Abstract
Bakgrunn
Nivåer av sirkulerende vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) har mye blitt brukt som biomarkør for angiogen aktivitet i kreft. For dette formål ble ikke-standardiserte målinger i plasma og serum som brukes, uten korrigering for kunstig VEGF frigivelse av blodplater aktiverte
ex vivo
. Vi hypotese at «ekte» sirkulerte (c) VEGF nivå i de fleste kreftpasienter er lav og uten tilknytning til kreft belastning eller tumor angiogenese.
Metodikk
Vi er fast bestemt VEGF nivåer i PECT, et medium som inneholder blodplateaktiverings hemmere, i citratplasmasammenslåing, og i isolerte blodplater i 16 friske personer, 18 pasienter med metastatisk ikke-renal kreft (ikke-RCC) og 12 pasienter med nyrecellekreft (RCC). I ikke-RCC pasienter, sirkulerende plasma VEGF nivåer var lav og lik VEGF nivåer i kontroller om plateaktivering ble minimert under innhøstingen prosedyren ved PECT medium. I citratplasmasammenslåing, ble VEGF nivåer forhøyet i ikke-RCC pasienter, men dette kan forklares med en kombinasjon av økt plateaktivering under blod høsting, og av en to-ganger økning i VEGF innhold av individuelle blodplater (kontroller: 3,4 IE /10
6, ikke-RCC: 6,2 IE /10
6 plater, p = 0,001). Derimot ble cVEGF nivåer i RCC pasienter forhøyet (PECT plasma: 64 pg /ml vs. 21 pg /ml, RCC kontra ikke-RCC, p 0,0001), og ikke relatert til blodplate VEGF konsentrasjon
Konklusjoner
Våre funn tyder på at «ekte» fritt cVEGF nivåer er ikke forhøyet i de fleste kreftpasienter. Tidligere rapporterte forhøyede plasmanivåer i VEGF kreft synes å være på grunn av kunstig frigivelse fra aktiverte blodplater, som i kreft har et økt innhold VEGF, i løpet av blod innhøstingen prosedyren. Bare i pasienter med RCC, som er karakterisert ved overdreven VEGF-produksjon på grunn av en spesifikk genetisk feil, var cVEGF nivåer forhøyet. Denne observasjonen kan være relatert til begrenset og selektiv suksess for anti-VEGF midler, for eksempel bevacizumab og sorafenib, som monoterapi hos RCC i forhold til andre former for kreft
Citation. Niers TMH, Richel DJ, Meijers JCM, Schlingemann RO (2011) Vaskulær endotelial vekstfaktor i Circulation i kreftpasienter kan ikke være et relevant Biomarker. PLoS ONE 6 (5): e19873. doi: 10,1371 /journal.pone.0019873
Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 15 april 2010; Godkjent: 19 april 2011; Publisert: 26 mai 2011
Copyright: © 2011 Niers et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er det viktigste. regulator av angiogenese i tumorer [1] – [3]. Det er utgitt av kreftceller, hypoksiske celler og aktiverte plater og leukocytter [4] – [8]. Målcellene av VEGF er hovedsakelig vaskulære endotelceller som den har kraftige mitogene virkninger via høyaffinitets-reseptorer Flt-1 og KDR /Flk-1 [9], [10]. Som VEGF er et oppløselig diffusjonsevne peptid som skilles ut av tumorer, ble dens nivåer i sirkulasjonen foreslått å reflektere den angiogene aktivitet av maligniteter. Derav de siste årene, sirkulerende nivåer av VEGF og andre angiogene faktorer har vært mye studert som surrogatmarkører for angiogen aktivitet og prognose hos kreftpasienter, for overvåking behandlingsrespons og for deteksjon av tidlig tilbakefall [11].
for dette formål, ble VEGF-nivåer bestemt i serum eller plasma anvendt. Imidlertid inneholder serum høye nivåer av VEGF på grunn av frigjøring av aktiverte blodplater i løpet av blodpropp [5] – [7]. Derfor VEGF-nivåer i serum, som korrelerer tett med blodplater [12], ikke gjenspeiler den faktiske sirkulerende konsentrasjon av VEGF in vivo. I citrat eller EDTA-plasma, hvor mindre blodplateaktivering og påfølgende VEGF frigivelse ventes enn i serum, ble VEGF-nivåer funnet å være fremdeles høyere hos kreftpasienter enn i kontrollene, og dette ble tolket som en gjenspeiling av høyere nivåer av VEGF i sirkulasjonen og høyere angiogen aktivitet [13] – [15]. Men også av disse forfatterne kunstig utslipp av VEGF fra blodplater, eller endret atferd blodplater i kreftpasienter, ikke ble ekskludert som en kilde til økt VEGF nivåer i plasma.
