Abstract
Aberrant mikro RNA (miRNA) uttrykk har vært innblandet i patogenesen av kreft. Nyere studier har vist at MIR-17-92 klyngen er overuttrykt i mange typer kreft. Det onkogene funksjon av modent mirnas kodet for av MIR-17-92 klyngen har blitt identifisert fra 5′-arm av seks forløpere. Imidlertid er funksjonen til mirnas fremstilt fra 3′-arm av disse forløpere er ukjent. Den foreliggende undersøkelse viser at MIR-17 * er i stand til å undertrykke kritiske primære mitokondrielle antioksidant enzymer, slik som mangan superoksyd-dismutase (MnSOD), glutation peroksidase-2 (GPX2) og tioredoksinreduktase-2 (TrxR2). Transfeksjon av MIR-17 * inn i prostatakreft PC-3-celler reduserer nivået av de tre antioksidant proteiner og aktivitet av luciferase reporter betraktelig under kontroll av MIR-17 * bindende sekvenser lokalisert i de 3′-utranslaterte regioner av de tre målgener . Disulfiram (DSF), en dithiolcarbomate medikament vist seg å ha en anticancer virkning, induserer nivået av modne MIR-17 * og celledød i PCA-celler, som kan dempes ved transfeksjon av antisense MIR-17 *. Økende MIR-17 * nivå i PC-3 celler ved en Tet-on basert betinget uttrykk system markert undertrykker sin tumorigencity. Disse resultatene tyder på at Mir-17 * kan undertrykke tumorigenicity av prostata kreft gjennom hemming av mitokondrie antioksidant enzymer
Citation. Xu Y, Fang F, Zhang J, Josson S, St. Clair WH, St. Clair DK (2010) MIR-17 * Undertrykker tumorigenitet av prostatakreft ved å hemme MITOKONDRIELLE antioksidant enzymer. PLoS ONE 5 (12): e14356. doi: 10,1371 /journal.pone.0014356
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 24 juli 2010; Godkjent: 20 oktober 2010; Publisert: 22.12.2010
Copyright: © 2010 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend CA115801 til William H. St. Clair og gi CA 049 797 til Daret K. St. Clair. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Micro RNA (miRNA), ~22 nukleotid RNA-molekyler som vanligvis undertrykke oversettelsen av mål messenger RNA, er involvert i ulike aspekter av physiogenesis og patogenesen [1] – [2]. Mir-17-92 cluster koder seks mirnas, inkludert MIR-17, MIR-18a, MIR-19a, MIR-20a, MIR-19b-1, og MIR-92, som er forsterket i flere typer kreft vev enn i tilsvarende normale vev [3] – [5]. Proto-onkogenet c-MYC opp-regulerer transkripsjonen av MIR-17-92 klynge og fører til nedregulering av E2F1 ved MIR-17 [6], av PTEN ved MIR-19 [7], og av RB1 av speil 20a [8], som tyder på at MIR-17-92 fungerer som et onkogen faktor. Til dags dato er de fleste av mirnas identifisert som å ha evnen til å forandre fenotype og utvikling av kreft som genereres fra den 5 «arm av miRNA forløpere. Men produksjon og funksjon av 3 «arm miRNA (miRNA *) forblir unnvikende.
Deregulering av Redox status er involvert i en rekke pathogeneses inkludert kreft. Reaktive oksygenforbindelser (ROS) som genereres fra oksygen metabolisme er avgiftet av flere antioksidanter trasé [9]. Mitokondrie antioksidant enzymer, inkludert mangan superoksyd-dismutase (MnSOD), glutation-avhengige peroksydase (GPX) og thioredoxin- avhengige peroksydase (TrxR2), omfatter et første forsvarssystemet i mitochondria og er avgjørende for avgiftning mot ROS [10] – [12]. En konsekvens av det høye metabolismen av raskt voksende kreftceller er den raske dannelse av cellulær ROS. Kreftceller krever derfor en høy antioksidantforsvar til å takle høye nivåer av ROS produksjon [13], [14]. Dermed er selektiv hemming av antioksidantsystemer et alternativ for kreft intervensjon.
