell 2, figur 2A).
(A) Uttrykk og distribusjon av RNF146, Axin, og β -catenin i NSCLC ved immunhistokjemi (x 200). Sterk Axin uttrykk og membranassosiert β-catenin korrelert med lav uttrykk for RNF146 i adenokarsinom (A1). Lav Axin uttrykk og cytoplasma og atom uttrykk for β-catenin ble funnet i plateepitel kreft med høyt uttrykk for RNF146 (A2 og A3). Ekspresjon og fordeling av RNF146, Axin og β-catenin detektert ved (b) RT-PCR, (C) Western blot, og (D) immunfluorescens. Celler transfektert med tomme vektorer fungerte som kontroller.
LTE cellelinjer ble transient transfektert med pEX4-RNF146 overekspresjon plasmid eller kontroll pEX4 tomt plasmid. Eksperimenter bekreftet at RNF146 ble oppregulert. A549 og H1299 cellelinjer ble transient transfektert med RNF146-shRNA1, RNF146-shRNA2 eller kontrollere SHNC, og eksperimenter bekreftet at RNF146 uttrykket ble redusert (figur 2C og Figur S1 A). Videre ble ekspresjonsnivåer av Axin og β-catenin analysert ved RT-PCR, Western blot, og immunfluorescens. Overekspresjon eller slå ned på RNF146 påvirket ikke mRNA uttrykk nivåer av Axin og β-catenin (figur. 2B). Imidlertid Western blot resultatene indikerte at overekspresjon av RNF146 i LTE lungekreftceller inhiberes protein ekspresjon av Axin og økt ekspresjon av β-catenin (fig. 2C). Immunfluorescens bekreftet videre at overekspresjon av RNF146 redusert cytoplasmisk ekspresjon av Axin og økt ekspresjon av β-catenin i cytoplasma og cellekjernen. I kontrast, redusert uttrykk for RNF146 ført til økt uttrykk av Axin i cytoplasma og redusert uttrykk av β-catenin i cytoplasma og cellekjernen (figur. 2D).
Uttrykk for RNF146 og spredning av lungekreft celler
for å utforske rollene til RNF146 i celleproliferasjon, ble LTE og A549-celler transfektert med plasmider som beskrevet ovenfor, og celleformering ble gjenkjent av MTT-analysen. Sammenlignet med kontrollgruppen og gruppen transfektert med det tomme plasmidet, overekspresjon av RNF146 betydelig forbedret celleformering i LTE-celler, mens knockdown av RNF146 hemmet celleproliferasjon i A549 og H1299 celler (figur 3A og figur S1B). Cellesyklus ble analysert ved flow-cytometri, og resultatene viste at overekspresjon av RNF146 redusert prosentandel av G
0 /G
1 fase LTE-celler og øket andelen av S-faseceller. I motsetning til dette, knockdown av RNF146 i A549 og H1299-celler økte prosentandelen av celler i G
0 /G
1 fase og reduserte prosentandelen av celler i S-fasen (figur 3B og fig S1C).
(A) MTT celleproliferasjon analysen med overekspresjon av RNF146 og shRNA-mediert knockdown av RNF146. **
P
0,05. (B) Effekten av RNF146 på cellesyklus analysert ved flow-cytometri. (C) Oppdager cellesyklus protein uttrykk ved Western blot.
Western blot resultater også avdekket sammenhenger mellom nivåene av RNF146 i lungekreftceller og uttrykk av cellesyklus-relaterte regulatoriske proteiner inkludert cyclinD1, cyclinE og CDK4 (figur 3C). Dataene indikerte at RNF146 regulert uttrykk for cyclinD1 og cyclinE og regulert cellecyklusprogresjonen ved å fremkalle G
0 /G
1-S overgang.
