Abstract
kreft stamceller (cscs) vanligvis har kapasitet til å unngå kjemoterapi og kan være den viktigste kilden til metastaser. Cscs for mennesker bukspyttkjertelen ductal carcinoma (PDAC) har blitt identifisert, men verken metastatisk potensial heller chemoresistance av disse cellene har blitt tilstrekkelig evaluert. Vi har adressert disse problemene ved å undersøke side befolkningen (SP) celler isolert fra Panc-1 og BxPC3 linjer på menneske PDAC celler, de oncogenotypes som skiller. SP-celler kan bli isolert fra monolag av Panc-1, men bare fra sfæroider av BxPC3. Ved hjelp av ortotopiske xenografter inn i alvorlig immunkompromitterte NSG mus, har vi funnet at SP-celler isolert fra begge cellelinjene produserte svulster som var sterkt metastatisk, i motsetning til tidligere erfaring med PDAC cellelinjer. SP-celler avledet fra begge cellelinjene uttrykte ABCG2 transportør, som var påviselig ansvarlig for SP fenotype. SP celler ga opphav til ikke-SP (NSP) celler
in vitro Hotell og
in vivo
, en overgang som var angivelig på grunn posttranslational hemming av ABCG2 transporter. Tjueto andre linjer av PDAC celler også uttrykt ABCG2. Sensitiviteten av PDAC SP celler til vinkaalkaloid vinkristin kan bli sterkt økt med verapamil, et generelt hemmer av transportører. I motsetning til dette, verapamil hadde ingen effekt på avliving av celler ved PDAC gemcitabin, dagens første-linje terapeutisk for PDAC. Vi konkluderer med at isoleringen av SP-celler kan være et praktisk og effektivt verktøy for studium av PDAC cscs; at cscs kan være de viktigste stamfedre av metastasering av menneskelig PDAC; at ABCG2 transportøren er ansvarlig for SP-fenotypen i humane PDAC celler, og kan være et allestedsnærværende kilde av medikament-resistens i PDAC, men som ikke gir resistens mot gemcitabin; og at hemming av ABCG2 kan tilby et nyttig supplement i en terapeutisk angrep på cscs av PDAC
Citation. Bhagwandin VJ, biskop JM, Wright WE, Shay JW (2016) metastatisk potensial og Chemoresistance of Human bukspyttkjertelen Cancer stamceller. PLoS ONE 11 (2): e0148807. doi: 10,1371 /journal.pone.0148807
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 23 juni 2015; Godkjent: 22 januar 2016; Publisert: 9. februar 2016
Copyright: © 2016 Bhagwandin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Mest relevant data er innenfor papiret. Microarray data ble brukt fra Gysin studien, som forfatterne kan kontaktes på [email protected]
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av: 1. National Aeronautics and Space Administration-spesialisert senter for forskning: NNJ05HD36G (VJB, WEW, JWS), og 2. National Institute of Health, Ruth L. Kirschstein National Research service Award, Institutional Trening Grant (T32) for GW Hooper Research Foundation: CA09043 (VJB, JMB)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) rekker blant de mest dødelige av humane maligniteter. Til tross for aggressiv kirurgi og bruk av moderne neoadjuvant og adjuvant kjemoterapi, er den samlede fem års overlevelse ca 10-26% avhengig av alvorlighetsgraden av formidling (cancer.org og cancer.net). Kjemoterapeutika som gemcitabin redusere primærtumorbyrde, men ikke klarer å eliminere metastatisk leversykdom, den viktigste årsaken til dødelighet i PDAC. Kreft stamcelle hypotese antyder at en liten populasjon av stilk-lignende celler er ansvarlige for vedvarende vekst av en tumor og motstand mot kjemoterapeutika [1]. I tillegg er det blitt foreslått at cscs kan være den umiddelbare kilde for metastatiske celler som egentlig motstå kjemoterapi [1,2]. Flere grupper har isolert og karakterisert bukspyttkjertelen cscs ved hjelp av kombinasjoner av celleoverflatemarkører [enten CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ [3], eller CD133