Prostatakreft (PCA) er en vanlig sykdom i nordamerikanske menn. Fordi PCa utvikler et kastrerings-resistent fenotype, er nivåene av antioksidant proteiner øket og relatere til å skaffe kapasiteter, slik som selvforsynte vekst, redusert apoptose, vedvarende angiogenese, økt invasjon og metastase, samt kreftcelle resistens mot behandling [15 ] – [17]. I denne studien bruker vi fire komplementære tilnærminger for å identifisere meklere for svulsten undertrykke effekten av MIR-17 *. Resultatene viser at undertrykkelse av mitokondrielle antioksidantenzymer er en mekanisme for tumor suppressor funksjon av MIR-17 *. Dette er den første rapporten som avslører koblingen mellom oksidativt stress og tumor suppressor rollen miRNA produsert fra 3 «arm av MIR-17-92 klynge.
Resultater
MIR-17 * undertrykker tre mitokondrielle antioksidant proteiner
En rekke studier har rapportert at Mir-17 er sterkt uttrykt i maligne svulster inkludert PCA men nivået på sin partner, MIR-17 *, er vanligvis lav i kreft [18 ]. Dette bevis spår at nivåene av MIR-17 og MIR-17 * er differensielt regulert og at forholdet mellom de to mirnas kan være viktig for regulering av ulike sett av målgener ved tumorigenesis. Uttrykk for både mirnas i ulike prostataceller, inkludert normal epitel, stromal, virustransform, androgen-responsive og androgen-uavhengig PCA celler, ble kvantifisert ved real-time RT-PCR. Nivået av MIR-17, og forholdet mellom MIR-17 til MIR-17 * i PCA-celler var høyere enn nivåene i ikke-kreftceller (Fig. 1A). Ved å søke miRbase, fant vi at MnSOD, Gpx2 og TrxR2, tre viktige mitokondrielle antioksidant proteiner som er avgjørende for avgiftning av O
2
.- og H
2o
2, er potensielle mål fra Mir -17 *. For å kontrollere at Mir-17 * er i stand til å undertrykke antioksidant proteiner, modne MIR-17 * ble transfektert inn i PC-3 celler, som har et lavt nivå av endogen MIR-17 *. Ekspresjonen av de tre antioksidant proteinene ble redusert ved den transfekterte MIR-17 * på en doseavhengig måte. Mens transfeksjon av kontroll miRNA og anti MIR-17 * hadde ingen effekt på målene (Fig. 1B), oksidativt stress stimuli som cytokiner er i stand til å indusere uttrykk for
SOD2
gen gjennom aktivering av NF -κB signalveien [19]. Transfeksjon av MIR-17 * betydelig undertrykt TNFa-indusert
SOD2
uttrykk på en doseavhengig måte (Fig. 1C). For å bekrefte at reduksjonen av antioksidanter proteiner ved MIR-17 * medieres via translasjonsforskning undertrykkelse, ble 3′- utranslaterte regioner, inkludert den antatte MIR-17 * rettet mot områder av gener som koder for de tre antioksidant enzymer, klonet nedstrøms reporter genet. Et kjøretøy og en MIR-377 rettet mot området ligger i den 3’untranslated regionen i
SOD1
genet ble inkludert som kjøretøykontroll og nonself negativ kontroll. Som vist på fig. 1D, det klonede MIR-17 * rettet mot sekvenser er nødvendige for undertrykkelse av reporter responser ved transfektert MIR-17 *.