Hensikten med denne studien var å undersøke muligheten for at kunstig VEGF utgivelsen av blodplater er den viktigste kilden til VEGF i plasmaprøver, og at sirkulerende nivåer av VEGF i kreftpasienter er lav, og selv ikke er relatert til kreft belastning eller angiogen aktivitet. For dette formålet, vi fast bestemt på plasmanivået av VEGF med eller uten hemming av plateaktivering, og kvantifisert VEGF utgivelse fra blodplater in vitro, i kontrollpersoner uten kreft, pasienter med metastatisk ikke-nyrecellekarsinom pasienter og pasienter med metastatisk nyrecellekarsinom.
Materialer og Metoder
pasienter og frivillige
Vi har innhentet veneblod fra 16 friske frivillige (kontroller) og fra 30 kreftpasienter, separert i to pasientgrupper: 18 pasienter med metastatisk ikke-RCC (non-RCC) og 12 pasienter med metastatisk RCC (RCC). RCC ble preget av høy intra-tumor VEGF produksjon av mutasjoner i von Hippel-Lindau tumorsuppressorgenet med påfølgende ubegrenset aktivitet av hypoksi induserbar faktor 1α (HIF1α) forårsaker høyt VEGF transkripsjon [16] -. [20]
Vi undersøkte VEGF nivåer i citratplasmasammenslåing, PECT plasma og i blodplater. Karakteristikken av frivillige og pasienter er som følger: friske kontroller (kontroller) median alder, 53 [48-60]; kreftpasienter (Non-RCC-gruppe); median alder 62 [57-72]; med kreft i bukspyttkjertelen (7), cholangio (3), Papilli av Vater (2), spiserøret (1), tykktarm og rektum (2), melanom (1), eggstokk (1), bryst (1). RCC (RCC-gruppe) median alder 60 [56-65]; med følgende prognostiske grupper: 5 fattig-risiko, 5 middels risiko og 2 gunstige risiko, ifølge Motzer [21]. Alle kreftpasienter hadde metastatisk sykdom. Å diskriminere mellom in vivo blodplateaktivering og kunstige in vitro blodplateaktivering i løpet av plasma høsting ble β-TG og PF4 målt på alle prøver. Blodprøver som brukes i denne studien ble hentet fra RCC pasienter inkludert i BAYER 43-9006 studien (godkjent av Medical Ethics Committee (METC 05-262), Academic Medical Center, University of Amsterdam), non-RCC pasienter ikke inkludert i en spesifikk studie, og frivillige. Fra alle frivillige og pasienter egen skriftlig informert samtykke ble innhentet for blodprøve innhøsting og angiogenese biomarkør bestemmelser.
Plasma forberedelser
For sammenligning med standard citratplasmasammenslåing samling, vi ansatt en metode for å (maksimalt) unngå kunstig ex vivo blodplateaktivering ved blodprøvetaking uten årepresse, og innhøsting i et medium inneholdende en blanding av antikoagulanter som prostaglandin E
1 og teofyllin ble tilsatt (PECT medium). I tillegg har vi brukt et viktig verktøy for å diskriminere mellom in vivo blodplateaktivering og kunstige in vitro blodplateaktivering, dvs. målinger av β-thromboglobulin (β-TG) og platefaktor 4 (PF4) nivåer. Samling i PECT plasma og samtidig bruk av markører for plateaktivering bør gi en nøyaktig vurdering av de sirkulerende nivåer av VEGF in vivo.
Fra hver pasient eller frivillig venøs blod ble tatt med en microperfuser (diameter 1 mm, Micro , Vycon, Ecouen, Frankrike) og delt inn i forskjellige rør. Plast (polypropylen) blodprøverør ble fylt med 400 mL av en løsning som inneholder: prostaglandin E
1 (94 nM), Na
2CO
3 (0,63 mM), EDTA (90 mm) og theophylin ( 10 mM) (PECT-medium). Blodprøver (4 ml) ble oppsamlet i disse PECT rør i et åpent system, dråpe for dråpe uten å bruke en tilstrammende til (maksimalt) for å unngå blodplateaktivering ex vivo. Blod ble samlet i PECT rørene ble umiddelbart plassert på is (i motsetning til citrat og EDTA blodprøver som ble holdt ved værelsestemperatur). Blodplatefattig plasma PECT ble fremstilt ved å spinne i 60 minutter ved 1700 g ved 4 ° C i løpet av 1 time etter samling.