+ /CXCR4
+ [4]], eller ved fraksjonering SP [5-8]. Den cscs uttrykker CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ hentet fra pasientprøver eller CD133
+ /CXCR4
+ fra cellelinjer har vist seg å være svært tumorigent i NOD /SCID mus [3,4]. Men metastatisk potensial av tumorer avledet fra CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ cscs har ikke blitt rapportert, og svulstene utløst med CD133
+ /CXCR4
+ cscs var bare svakt metastatisk [4]. Alternativt, har fremgangsmåten i SP fraksjone blitt anvendt for å anrike for pancreatic cscs, men tumorer som initieres av disse cscs også metastasert dårlig [5,6]. Vi har brukt ortotopisk injeksjon i alvorlig immunsvikt mus for å forbedre evaluering av SP-celler avledet fra PDAC cellelinjer. Våre resultater tyder på at cscs inkludert i PDAC SP fraksjoner kan være forfedrene til metastasering, og vise at transportøren ABCG2 er en utbredt, om ikke allestedsnærværende kilde til mulige legemiddelresistens i PDAC, men er ikke ansvarlig for resistens mot førstelinje terapeutisk gemcitabin. SP celler avledet fra humane PDAC cellelinjer tilbyr en praktisk måte ved å utforske mekanismene for tumordannelse, metastaser og medikamentresistens.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Bukspyttkjertel cancercellelinjer ble erholdt fra ATCC (Manassas, VA) og dyrket i DMEM for Panc-1-celler, eller RPMI for BxPC3 celler supplert med 10% FBS. Den BxPC3 cellelinje ble også dyrket som sfæroider, ved bruk av ubelagte bakteriologiske petriskåler (ikke-TC), og serumfritt DMEM supplementert med B27 (Invitrogen), en proprietær reagens som er kjent for å fremme veksten av CD133
+ /CXCR4
+ cscs [9]. Den binyrebark-karsinom cellelinje H295 ble dyrket i DMEM supplert med insulin, transferrin og selen (ITS), og 10% FBS.
In Vitro
Farmakologi
For dose responsstudier med gemcitabin, 1500 SP celler fra Panc-1 eller 10000 SP celler fra BxPC3 ble sådd ut i 96-brønners retter og behandlet 24 timer senere med to-fold serielle fortynninger av gemcitabin med eller uten 20 uM av verapamil. For vincristin studier Panc-1, BxPC3, eller H295 SP-celler ble sådd ut i 96-brønners skåler. Hver cellelinje ble behandlet med to-gangers seriefortynninger av vinkristin med eller uten 50 uM av verapamil. Etter en uke ble cellene farget ved anvendelse av MTT-analysen. I hvert eksperiment ble BxPC3 celler dyrket som kuler på ikke-TC 96-brønners skåler i serumfritt DMEM supplementert med B27.
MTT-analysen
MTT-analysen ble brukt til å bestemme graden av chemoresistance i SP og NSP celler. Mediet fra legemiddelbehandlede celler ble erstattet med 100 ul av MTT substrat (5 Hg /ml) fortynnet i analysemedium (phenol-fri DMEM, 25 mM HEPES, 1 mM Na-pyruvat) og plassert i en vevskultur-inkubator i 4 timer. Substratet ble erstattet med 100 ul av oppløsning-løsning (10% Triton X-100, 0,1 N HCl, 80% isopropanol) og forsiktig ristet i 5 minutter. Platene ble lest i en Tecan2 plateavleser ved en deteksjons bølgelengde på 570 nm, og referansen til 690nm.