RNF146 Expression og invasjon av lungekreft celler
Overuttrykte og knockdown av RNF146 påvirket celle migrasjon og invasjon evner av NSCLC celler. Sårhelende og Transwell eksperimenter vist at overekspresjon av RNF146 forbedret cellemigrering og invasjon i LTE-celler, og at knockdown av RNF146 redusert cellemigrering og invasjon i A549-celler (figur 4A, B, C). Lignende resultater ble oppnådd i H1299 celler hvor RNF146 ekspresjon ble tømt (fig S2, S3). Proteiner knyttet til migrasjon og invasjon ble også oppdaget av Western blot. Uttrykket nivåer av MMP2 og MMP7 ble økt i LTE-celler som overuttrykt RNF146, mens nivåene av RhoA, RHOB, RhoC, Rock1, og TIMP-1 var uendret. Videre ble nivåene av MMP2 og MMP7 sunket betraktelig når RNF146 uttrykk ble slått ned (figur 4D).
(A) sårtilheling analysen i LTE-celler som overuttrykker RNF146 og A549 celler behandlet med shRNA-en målretting RNF146. Histogrammet viser prosenter av migrerte celler i skrapt områder (nederst). (B-C) Analyse av cellemigrering og invasjon evne i transwell analysen. Histogrammet viser antallet migrerte eller invaderte celler. (D) Western blot av migrasjon og invasjon assosierte proteiner. β-actin fungerte som den interne kontrollen.
RNF146 regulert Expression of cyclinD1 og MMP7
Vi foreslo at RNF146 regulert celle migrasjon og invasjon av indirekte regulere target-gentranskripsjon gjennom Axin /β-catenin signalering. For å teste denne hypotesen, vi slått ned RNF146 i celler behandlet med siRNA rettet mot Axin. Vi har funnet at nivåene av cyclinD1, cyclinE, og MMP7 utvinnes sammenlignet med celler behandlet med shRNF146 alene (figur 5A). Overekspresjon av RNF146 i kombinasjon med siRNA knockdown av β-catenin ikke føre nivåer av cyclinD1, cyclinE, eller MMP7 å øke, mens MMP2 nivåene ble fortsatt økt (figur 5B). Knockdown av endogen TCF-4 i LTE-celler kombinert med overekspresjon RNF146 ikke føre nivåer av cyclinD1 og MMP7 å øke (figur 5C). Men når RNF146 og TCF-4 ble slått ned i A549 celler samtidig uttrykk for cyclinD1 og MMP7 redusert mer dramatisk (figur 5D). Tatt sammen, dataene indikerte at RNF146 sannsynligvis regulert ekspresjon av cyclinD1 og MMP7 av Wnt /β-catenin signalveien.
(A) Nivåer av cyclinD1 /E og MMP2 /7 i A549-celler etter behandling med shRNA målrettet for å RNF146 og siRNA rettet mot Axin. (B) Nivåer av cyclinD1 /E og MMP2 /7 i LTE etter overekspresjon av RNF146 og knockdown av β-catenin. (C og D) Nivåer av cyclinD1 og MMP7 ble oppdaget etter knockdown av endogen TCF-4 i LTE og A549 celler med overekspresjon eller knockdown av RNF146.
Diskusjoner
I den foreliggende studie fant vi at RNF146 ble overuttrykt i NSCLC vev i forhold til tilstøtende normale lungevev. Den RNF146 uttrykk nivå viste korrelasjoner med flere kliniske patologiske faktorer, blant annet størrelsen på svulsten, differensiering nivå, lymfatisk metastaser, pTNM iscenesettelse, og prognosen for pasienter i fase I, som er viktige faktorer som representerer potensialet for lungekreft malignitet. Disse dataene antyder at overekspresjon av RNF146 i NSCLC kan forsterke metastase i lungekreft, og at RNF146 kan være en indikator på dårlig prognose i stadium I NSCLC.
Våre data er i samsvar med funnene i to ferske rapporter [10 ] – [11] som RNF146 kan være involvert i utviklingen av svulster. Gold
et al.
Oppdaget en risiko for brystkreft genet i den jødiske Ashkenazi befolkningen ligger på 6Q 22,33 i et genom-wide forening studie. Denne plasseringen inneholdt to gener,
RNF146 Hotell og enoyi CoA hydratase domene som inneholder en [11]. Et annet viktig funn var at RNF146 samhandlet med PARsylated Axin gjennom sin PAR-bindende motiv, som fører til Axin degradering og positiv regulering av Wnt signalveien. Disse resultatene gitt nye bevis for potensielle rolle RNF146 i tumor utvikling [1], [6]. Det har blitt antydet at de nylig identifiserte RNF146 substrater enkel leucin zipper nukleær faktor 1 (BLZF1) og cancer susceptibility kandidat 3 (CASC3) er involvert i tumorutvikling og celleproliferasjon [12] – [13]. Disse rapportene tyder på at RNF146 kan spille viktige roller i svulster ved å endre genuttrykk eller nedverdigende target proteiner.