Blod ble også oppsamlet i rør fylt med citrat og i rør fylt med EDTA ved hjelp av en tilstrammende ( Becton Dickinson vacutainers Systems, Breda, Nederland). Citratet Blodprøvene ble sentrifugert i løpet av 30 minutter i 15 minutter ved 1000 g for å oppnå plasma. EDTA-blod trekkes på samme måte ble anvendt for å måle totale antall blodplater. For å måle VEGF, PF4 og β-TG i blodplatene, ble EDTA blod anvendt i hvilket blodplater ble ødelagt ved en kombinasjon av Triton (2% Triton X-100), ultralydbehandling i løpet av 15 sekunder på is (mikrotip, Branson, amplitude 50% ) og sentrifugering i løpet av 5 minutter ved 14.000 rpm i en mikrosentrifuge. Blodplatefattig plasma PECT ble brukt til å måle VEGF, PF4 og β-TG-nivåer. Citratplasmasammenslåing ble brukt til å måle VEGF og PF4 nivåer.
Målinger av blodplateaktiverings markører og VEGF
PF4 og β-TG konsentrasjoner i blodplater er like og på plateaktivering de er utgitt i tilsvarende mengder [22], [23]. Fordi PF4 klaring fra plasma er mye raskere enn p-TG klaring (halveringstiden for PF4 er flere minutter og for β-TG 100 minutter) [22], [23] en normal eller bare svakt forhøyet PF4 nivå og høy β-TG nivå antyder in vivo blodplateaktivering, mens en høy β-TG-nivå i kombinasjon med et høyt nivå PF4 antyder in vitro (ex vivo) blodplateaktivering. Alle prøver ble derfor testet for VEGF, β-TG og PF4 ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige sandwich-enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) fra Roche (Asserachrom β-TG og Asserachrom PF4, Roche, Mannheim, Tyskland), og R . D Systems, Abingdon, UK)
Recovery av VEGF
for å utelukke at PECT eller citrate medium påvirker målingen av VEGF nivåer ved ELISA, kjente konsentrasjoner av rekombinant human VEGF (standard anordnet i analysesettet) ble tilsatt til serum, plasma og PECT citratplasmaprøver å frem VEGF-konsentrasjoner på 250, 62,5, 31,2, 7,8 og 3,9 pg /ml. Prøvene ble fortynnet med analysebuffer, og konsentrasjonen av VEGF ble bestemt ved hjelp av ELISA.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med dataprogrammet SPSS versjon 12,0 (SPSS, Gorinchem, Nederland) og med GraphPad Prism programvare (GraphPad Prism, San Diego, CA, USA). VEGF, PF4 og β-TG-nivåer hos friske frivillige og kreftpasienter ble sammenlignet med Mann-Whitney U-test (uparede, ikke-normalfordelte grupper). Verdiene er presentert som median og indre kvartilområdet [t25-T75].
Resultater
Plasma og blodplate VEGF nivåer
I de tre pasientgrupper, VEGF nivåer i citratplasmasammenslåing ( figur 1A) var betydelig høyere enn i plasma PECT (figur 1B). VEGF-nivåer i citratplasma var signifikant høyere i begge grupper av kreftpasienter sammenlignet med friske kontroller, men i PECT plasma dette var tilfelle bare for pasienter med RCC. VEGF innhold av isolerte blodplater, en velkjent reservoar for VEGF, var to ganger høyere i begge kreftpasientgrupper enn i kontrollgruppen (tabell 1 og figur 1C).
A) VEGF-nivåer målt i citratplasmasammenslåing kreftpasienter sammenlignet med friske personer. B) VEGF-nivåer målt i PECT plasma hos kreftpasienter sammenlignet med friske personer. C) VEGF nivåer målt i blodplater av kreftpasienter versus friske personer. Barer representerer medianverdier.
I RCC pasienter, VEGF nivåer i PECT plasma var betydelig høyere enn hos ikke-RCC pasienter, mens plate VEGF innholdet var ikke forskjellig mellom disse gruppene. VEGF-nivåer i citratplasma, PECT plasma og blodplater i pasienter gruppe er vist i tabell 1 og figur 1. Disse målingene ble ikke påvirket av den type medium som brukes, som utvinning av VEGF var 100-107% i PECT plasma, 73 % -107% i citratplasmasammenslåing og 78-100% i serum.
in vitro
plateaktivering
på grunn av sin lave halveringstid in vivo, PF4-nivåer i blodprøver er et mål på kunstig ex vivo blodplateaktivering. I vår studie, både hos friske kontroller og kreftpasienter PF4 konsentrasjonene var 50-100 ganger høyere i standard citratplasmasammenslåing (samlet med tourniquet) enn i PECT plasma (samlet uten tourniquet) (tabell 2). Dette viser at graden av kunstig ex-vivo blodplateaktivering er svært avhengig av fangstmetode, og som kunstig blodplateaktivering i PECT plasma er lav og i citratplasmaprøver er høy.