Farging av ABC transportører
Panc-1, BxPC3 eller H295 celler ble trypsinert, vasket to ganger med PBS, fiksert med 0,1% PFA i 10 minutter og permeabilisert med 0,3% saponin i FACS-buffer. Begge celletyper ble farget med BXP-53 (ABCG2, Santa Cruz) eller G-1 (ABCB1 /MDR-1, Santa Cruz) antistoff fortynnet 1: 100 i FACS-buffer i 30 minutter på is, vasket to ganger med PBS, farget med FITC 1: 1000 i FACS-buffer i 30 minutter på is, vasket med PBS, og analysert på en FACSaria. Immunhistokjemi: 5 um snitt ble kuttet fra parafin innebygd vev av primære svulster, deparaffinized med xylener, hydrert gjennom gradert alkoholer til PBS. Seksjonene ble underkastet varmeinduserte epitop gjenfinning, og gjenværende peroksydase-aktivitet ble stanset med PBS /3% hydrogenperoksid blanding. Farging ble utført ved hjelp av Vectastain ABC elite kanin IgG kit (cat # PK-6101, Vectorlabs) med ABCG2 primære antistoffet. 1: 100 fortynning natten (cat # GTX100436, Genetex) og kontra med Meyers Hematoxylin
Side befolkningen analyse
SP analysene ble utført som tidligere rapportert [7,10]. I korthet, 1 x 10
6-celler ble farget med Hoechst 33342 (HOE) ved en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml og verapamil kontroller ble forbehandlet med 100 ^ M av verapamil i 10 minutter. Alle prøver ble inkubert ved 37 ° C grader i 60 minutter med periodisk blanding av hver 15 min. Celler ble samlet og resuspendert i PBS til 3% BSA, 0,01% DNase I, og 1 ug /ml propidiumjodid og filtrert gjennom en sil 40μM celle. De BxPC3 kuler ble dissosiert ved normal trypsinering før HOE farging. Immuno-inhiberingsanalyse: før HOE farging, Panc-1, BxPC3 og H295-celler ble forbehandlet med 5 ng av enten ABCG2 antistoff 5D3 (R og BxPC3 celler, som inneholder et tap av funksjon mutasjon i
SMAD4 Hotell og
CDKN2A
gener (som begge er relativt uvanlig i PDAC) [12]. SP-fraksjonen ble bestemt ved å detektere utelukkelse av den DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342 (HOE) fra celler, en indikasjon på transportøraktivitet [4,10]. Porten for SP ble bestemt av verapamil hemming, et bredt aktiv transporter antagonist. En 10% SP fraksjon ble påvist i Panc-1-celler (figur 1A), men i motsetning til en tidligere rapport [5], kan en SP fraksjon ikke påvises i BxPC3 celler formert i konvensjonelt medium som 2D-monolag (figur 1A). SP brøkdel tidligere rapportert i BxPC3 celler ble ikke testet i en biologisk analyse, og derfor kan være et problem for flowcytometri instrumenttypen, instrumentinnstillinger eller flekker metode. I et forsøk på å avdekke cscs i BxPC3 cellelinje, ble ufraksjonerte celler dyrket som kuler under forhold som skal fremme overlevelse og formering av normale stamceller (se Materialer og metoder). Dette ga en SP-fraksjon på 5% i kulturer av BxPC3 kuler (figur 1B). I motsetning til dette, Panc-1 celler ble ikke trives når dyrket under de betingelser som anvendes med BxPC3 og kunne ikke brukes for SP fraksjonering. Muligheten av kuler for å avsløre SP fenotypen i BxPC3 er forenlig med tidligere rapporter om at cscs er beriket i sfæroider [13-15]. Det er bemerkelsesverdig at de to PDAC cellelinjer har tydelig forskjellige oncogenotypes, noe som kan forklare forskjellene i deres SP innhold og svar på spesialiserte medium.
(A) Panc-1 og BxPC3 celler ble farget med Hoechst 33342 fargestoff (5 Hg /ml) og analysert med en FACSaria strømningscytometer, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Porten for SP-celler ble bestemt ved behandling med verapamil (100 uM). Fraksjonen av celler i SP-porten er gitt i hvert panel. Profilen til Panc-1 celler, øvre rad; og BxPC3 celler, nedre rad; verapamil kontroll (VP), høyre panel. (B) Top rad: BxPC3 celler ble dyrket enten i standard medium på vev kultur retter (TC), i serumfritt DMEM med B27 (SFDB) på TC retter, eller som kuler i SFDB på ubestrøket bakteriologisk (non-TC) petri retter. Nederste rad:. Kvantifisering av SP ved FACS sortering for hver kultur tilstand, verapamil kontroll (VP), panel til høyre
Tumor initiere potensialet i SP og NSP celler
Basert på vår tolkning av de publiserte data [3,5,6,8], cscs beriket av utvalg for celleoverflatemarkører er vesentlig mer effektiv enn SP cscs i tumorigenesis analyser. I et forsøk på å forbedre ytelsen til SP cscs i analyser for tumorigenesis, benyttet vi orthotopic injeksjon i pankreata av NSG mus, hvis alvorlig immunsvikt gjør dem svært følsomme for tumorigenesis av transplantater [16]. Vi orthotopically injisert 500, 5000, eller 50 000 av SP eller NSP celler fraksjonert fra luciferase-merket Panc-1 monolagene eller BxPC3 kuler. Luciferase ble benyttet for å oppnå bilder fra injiserte mus. Vi fant at 500 SP-celler var tilstrekkelig til å danne svulster i løpet av to uker i hele kullet på fem mus, mens 500 NSP-celler gjorde det i bare en enkelt mus av fem (figur 2A og 2B). Med tre måneder, men alle dyrene hadde utviklet pankreastumorer (se nedenfor, figur 3A). Disse resultatene er en stille med forbedring på tidligere erfaring med SP-celler, hvor et minimum på 10.000 celler som var nødvendig for å initiere tumorgenese som var påvisbar innen 4-5 uker [5,6]. Vi konkluderer med at vår protokollen har effektivisert tumorigenesis av cscs som finnes i SP fraksjon fra PDAC cellelinjer.