Wnt signalveien påvirker genekspresjon og cellemigrasjon. Som et viktig molekyl i Wnt signalveien, deltar Axin i dannelsen av Axin /glykogensyntasekinase 3β (GSK-3β) /adenomatøs polyposis coli (APC) /kasein kinase I (CKI) nedbrytning kompleks, som forbedrer nedbryting av β -catenin og hemmer tumor spredning, invasjon og metastasering [14] – [15]. Tidligere studier har vist at Axin spiller viktige roller i NSCLC [14]. Axin ekspresjon er vist å hemme proliferasjonen og invasjonen av lungekreftceller [9]. Cytoplasmatiske stabilisering og oppbygging av kjernefysisk β-catenin, et viktig signal svinger, er viktige prosesser i Wnt signaloverføring.
Vi fant at RNF146 var negativt korrelert med uttrykk for Axin og positivt korrelert med atom uttrykk for β- catenin. Immunofluorescerende farging viste at RNF146 regulert fordeling og atom akkumulering av β-catenin. Tidligere studier har vist at atom β-catenin ekspresjon fører til tap av celleadhesjon. Videre dette proteinet økt transkripsjon av målgener, inkludert c-myc, cyclinD1, VEGF, og MMP7, ved å samhandle med T-celle faktor /lymfoid Enhancer faktor, og dermed føre til spredning og metastasering av tumorceller [16] – [ ,,,0],17]. I denne studien, RNF146 regulert Axin og β-catenin av Wnt signalveien, noe som indikerer at RNF146 påvirket spredning og invasjonen av kreftceller.
Vår MTT og cellesyklus eksperimenter viste at RNF146 ikke bare regulert celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon men også påvirket uttrykket nivåer av proteiner relatert til cellesyklusen. Cyclin D1 regulerer hovedsakelig G
en faseprogresjon [18], og cyclin E forsterker G
1 /S overgang [19] – [20]. Cyclin D1 kan interagere med CDK4 /6 og øke transkripsjonen av gener nedstrøms [18]. Således kan det konkluderes med at RNF146 styrer tumor proliferasjon ved regulering av cellesyklusen.
Våre data viser også at RNF146 påvirket migrering og invasjon av lungekreftceller, tyder på at RNF146 har flere funksjoner. De scratch test og transwell analyseresultatene viste at RNF146 forbedret migrasjon og invasjon av lunge kreftceller. MMP degradere ulike proteiner i den ekstracellulære matrise, forstyrre vev barrierer for tumorcelle invasjon, og spiller viktige roller i invasjonen og metastasering av svulster [21]. Dataene i denne studien viste at MMP2 og MMP7 ble regulert av RNF146. Degradering av den ekstracellulære matriks og benmatriks av MMP2 og MMP7 er blitt vist å være nært knyttet til NSCLC invasjon og metastase [22] – [23]. Dataene tyder på at RNF146 kan regulere migrasjon og invasjon av lungekrefttilfellene ved å regulere MMP2 og MMP7.
Før vår studie, rollene RNF146 i Wnt signalveien var begrenset til nedbrytning av Axin og fremming av atom aggregering av β-catenin. Fordi β-catenin samhandler med TCF-4 etter den går inn i kjernen [16] – [17], hypotese vi at RNF146 kunne regulere celleproliferasjon og invasjon av indirekte regulere målrettet gentranskripsjon gjennom Axin /β-catenin. Våre eksperimenter viste at RNF146 ikke spille regulatoriske roller i nedstrøms proteiner cyclinD1, cyclinE, og MMP7 i celler med knockeddown Axin og β-catenin. Tilsvarende overekspresjon eller knockdown av RNF146 induserte ikke endringer i målrettede protein nivåer når TCF4 ble slått ned. **
P
0.05.
doi:10.1371/journal.pone.0085377.s003
(TIF)
Acknowledgments
We