A, nivåene av MIR-17 og MIR-17 * uttrykt ved PCA og kontroll celle linjer ble målt ved hjelp av RT-PCR. Forholdet mellom MIR-17 til MIR-17 * i hver cellelinje blir presentert. B og C, transfeksjon av MIR-17 * i PC-3-celler for å bekrefte dets funksjon i undertrykke ekspresjonen av antioksidanter proteiner og avtagende TNF-mediert induksjon MnSOD. D, undertrykkende effekt av MIR-17 * på antioksidanter proteiner er anslått av kvantitativ luciferase reporter analysen. RNU24 og β-actin ble brukt som interne kontroller for å normalisere miRNA nivåer (A), protein nivåer (B og C). Bilder ble normalisert med den interne kontrollen og deretter normalisert ved å Prec (A), ved kontroll miRNA (B), og på ingen TNF behandling (C). β-gal-aktivitet ble brukt til å normalisere luciferase-rapportør aktiviteter (D). Tre prøver (n = 3) ble brukt i forsøkene og folde endringer i Western blot er indikert. * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger, sammenlignet med kontrollene: Prec (A), tak miRNA (B) og (D), og ubehandlede prøver (C)
.
DSF induserer MIR-17 * ekspresjon
DSF er et dithiolcarbomate stoff som har vist seg å undertrykke kreft fenotyper ved å indusere den apoptotiske reaksjonsvei [20]. Vi fant at DSF hemmer de tre antioksidanter proteiner i PCA celler. Etter PC-3 og DU-145-celler ble behandlet med DSF i 24 timer, reduksjon av nivåene av antioksydant-proteinene korresponderte signifikant med konsentrasjonene av DSF (Fig. 2A). Imidlertid mRNA-nivåene av antioksydant-gener ble ikke endret i DSF-behandlede celler (Fig. 2B). Interessant, RT-PCR og Northern blot viser at DSF induserer MIR-17 *, men har ingen effekt på uttrykk nivåer av MIR-17 (Fig. 2C). Induksjon av MIR-17 * av DSF blir ytterligere bekreftet av reporter responser som er regulert av MIR-17 * targeting sekvenser (Fig. 2D). Videre, for å verifisere at den negative effekten av DSF på ekspresjonen av antioksydant-proteiner er mediert ved induksjon av MIR-17 *, ble PC-3-celler transfektert med antisense HSA-MIR-17 * og deretter DSF behandling. Resultatene tyder på at den antisense HSA-MIR-17 * er i stand til å redusere DSF virkning (fig. 2E). Disse resultater antyder at reduksjonen av antioksydant-proteiner ved DSF forekommer, i det minste delvis, gjennom MIR-17 * -mediert translasjonell undertrykkelse.
A, PCA-celler ble behandlet med DSF ved indikerte konsentrasjoner. Nivåene av de tre antioksidant proteiner ble målt ved hjelp av Western blot. B, mRNA-nivåer av de tre antioksidant gener ble kvantifisert ved RT-PCR. C, nivåene av MIR-17 og MIR-17 * i DSF-behandlede celler ble kvantifisert ved RT-PCR. Mir-17 * nivåer ble bekreftet ved Northern blot. D, effekten av DSF-indusert MIR-17 * på rapportør responser ble bestemt. E, etter transfektert anti-MIR-17 *, PC-3 celler ble behandlet med DSF. Effekten av anti-MIR-17 * på å restaurere antioksidant proteiner ble kvantifisert ved Western blot. β-aktin ble benyttet til å normalisere nivåer av proteiner (A), (E), og nivåene av mRNA (B). De fold endringer er angitt. RNU24 ble anvendt for å normalisere nivået av MIR-17 og MIR-17 * (C). β-gal-aktivitet ble brukt til å normalisere luciferase-rapportør aktiviteter (D). Tre prøver (n = 3) ble anvendt i eksperimentene (med unntak av Northern blot). * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger i forhold til ingen dsf behandling (A), (C), (D), og sammenlignet med ingen DSF og ingen miRNA transfekterte prøver (E)