SP og NSP celler ble oppnådd ved fraksjonering ved hjelp av portene som er vist i figur 1. Svulsten initiere potensialet SP og NSP ble testet ved injisering av orthotopically 500, 5000, 50000 eller celler av luciferase-merkede celler fra hver populasjon, ved hjelp av en skare fem NSG mus for hver dose av celler. Etter to uker ble den relative mengde av tumorvolum påvist ved anvendelse av sanntids
in vivo
bioluminescens avbildning. (A) Panc-1 monolags-celler (B) BxPC3 sfæroider celler. (C) Histogram svulst forekomst for hver kohort av fem NSG mus, Student
t
test =
P
. 0,002
SP og NSP cellene isolert fra Panc-1 monolagene og BxPC3 kuler, så orthotopically injiseres som 500 celle porsjoner i kohorter av tre NSG mus. Dyrene ble opprettholdt i tre måneder og deretter undersøkt for primære og metastatiske svulster. (A) Sammenligning av primære svulster og metastaser generert av SP, høyre kolonne og NSP celler, venstre kolonne isolert fra Panc-1 monolagene og metastaser isolert fra BxPC3 kuler. Den øverste raden viser primære svulster og andre rad viser metastaser for begge cellelinjer. (B) Kreftceller ble isolert fra primær- og metastatiske svulster og analysert for SP innhold. Primær tumorlokalisering, topplater; metastatisk nettsted, bunnplater. (C-D) SP og NSP fraksjoner ble isolert fra Panc-1 og BxPC3 celler og sådd tilbake i kultur, ved hjelp av standard medium for celler fra Panc-1 på normale vev kultur retter og spheroid medium for BxPC3 celler på ikke-TC retter. Etter en uke uten passasje, ble hver belagt fraksjon analysert ved FACS. Prosentandelen av celler i SP gate er gitt i hvert panel.
metastatisk potensial for SP cscs
Nyere bevis tyder på at cscs kan være kilden til metastatisk sykdom [17,18 ]. Men tidligere forsøk mislyktes i å oppnå sterk metastasering med cscs anriket ved bruk av enten celleoverflatemarkører eller SP fraksjonering. Dette gjaldt celler som representerer enten PDAC eller andre former for kreft [3,4,19-24]. I et forsøk på å øke metastase av tumorer dannet fra SP celler, vi igjen brukt orthotopic injeksjon i NSG mus. Vi isolert SP og NSP fraksjoner fra Panc-1 monolagcellene og BxPC3 sfæroide celler, deretter injisert 500 av disse cellene inn i pankreata av tre NSG mus i hver årsklasse. Av tre måneder hadde både SP og NSP-celler fra hver cellelinje produsert primærtumorer på omtrent 1 cm i størrelse (figur 3A). I tillegg var det alvorlig metastatisk leversykdom hos mus injisert med SP-celler, praktisk talt utslettende den normale lever parenchyma (figur 3A, høyre panel). Dyrene som hadde fått NSP-celler inneholdt også levermetastaser, men de metastaser var både få i antall og betydelig mindre (figur 3A, venstre panel). Vi konkluderer med at svulster er produsert med SP celler avledet fra enten monolagene eller kuler er aggressivt metastatisk.