As plate aktivering er assosiert med VEGF utgivelsen, PECT plasma VEGF nivåer trolig gjenspeile de sirkulerende nivåer av VEGF, mens den økte nivåer av VEGF i citratplasmasammenslåing er hovedsakelig forårsaket av ex vivo blodplateaktivering. Denne muligheten er sterkt støttet av den signifikant korrelasjon som vi har observert mellom PF4 og VEGF nivåer i enkelte citratplasmaprøver (figur 2).
VEGF og PF4 målt i citratplasmasammenslåing korrelerte signifikant (r = 0,457, p = 0,008 ).
i PECT plasma, fant vi to ganger høyere PF4 verdier hos kreftpasienter sammenlignet med friske kontroller. Dette indikerer at blodplater fra kreftpasienter er mer utsatt for å bli aktivert. Imidlertid kan en økt PF4 konsentrasjon i enkelte plater av kreftpasienter også har bidratt til den økte PF4 konsentrasjon i PECT plasma (figur 3).
A) β-TG og PF4 målt i PECT plasma hos kreftpasienter sammenliknet til kontrollene. B) β-TG og PF4 målt i blodplater fra kreftpasienter sammenlignet med kontroller. Barer representerer medianverdier.
En høy β-TG nivå i kombinasjon med lav PF4 nivå i PECT plasma er en indikasjon på in vivo blodplateaktivering. Vi klarte ikke å vise en slik in vivo plateaktivering i våre pasienter med kreft, som β-TG i PECT plasma ikke viser en økning uavhengig av økningen i PF4.
Diskusjoner
Vår studie viser at «ekte» sirkulerende nivåer av VEGF, som bestemmes av målinger i PECT plasma, er lav i de fleste pasienter med metastatisk kreft og at de ikke skiller seg vesentlig fra sirkulerende VEGF nivåer i kontroller. Den forhøyede VEGF nivåer i citratplasmaprøver korrelerer med PF4, en markør for ex vivo plateaktivering, noe som tyder på at utslipp av VEGF fra blodplater under innhøstingen prosedyren er ansvarlig for VEGF nivåer i disse prøvene. I tillegg observerte vi at de enkelte blodplater hos kreftpasienter har en to-fold høyere innhold av VEGF sammenlignet med friske kontroller. Våre funn viser at VEGF-nivåer i blodprøver er svært avhengig av fremgangsmåten for innsamling og blodplate-VEGF innhold, og spørsmålet relevansen av «sirkulerende» VEGF som en biomarkør. Våre resultater utelukker ikke at kunstig forhøyet VEGF nivåer i citratplasmaprøver, som et kombinert mål på plate activatibility og blodplater VEGF innhold, kan ikke være en meningsfull surrogatmarkør for visse aspekter av tumorbiologi.
En markert økning i plasma VEGF nivåene har blitt observert i ulike typer kreft ansette ulike innsamlings- og bestemmelsesmetoder [11]. En rekke studier har rapportert en sammenheng mellom platetall og serum VEGF [24], [25], og høyere serum VEGF nivåer per plate hos kreftpasienter [26], [27]. Dette er i tråd med våre funn og kjent funksjon av blodplater som en viktig reservoar for VEGF. Blodplatederivert VEGF kan ha en viktig patologisk rolle i kreft på grunn av trombin-indusert blodplateaktivering og påfølgende lokal frigjøring av VEGF, indusere vaskulær permeabilitet, endotel-celleaktivering og angiogenese, fremme koagulasjon og kreft formidling [4], [28] – [30 ].
i denne studien, evaluert vi to ulike metoder for plasma samling for VEGF måling hos friske kontroller og kreftpasienter. Virkningen av bruken av en årepresse og samling medium (citrat versus PECT) på VEGF-nivåer ble påvist hos friske kontroller og kreftpasienter. Ingen signifikante forskjeller ble påvist i PECT VEGF nivåer mellom friske kontrollpersoner og ikke-RCC kreftpasienter.