MIR-17 * induserer celledød i PCA celler
for å avgjøre DSF giftighet for PCA celler, ble PC-3 og DU-145 celler behandlet med DSF og dyrket frem kolonier dannet. På grunn av at celletettheten som brukes for kolonidannelse analyse var 100 ganger mindre enn tettheten er vist på fig. 2, konsentrasjonsområdet DSF ble redusert 100 ganger i kolonidannelse eksperimenter. Resultatene av overlevelsesfraksjon indikerer at PCA-celler er ekstremt følsomme for dsf. Mer enn 95% av cellene ble drept ved behandling med 1 uM DSF (fig. 3A). For å kontrollere om Mir-17 * bidrar til DSF-mediert celledød, ble PC-3 celler transfektert med MIR-17 * og anti-MIR-17 * før DSF behandling. Colony overlevelsesanalyse viser at Mir-17 * øker giftigheten av DSF, mens anti-MIR-17 * er i stand til å redde celler fra DSF effekt (fig. 3B). For ytterligere å bekrefte at reduksjon av antioksidanter proteiner er en viktig årsak til toksisitet av MIR-17 *, PC-3 celler ble ko-transfektert med MIR-17 * og cDNA ectopically uttrykker de tre antioksidant proteiner som ikke er utsatt for speil 17 * regulering. Cytotoksisitet analyse ved trypan blå eksklusjon analysen viser at ekspresjon av de tre antioksidant gener redder celleoverlevelse fra toksisitet av MIR-17 * (fig. 3C). De tilsvarende nivåer av antioksidant proteinene i de transfekterte PC-3-celler ble verifisert ved Western blot (Fig. 3D).
A, PCA-celler ble behandlet med DSF ved de indikerte konsentrasjoner for kolonien overlevelsesanalyse. De dannede kolonier ble tellet og plottet på en log skala. B, PC-3 celler ble transfektert med MIR-17 * og kontroll mirnas før DSF behandling. Virkningene av MIR-17 * og antisense MIR-17 * på kolonien overlevelse ble bestemt. C og D, MIR-17 * ble ko-transfektert med konstruksjoner for ekspresjon av de tre antioksidant proteiner. De overuttrykte antioksidant proteiner ble bekreftet ved Western-blot med β-aktin normalisering og brette endringer er indikert (D). Beskyttende virkninger av de transfekterte antioksidant enzymer på de cellene mot MIR-17 * toksisitet ble bestemt ved en trypan blå eksklusjon assay (C). Tre prøver (n = 3) ble anvendt i eksperimentene. * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger i forhold til å kontrollere miRNA prøver (B) og i forhold til kjøretøykontrollprøver (C), (D)
speil. 17 * undertrykker tumorigenitet av PCa
for å bestemme effekten av MIR-17 * på tumorvekst, ble sekvensen av modne MIR-17 * klonet inn en Tet-on baserte lentiviral uttrykk vektor. Lentivirus uttrykker MIR-17 * ble transducted inn i PC-3-celler, og en stabil cellelinje med Tet-on basert RFP-ekspresjon ble identifisert. Effekten av MIR-17 * på de tre antioksidant proteiner etter Tet-on induserbare forhold ble bekreftet av vestlige blotter (fig. 4A). En mus xenograft tumormodell ble benyttet for å evaluere effekten av MIR-17 * på tumorvekst. Når klonen ble subkutant injisert i nakne hannmus, uttrykk for MIR-17 *
in vivo
ble indusert ved administrering Dox inneholder vann. En bæremiddelkontroll ble inkludert for å kontrollere den toksiske effekten av Dox. Som vist på fig. 4B, gjennomsnittlig tid for svulster til å nå 500 mm
3 i bilen kontroll og Mir-17 * uten Dox kontrollgruppene er 12 til 13 dager (kjøretøykontroll uten Dox, 12,2 ± 2,1; kjøretøy kontroll med Dox, 12,3 ± 2.8, og Mir-17 * uten Dox, 12,6 ± 2,8). Spesielt, til antall dager for MIR-17 * med Dox gruppe nå 500 mm