Primære svulster initiert med SP celler fra enten Panc-1 eller BxPC3 inneholdt en SP brøkdel av omtrent samme størrelse som det som finnes i de cellelinjer (figur 3b). Videre er størrelsen på SP fraksjon var enda lavere i de metastaser (figur 3B), i overensstemmelse med tidligere rapporter [8,25]. Disse resultatene tyder på at cscs eller andre komponenter av SP fraksjonen populasjonen framsatt tallrike NSP-celler i løpet av tumorigenese og metastasering. Det ble ikke observert ytterligere bevis på en slik hendelse når SP og NSP cellene ble fraksjonert fra Panc-1 monolagene og BxPC3 kulene, og deretter dyrket
in vitro
uten passasje. Etter en uke, med bare 2,5 doublings, et stort flertall av de dyrkede SP celler fra begge linjene nå fraksjonert som NSP celler (figur 3C og 3D), og dermed tilsynelatende å gjenskape hendelsene som skjedde
in vivo
under løpet av tumorigenesis. I motsetning til dette, de dyrkede cellene NSP fra begge linjene inneholdt små mengder av SP-celler (figur 3C og 3D). Dette funn kan representere enten et spor forurensning av NSP fraksjon eller et lavt nivå av omdannelse av NSP celler til SP fenotype. Uansett deres kilde, tilstedeværelse av SP-celler i NSP fraksjonen utgjør en potensiell forklaring på tumoren initiert av NSP fraksjonen i figur 2A, den tilsynelatende evnen til NSP celler til å produsere tumorer i en forsinket måte (figur 3A), og metastaser som skjedde i mus som fikk NSP celler (figur 3A).
ABCG2 er ansvarlig for SP fenotype i PDAC cellelinjer
ATP bindende kassett (ABC) transportører er en viktig kilde til narkotika motstand i humane tumorer [26,27]. To av disse transportører, ABCG2 /BCRP og ABCB1 /MDR-1, er rapportert å være de viktigste kildene til SP fenotype i humane tumorcellelinjer [19,20]. Det har blitt rapportert tidligere at PDAC celler uttrykker ABCG2, men ikke MDR-1 [5,6,28,29]. Imidlertid er ABCG2 aktivitet avhengig av ekspresjon på celleoverflaten, som reguleres ved posttranslasjonell modifikasjon og oppdeling i seksjoner [30]. Derfor har vi farget for de to transportører på overflaten av Panc-1 og BxPC3 celler. Som kontroll brukte vi H295-celler, adrenokortikale carcinom celler som uttrykker MDR-1 [31,32]. Vi fant at Panc-1 og BxPC3 cellene uttrykte bare ABCG2 på sin overflate, mens H295-celler uttrykte bare MDR-1 (figur 4A). FACS data viser at hele befolkningen i Panc-1 og BxPC3 cellene uttrykte ABCG2 (Fig 4A), og vi oppnådd tilsvarende resultater ved hjelp av immunhistokjemi å undersøke primære svulster generert fra SP og NSP celler, og fire menneskelige PDAC pasientprøver (fig 4B og 4C).
(A) Celleoverflate- farging av ABCG2 (5D3 antistoff) og ABCB1 /MDR-1 (MRK-16 antistoff) på Panc-1 monolagcellene, BxPC3 sfæroide celler og H295 celler. (B) Immunohistochemistry farging av ABCG2 på SP og NSP generert primære svulster (positiv DAB flekken, brunt). (C) Immunohistochemistry farging av ABCG2 på primære PDAC svulster fra fire pasienter (positiv DAB flekken, brunt).
ubiquity av ABCG2 i cellepopulasjoner hevet uortodokse muligheten for at transportøren ikke var ansvarlig for SP fenotype. For å teste denne muligheten, behandlet vi cellene med blokkerende antistoffer for ABCG2 [33] og MDR-1 [34] før gjennomføring av den SP fraksjonering. Inhibering av ABCG2 redusert SP fraksjon av Panc-1 celler og BxPC3 kuler til 1,04% (9,5 gangers reduksjon) og 0,01% (400 gangers reduksjon), respektivt (figur 5). I motsetning til inhibering av MDR-1 hadde ingen effekt på SP-innhold i de to PDAC cellelinjer, men redusert SP fraksjonen i H295-celler med mer enn ni ganger (figur 5). Vi konkluderer med at ABCG2 transportøren er ansvarlig for SP fenotype i Panc-1 og BxPC3 celler. Derfor, til tross allestedsnærværelsen av transportøren i cellepopulasjoner, må det være aktiv i bare en begrenset del av cellene som slag som SP. Det har blitt rapportert tidligere at aktiviteten av ABCG2 er utsatt for post-translasjonelle kontroll av Akt [30], som kan forklare eksistensen av NSP-celler.