I RCC pasienter, PECT VEGF nivåene var signifikant høyere sammenlignet med kontroller, noe som tyder på at disse pasientene VEGF er virkelig forhøyet i sirkulasjon. RCC er preget av høy intra-tumor VEGF produksjon av homozygot mutasjoner i von Hippel-Lindau tumorsuppressorgenet med påfølgende ubegrenset aktivitet av hypoksi induserbar faktor 1α (HIF1α) forårsaker høyt VEGF transkripsjon [20] – [26]. I mange av disse pasientene, de andre cellene i kroppen er heterozygot for mutasjonen VHL. Disse genetiske aspektene kan forklare hvorfor RCC-pasienter har forskjellige sirkulerende VEGF-nivåer enn de ikke-RCC-pasienter ble studert.
Våre funn er i tråd med den selektive suksessen av anti-VEGF-tilnærminger i behandling av RCC forhold til andre typer av kreft [31]. Faktisk bevacizumab (Avastin, Genentech, South San Francisco, California) et antistoff som binder seg til alle isoformer av menneskelig cVEGF [32] ga en signifikant forlengelse av tid til sykdomsprogresjon sammenlignet med placebo hos pasienter med RCC [33]. Dette i motsetning til de fleste andre tumortyper, hvor bevacizumab er enten ikke er effektiv eller hadde kun signifikant antitumor-effekt når de brukes i kombinasjon med kjemoterapi i stedet for som monoterapi (opptre mer som kjemoterapi-enhancer) [34]. Den enkle forklaringen på klinisk relevant aktivitet av bevacizumab som monoterapi i RCC kan være spesifikke roller defekt hypoksisk signalering og VEGF overekspresjon i patogenesen av disse svulstene.
Vi observerte at in vitro plateaktivering under innsamlingen Ordningen bidrar til høyere citratplasmasammenslåing VEGF nivåer. Dette ble demonstrert ved høy frigjøring av PF4 fra blodplater i citrat i forhold til PECT plasma, og den signifikant positiv korrelasjon mellom PF4 og VEGF-nivået i de enkelte citratplasmaprøver. De to-fold høyere nivåer av PF4 i PECT plasma hos kreftpasienter sammenlignet med kontrollene tyder på at også med den optimale innsamlingsmetode noen plateaktivering fortsatt skjer, men enda viktigere dette viser at blodplater hos kreftpasienter blir lettere aktivert enn blodplater fra friske kontroller .
i tråd med andre studier viste vi at plate VEGF-innholdet er høyere hos kreftpasienter [26], [27], [35]. I lys av våre funn i PECT plasma, tyder dette på at ex vivo frigivelse av VEGF med blodplater er endret i kreftpasienter, både på grunn av en økning i blodplate VEGF-innhold, så vel som til en høyere activatibility av blodplater hos kreftpasienter. Høyere blodplate-VEGF innholdet kan stamme fra øket lasting i benmargen eller resulterer fra en VEGF-fangende funksjon av blodplater [6], [35], [36]. En slik fjernende funksjon vil tjene til å fjerne overskudd av VEGF, som produseres lokalt i tumorvev, fra sirkulasjonen. Det er bemerkelsesverdig at i begge pasientgrupper våre økningen i blodplate-VEGF-innholdet var omtrent to ganger sammenlignet med kontroller, til tross for den mye høyere VEGF-nivåer i plasma fra PECT RCC-pasienter. Derfor, hvis blodplater virkelig har en spylefunksjon for VEGF, i RCC denne scavenging funksjonen ser ut til å mislykkes på grunn av for høy VEGF produksjon, som fører til sirkulerende VEGF. I tillegg, i motsetning til sirkulerende fri VEGF, VEGF kan innhold i blodplater være et meningsfylt interessant potensial biomarkør for VEGF og /eller angiogenese aktivitet i kreftpasienter, som trenger videre studier.
Som konklusjon, frie VEGF nivåer er lav eller fraværende i sirkulasjonen i de fleste kreftpasienter, med unntak av RCC, en krefttype med overdreven VEGF produksjon på grunn av en spesiell genetisk defekt. Citrat VEGF-nivåer reflekterer ikke selve sirkulerende VEGF-nivåer, men er et resultat av ex vivo blodplateaktivering og påfølgende VEGF-frigjøring fra blodplater som har en øket VEGF-innhold hos kreftpasienter. Forhøyede citrate VEGF nivåer i kreftpasienter, som har mye blitt brukt som en biomarkør for tumor angiogenese, er forårsaket av gjenstander og endret blodplate atferd knyttet til systemisk sykdom.
Takk
Vi står i gjeld til fru MA Weijne og Mrs WF Kopatz for hjelp og samarbeid; Professor Dr. H.R. Buller for kritisk leser dette manuskriptet før innlevering, og til pasienter og frivillige inkludert i studien for deres tillit og støtte.