3 tumorstørrelse er 24 ± 4,9, som er dobbelt så lenge som kontrollgruppene. For kontinuerlig å måle tumorvekst, ble musene i kontrollgruppen fortsatte i 18 dager etter injeksjon når tumorstørrelsen nådde den maksimalt tillatte størrelse på 2000 mm
3. De tumor vekstratene er vist på fig. 4C viser at tumorveksten i MIR-17 * med Dox gruppen ble betydelig forsinket sammenlignet med tumorvekst i kontrollgruppene. For å verifisere om uttrykket av MIR-17 * gir reduserte antioksidanter proteiner i MIR-17 * uttrykt tumorvev, nivåene av MIR-17 * og aktiviteter av antioksidant enzymer i tumorvev ble kvantifisert. Svarende til de økte nivåer av MIR-17 * i den Dox-behandlede gruppen, ble aktivitetene til de tre antioksidantenzymer betydelig redusert sammenlignet med den ubehandlede gruppen (fig. 4D). Tatt sammen, disse resultater viser at ekspresjon av MIR-17 * i PC-3-celle reduserer tumordannelse, i det minste delvis, ved å inhibere mitokondriefunksjon antioksidant. Dette resultatet tyder på at i motsetning til den oncogene effekt av MIR-17, MIR-17 * spiller en tumorundertrykkende rolle i PCA-celler.
A, og-MIR-17 * ble klonet i en Tet-on lentiviral vektor og stabilt transected i PC-3 celler. Klonen ble testet ved RFP screening henhold Dox- induktive betingelser og deretter bekreftet ved å måle ekspresjonen av de tre målgener ved hjelp av Western blot med β-aktin normalisering. B og C, den genererte klon ble injisert i hann nakne mus for å bestemme dens tumorgenisitet. Bilen kontroll var inkludert. Antall dager som kreves for tumorstørrelse for å nå 500 mm
3 er vist i (B) og beregnede tumorvekstrater i (C). D, totalt RNA og proteiner ble isolert fra tumorvev og nivået av MIR-17 * og tilsvarende aktiviteter av de tre antioksidant proteiner ble kvantifisert. Tre prøver (n = 3) ble anvendt ved testing av den genererte MIR-17 * induserbar klon (A). Ni kjøretøy kontrolldyr (n = 9) med eller uten DOX behandling og atten MIR-17 * uttrykt dyr (n = 18) med eller uten DOX behandling ble anvendt for å teste effekten av MIR-17 * på tumorvekst (B), (C), (D). * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger i forhold til uten DOX kontroll (A) og (C)
Diskusjon
miRNA generelt fungerer som. en posttranskripsjonelt repressor, som antas å være en viktig mekanisme for genregulering. miRNA biogenesis inkluderer kanoniske primære miRNA transkripsjon, drosha /dicer-mediert skillelinjer, og Strand fortrinnsrett utvalg gjennom argonaute (siden) proteiner [21]. Når en tråd er valgt for undertrykkelse av mål, er dens partner tråden antas å bli degradert [22]. Imidlertid har nyere studier påvist både MIR-17 og MIR-17 * i mange typer menneskelig vev [23]. I alle cellelinjene som ble testet, resultatene viser at MIR-17 * er til stede på et lavere nivå enn MIR-17. Imidlertid nivåene av begge mirnas er høyere i PCA-celler enn i kontrollcellene (data ikke vist). Siden nivået av mir-17 er høyere enn MIR-17 *, forholdet mellom MIR-17 til MIR-17 * i PCA-celler økes, noe som tyder på at MIR-17 er en fortrinnsvis valgt tråd, selv om begge MIR-17 og MIR -17 * forløpere er transkribert. Nylige studier har vist at AGO1 medierer miRNA produksjon i Drosophila, mens AGO2 er forbundet med miRNA * produksjon [24]. Men den nøyaktige mekanismen som AGO regulerer miRNA biogenesis må være bestemt på å avdekke fortrinnsrett opphopning av miRNA tråder under forskjellige forhold.