Inhibering av SP fenotype. Celler ble behandlet med blokkerende antistoffer for ABCG2 (5D3) og MDR-1 (MRK-16), og deretter fraksjonert ved hjelp av FACS, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. H295, øverste rad; Panc-en enkeltlag, midterste rad; og BxPC3 kuler, nederste rad. Kolonner 1-4 er som merkes i figuren. Ubehandlet, verapamil (VP), 5D3 antistoff, og MRK-16 antistoffet
For å finne ut hvor utbredt uttrykk for ABCG2 kan være i PDAC, vi fikk tidligere utgitt microarray data fra 22 bukspyttkjertelkreft cellelinjer [35] og sammenlignet uttrykk for ABCG2 som i MDR-1. Tre normale pankreatiske epitel-cellelinjer ble også analysert i matrisen studien, og ble her brukt for å normalisere cancercellelinjedata. Påfallende, uttrykte hver bukspyttkjertelkreft cellelinje ABCG2 2-5 ganger over normal bukspyttkjertelen epiteliale cellelinjer, mens ingen av cellene uttrykte MDR-1 (figur 6). Vi konkluderer med at uttrykk for ABCG2 kan være en allestedsnærværende eiendom PDAC celler, kanskje representerer en atavism fra en normal stilk-lignende celle som gir opphav til cscs, og dermed til svulster.
Microarray analyse av ABCG2 og MDR -1 i 22 bukspyttkjertelkreft cellelinjer [36]. I loggen
2 expression data for ABCG2 og MDR-1 fra tre ikke-maligne menneskelige bukspyttkjertelen duktale epitel cellelinjer (hPDEC; # 904, # 916, # 515) ble i gjennomsnitt og trukket fra loggen
2 fra hver bukspyttkjertelkreft cellelinje og plottet som en foss og Manhattan tomten, Student
t
test =
P
. 0,001
Den ABCG2 transporter gir ikke motstand til gemcitabin
gemcitabin er vanligvis førstelinjebehandling for pasienter med PDAC, men den dystre overlevelse for sykdommen skyldes et relativt begrenset reaksjon på stoffet. Motstanden av PDAC SP-celler til gemcitabin er blitt tilskrevet utstrømming av ABCG2 [5]. Hvis det var riktig, og deretter hemming av transportøren ved den forstand aktiv antagonist verapamil bør øke følsomheten av PDAC celler til gemcitabin [27]. Vi først bekreftet tilstedeværelsen av transportør-medierte motstand i PDAC cellelinjer ved å behandle SP-celler fra Panc-1, BxPC3 og H295 med enten vinkristin eller en kombinasjon av vinkristin og verapamil (figur 7A, 7C og 7E og tabell 1). Verapamil kraftig forbedret drapet av vinkristin av SP celler fra alle tre linjer. I motsetning til dette, verapamil hadde ingen effekt på den avliving av Panc-1 og BxPC3 SP-celler med gemcitabin (figur 7B, 7D og 7E og tabell 1), noe som indikerer at tilstedeværelse av ABCG2 eller MDR-1 hadde ikke overdratt motstand til gemcitabin på begge cellelinje. Vi konkluderer med at transportøren normalt bosatt i PDAC cellene ikke bidrar til begrensninger av gemcitabin som en terapeutisk for sykdommen.
dose respons av SP celler fra (A) H295, (C) Panc-1 mono celler, og (E) BxPC3 sfæroide celler til vinkristin (VCR) og kombinasjon av vinkristin med verapamil (VCR-VP) ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. På lignende måte ble doserespons av SP-celler fra (B) H295, (D) Panc-1 monolagsceller og (E) BxPC3 sfæroide celler til gemcitabin (Gem) og kombinasjonen av gemcitabin med verapamil (Gem-VP) bestemmes ved hjelp av MTT-analyse. Alle datapunkter ble generert fra et enkelt eksperiment og representerer gjennomsnittet av seks brønner per behandling konsentrasjon, normalisert til gjennomsnittet av seks indre ubehandlede kontrollbrønner, og deretter transformert av naturlige logaritme og vist som en fire parameter variabel plottet som en funksjon av log ( narkotika) versus respons. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) fra seks brønner i et enkelt eksperiment, blir alle grafene ble generert ved hjelp av Prism statistisk analyse programvare, Student
t
test =
P
0,0002 .
Diskusjoner
SP celler av PDAC
Etablert linjer av humane kreftceller har lenge vært brukt som forsøks surrogater for prøver tatt direkte fra svulster , både for studier av tumorigenese og screening for nye terapeutika. Nytten av cellelinjer som stammer fra menneskelig PDAC har imidlertid blitt kompromittert av feil på svulster produsert med slike celler for å vise robust metastaser som er så typisk for klinisk sykdom. Her viser vi en løsning på dette problemet. Når orthotopically injiseres i alvorlig immunsupprimerte NSG mus, SP celler fra PDAC cellelinjer ga opphav til svulster som var aggressivt metastatisk. I motsetning til dette, NSP-celler var mindre tumorigen, og de resulterende tumorene var dårlig metastatisk. Siden SP fraksjonen er beriket for cscs disse funnene er i samsvar med den oppfatning at cscs kan være de viktigste stamfedre for metastase [2,17,18]. Neoplastiske organoids avledet fra både murine og humane PDAC også gi opphav til metastatisk sykdom når podet orthotopically inn immunkompromitterte mus [16]. Det gjenstår å se om de metastaser i dette systemet stammer fra en særegen undergruppe av celler i svulstene, og i så fall om de er cscs av svulsten.
En fersk rapport har beskrevet separasjon av cscs fra SP-fraksjonen av flere tumortyper ved bruk av autofluorescens [15]. I motsetning til dette SP fraksjon som vi avledet fra PDAC cellelinjer viste en anriket evne til å produsere høyt metastatiske tumorer, egenskaper i overensstemmelse med tilstedeværelsen av cscs. Vi merker oss at det var en betydelig forskjell i hvordan de to studiene forberedt celler for FACS sortering. Ellers vi kan ikke forklare avviket mellom de to sett av resultater.
For å oppnå en SP fraksjon fra den BxPC3 cellelinjen, vi måtte forplante cellene under betingelser som fostret vekst som sfæroider. Vi kan tenke på to mulige forklaringer på denne observasjonen. For det første kan SP-cellene være tilstede i linjen, men i tall for lavt for deteksjon av SP fraksjonering. Siden vekstbetingelser ble utformet for å favorisere stilk-lignende celler, kan de tilveiebringe en selektiv fordel for overlevelse og formering av SP-celler, inkludert undergruppe av disse cellene som oppfører seg som cscs i tumorgenese analyser. Det er bemerkelsesverdig at kuler er kjent for å være iboende beriket for cscs [9,13,14]. Alternativt kan cellekulturmediet fremme omdannelsen av NSP til SP-celler, ligner den konvertering fra Non-cscs til CSC tidligere beskrevet for humant melanom og brystkreft [37,38]. Vi fikk en antydning av en slik omdannelse fra tilstedeværelsen av SP-celler i kulturer av NSP-celler, selv om SP-cellene kan ha oppstått i stedet fra en selektiv fordel anordnet for å kontaminerende SP-celler ved forplantning
in vitro
. Uansett forklaring på oppførselen til BxPC3 celler, tyder resultatene på at dyrking av celler som kuler kan være en generell måte å avdekke en SP fenotype i tumorcellelinjer som ellers ikke vise at fenotype.
Tidligere rapporter har beskrev evne SP celler å gyte NSP celler [21-25,39-41], mye som cscs tjene som kilde for de mer modne celler som utgjør hoveddelen av svulster. I samsvar med disse observasjonene, det var en overflod av NSP celler i PDAC svulster initiert av SP celler i våre eksperimenter, og dyrke SP celler
in vitro
resulterte i NSP celler raskt blitt det store flertallet av befolkningen. Siden hele populasjon av celler inneholder ABCG2, en mulig forklaring på overgangen til NSP fenotype er tidligere beskrevet post-translasjonell hemming av transportaktivitet ved Akt [30].
Den ABCG2 transporter som formidler av SP fenotype og chemoresistance
Vi identifiserte ABCG2 transporter som formidler av SP fenotype i Panc-1 og BxPC3 celler, og fant uttrykk for at transporter i tjueto andre PDAC cellelinjer. Den tilsynelatende ubiquity av ABCG2 i PDAC celler antyder at uttrykket av transportøren kan være en tilbakevending til en evolusjonær doms typen ligner en normal stilk eller stamcelle som gir opphav til stamcelle for PDAC. Det er fortsatt uklart i hvilken grad ABCG2 er ansvarlig for den ildfaste natur PDAC. På den ene siden, observerte vi at ABCG2 ikke utstrømning gemcitabin, et bly medikament i behandlingen av PDAC.