Våre data viser at Mir-17 * undertrykker tumorigenicity av PCA celler, noe som tyder på at funksjonen av MIR-17 * er motsatt av onkogene funksjon av MIR-17. Uttrykk for Mir-17-92 klyngen er strengt regulert i respons til inter og ekstracellulære miljøer. Transkripsjon av denne klyngen er oppregulert av c-myc henhold oksidative forhold [25] og nedregulert av p53 under hypoxi forhold [26]. Interessant, DSF, en dithiolcarbomate, induserer bare nivået av MIR-17 * og ikke MIR-17. Dette selektiv induksjon er konsistent med den tumorundertrykkende virkning av MIR-17 * og er i overensstemmelse med tidligere funn at DSF induserer apoptose i kreftceller [20]. Tatt sammen tyder disse resultater på at DSF kan være effektivt som et anticancermiddel, blant annet ved induksjon av MIR-17 *.
miRNA-baserte gen undertrykkelse er ansett for å være en viktig regulator kontrollere celle skjebne. Det er imidlertid et komplisert reguleringssystem fordi man gen kan reguleres ved flere mirnas og en miRNA har mange forskjellige mål. Generelt er virkningen av miRNA på genregulering er avhengig av bestemte vevstyper, utviklingsstatuser eller stimuli. Således er identifikasjon av miRNA mål kritisk for å definere de virkelige funksjoner av miRNA under fysiologiske eller patologiske tilstander. Vår studie viser at Mir-17 * er en negativ regulator for tre viktige antioksidant enzymer lokalisert i mitokondriene. Disse antioksidant enzymer er viktige komponenter i det primære antioksidantsystem, og de jobber sammen for å trygt fjerne ROS generert i mitokondriene. Inhibering av disse proteinene bør føre derfor til en opphopning av ROS, noe som resulterer i cytotoksisitet. Våre funn tyder på en roman terapeutisk tilnærming for å forbedre celledød ved MIR-17 * målgruppe. I tillegg kan en nylig undersøkelse viste at MIR-17 er i stand til å slå av HIF-1α ekspresjon, en transkripsjonsfaktor for opprettholdelse av redoks-homeostase og celleoverlevelse etter hypoksiske betingelser [27]. Sammen utgjør disse funnene spår at forholdet mellom MIR-17 til MIR-17 * kan ha en viktig rolle i reguleringen av mobilnettet redoks status.
Selv om Warburg effekten, en høy grad av aerob glykolyse i tumorer, har blitt observert i forskjellige typer kreft, kreft har funksjonell mitokondrier og mitokondriell respirasjon er nødvendig for kreftcelleformering [28]. Videre, kreftcellene har høye nivåer av ROS og også uttrykker høye nivåer av antioksidant proteiner for å avgifte de forhøyede forekomst av ROS generasjon [29]. For eksempel er MnSOD uttrykkes på et høyt nivå i aggressive PCA-celler, noe som er viktig for beskyttelse av PCA-celler mot strålings-induserte ROS [30]. Dermed utløser pro-apoptotiske signalveier ved å målrette mitokondriene antioksidant enzymer kan også anses som en anti-kreft terapeutisk strategi. Våre resultater, som viser at Mir-17 * hemming av mitokondrie antioksidanter proteiner undertrykker tumorigenicity av PCA celler in vivo, gi eksperimentelle bevis for proof-of-concept som miRNA * kan fungere som en tumor suppressor ved hemming av mitokondrielle forsvarskapasiteter.
Materialer og metoder
Cell kultur og celletoksisitet analyse
PREC, menneskelige prostata epitelial primære celler (Cambrex Corp.), og PRSC, menneskelige prostata stromal celler (Clonetics), ble dyrket i PrEBM medium (Lonza). PZ-HPV-7, HPV-18-transformerte humane prostata epiteliale celler (American Type Culture Collection, ATCC) ble dyrket i keratinocytt-SFM-medium (Invitrogen). Humane epitel karsinomceller LnCap, DU-145 og adenokarsinom PC-3-celler (ATCC) ble dyrket i RPMI-medium (Invitrogen) inneholdende 10% FCS (Hyclone). Kolonidannelse assay ble anvendt for å kvantifisere toksisitet av MIR-17 * til PCA-celler sådd ut i 6-brønns plater ved lave densiteter. For å indusere MIR-17 * ekspresjon, ble PCA-celler behandlet med DSF ved et konsentrasjonsområde på fra 0 til 1 uM i 24 timer. Koloniene ble vasket med 1 x PBS og farget med krystallfiolett fargestoff. Den overlevende fraksjon ble beregnet som forholdet av antall kolonier dannet til antall celler effektivt belagt. Trypan blå eksklusjon assay ble anvendt for å bestemme den beskyttende effekt av økt antioksidantenzymer på giftigheten av MIR-17 *. Cellene ble ko-transfektert med MIR-17 * og ekspresjonskonstruksjoner for de tre antioksidant gener. Etter dyrking i 48 timer ble de transfekterte cellene farget med 0,4% trypan-blått fargestoff og tellet ved hjelp av en Vi-celle cellenes levedyktighet analysator (Beckman Coulter).
Micro RNA-ekspresjon rapportøranalyse
for å teste om Mir-17 * regulerer uttrykk av målgener ble 3′-utranslaterte regioner av målgener inneholder antatte MIR-17 * bindingssteder klonet mellom
Sac
jeg og
Hind
III områder av pMIR-reporter vektor (Ambion). De genererte miRNA uttrykket reporter konstruksjonene ble ko-transfektert med β-gal intern kontroll vektor (Ambion) i PC-3 celler ved hjelp lipofektamin (Invitrogen). Etter dyrking i 36 timer, ble cellene høstet; luciferaseaktivitet ble målt ved anvendelse av et luciferase-assay kit (Promega); og β-gal-aktivitet ble målt ved anvendelse av klorfenol rød-a-D-glactopyranoside mononatrium substrat (Roche Molecular Biochemicals). Relative luciferasepreparater responser ble anslått av β-gal-normalisert luciferase aktivitet.
Uttrykk av MIR-17 *
For å øke MIR-17 * nivå i PCA celler, Mir-17 * molekyler og kontroller (Ambion) ble transfektert inn i cellene ved hjelp av oligofectamine (Invitrogen). For å indusere MIR-17 * ekspresjon i PCA-celler, ble cellene behandlet med disulfiram (Sigma) ved en konsentrasjon fra 0 til 100 uM i 24 timer. Å stabilt uttrykker Mir-17 * i PCA celler, ble en moden MIR-17 * sekvens spredt av drosha og dicer kutteseter klonet inn en Tet-on induserbar lentiviral vektor, TRIPZ (Open Biosystems), ved hjelp av Xho og EcoRI nettsteder. Sekvens av innsatsen som inneholder Mir-17 * (vist ved en understreking) er CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGAACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACAAGTGCCTTCACTGCAGTCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC. Den klonede MIR-17 * ble pakket ved hjelp av en translentiviral pakkesystem (Åpne Biosystems). MIR-17 * lentivirus ble konsentrert og titrert før transduksjon inn i cellene under 2 ug /ml puromycin selektive betingelser. Mir-17 * klonen ble videre valgt av Tet-on induserbar uttrykk for en rød fluorescens protein (RFP) tag bruker media som inneholder 1 mg /ml doksycyklin (Dox). Den stabile klonen ble verifisert ved screening uttrykket av målene ved hjelp av Western blot.
Uttrykk av antioksidant enzymer
For å redde celle overlevelse fra toksisitet av MIR-17 *, cDNA konstruerer for uttrykk av de tre antioksidanter proteiner ble transfektert inn i PC-3 celler før DSF behandling. De ectopically uttrykte antioksidanter proteiner blir ikke påvirket av har-MIR-17 *, fordi cDNA-konstruksjoner ikke har 3′-untranslational regioner hvor bindingsstedene er identifisert for har-MIR-17 * bindende.
dyr
Fire uker gammel mannlig NCRNU (nu /nu atymiske nakne) mus ble kjøpt fra Taconic (Hudson, New York). 10
6-celler blandet med Matrigel (BD Biosciences) ble injisert inn i den høyre flanken av musene. De injiserte mus ble delt inn i to grupper: to dager før injeksjon, en gruppe av musene begynte å drikke vann inneholdende 2 mg /l doksycyklin og kontrollgruppen fortsatte å drikke vanlig vann. Tumorvolumer ble beregnet ved hjelp av en standard formel (A × B
2 × 0,52, A og B representerer diagonal svulst lengder)
Western blot
Proteiner ble hentet fra dyrkede celler. og tumorvev som beskrevet tidligere (11) og 100 ug av ekstraherte proteiner ble underkastet elektroforese på en 8% (vekt /vol) SDS-PAGE-gel, overført til en nitrocellulosemembran, og deretter inkubert med primære antistoffer mot MnSOD (Upstate Biotech). , Gpx2 (Abcam), TrxR2 og β-aktin (Santa Cruz Biotech). Western blot ble visualisert ved hjelp av en forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).
Real-time PCR (RT-PCR)
For å berike miRNA i RNA forberedelse, total RNA ble isolert fra de dyrkede celler og tumorvev ved hjelp av en Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion). For kvantifisering av MIR-17 og MIR-17 *, ble RNA analysert ved hjelp av en TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit med interne kontroller RNU6B, RNU24 og RNU48 (Applied Biosystems). For å kvantifisere mRNA nivåer av Mir-17 * målgener ble RNA analysert ved hjelp av TaqMan revers transkripsjon Reagenser (Applied Biosystems) og RT-PCR med Universal ProbeLibrary Set (Roche Applied Science). RT-PCR ble utført i en TaqMan Universal PCR Master Mix ved hjelp av en LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science).
Northern Blot
Nivået på MIR-17 * ble kvantifisert ved hjelp av en miRtect-IT miRNA Merking og Detection kit (USB Corp.) i henhold til produsentens protokoll.
Enzymaktivitet aktivitet~~POS=HEADCOMP analysen
MnSOD aktiviteter ble målt ved nitro tetrazolium (NBT) -bathocuproin sulfonat (BCS) reduksjon hemming metode. Natriumcyanid (2 mM) ble brukt til å inhibere Cu /ZnSOD aktivitet [31]. GPX-aktivitet ble målt ved anvendelse av en reaksjonsblanding bestående av 0,2 mM H
2o
2, 1.0 mM GSH, 0,14 U av glutation reduktase (GR), 1,5 mM NADPH, 1,0 mM natriumazid og 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) og 1 mg /ml supernatant protein [32]. TrxR aktivitet ble målt ved bruk av tioredoksinreduktase Activity Assay Kit (Redoxica) i henhold til produsentens protokoll.
Statistiske data analyser
Flere uavhengige eksperimenter ble utført for hvert sett av data. Bilder i Northern blot og Western blot ble kvantifisert ved hjelp av Carestream Molecular Imaging-programvaren (Carestream Health Inc.). Statistisk signifikans ble analysert ved anvendelse av en enveis ANOVA og Tukey multiple sammenligningstest, etterfulgt av data analyse med Graphpad Prism.
