Abstract
Et protein isolert fra barken av
Crataeva tapia plakater (CrataBL) er både en Kunitz-type anlegg proteasehemmer og et lektin. Vi har bestemt aminosyresekvens og tre-dimensjonale strukturen til CrataBL, samt karakterisert sin utvalgte biokjemiske og biologiske egenskaper. Vi fant to forskjellige isoformer av CrataBL isolert fra den opprinnelige kilden, ulik i stillinger 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) og 97 (Leu /Ser). CrataBL viste forholdsvis svak hemmende aktivitet mot trypsin (K
IAPP = 43 pM), og var mer potent mot faktor Xa (K
IAPP = 8,6 uM), men var ikke aktivt overfor en rekke andre proteaser. Vi har bekreftet at CrataBL inneholder to glykosyleringsseter, og danner en dimer ved høy konsentrasjon. De høyoppløselige krystallstrukturer av to forskjellige krystallformer isoform II bekreftet β-trekløver fold av CrataBL og har vist tilstedeværelse av dimer som består av to nesten identiske molekyler gjør utstrakt kontakt (~645 Å
2). Konstruksjonen skiller seg fra de av de mest nær beslektede proteiner ved mangel på den N-terminale β-hårnål. I eksperimenter for å undersøke de biologiske egenskapene til CrataBL, har vi vist at tilsetningen av 40 uM av proteinet i 48 timer forårsaket maksimal veksthemming i MTT-analyse (47% av DU145-celler og 43% av PC3-celler). Den apoptose av DU145 og PC3 cellelinjer ble bekreftet ved strømningscytometri ved bruk av Annexin V /FITC og propidiumjodidfarging. Behandling med CrataBL resulterte i utgivelsen av mitokondrie cytokrom
c
og i aktivering av caspase-3 i DU145 og PC3 cellene
Citation. Ferreira RDS, Zhou D, Ferreira JG, Silva MCC , Silva-Lucca RA, Mentele R, et al. (2013) Crystal Oppbygging av
Crataeva tapia
Bark Protein (CrataBL) og dens effekt i Human Prostate Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (6): e64426. doi: 10,1371 /journal.pone.0064426
Redaktør: Enrique Pérez-Payá, Centro de Investigacion Principe Felipe og IBV-CSIC, Spania
mottatt: 17. desember 2012; Godkjent: 15 april 2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Ferreira et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bruk av APS ble støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences i henhold til kontrakt nr W-31-109-Eng-38. Forfatterne er takknemlige til kapper, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og São Paulo Research Foundation (FAPESP) (Prosess 09 /53766-5) for å gi økonomisk støtte. Dette prosjektet ble også støttet delvis av egenutført Research Program av National Institutes of Health (NIH), National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Et stort antall proteiner er karakterisert ved deres β-trekløver gangers [1]. Medlemmer av denne superaksje strukturelle trekk, men ikke nødvendigvis andre egenskaper og deres biologiske rolle kan være vidt forskjellige [2]. Fremtredende blant disse er plante protease-inhibitorer av Kunitz-typen, kalt Kunitz-P eller Kunitz-STI-inhibitorer [2], [3]. Disse proteinene primært inhiberer serinproteaser, selv om noen også hemmer cystein og asparagin proteaser [4]. Kunitz-P-inhibitorer er kjennetegnet ved molekylmasse på omtrent 20.000 Da (for hele proteinet eller et domene), lavt innhold av cysteinrester, og ett eller to reaktive steder som ligger til grunn av deres hemmende aktivitet. Imidlertid er noen strukturelt beslektede β-trekløver proteiner ikke proteaseinhibitorer i det hele tatt, men oppviser varierte andre egenskaper, for eksempel klorofyll binding [5], smaksmodifikasjon (miraculin) [6], binding til cytokin-reseptorer (IL-1) [7 ], ribosom forgiftning (ricin) [8] eller karbohydratbindende, eksemplifisert ved
Clitocybe nebularis
lectin, CNL [9].
Plante lektiner er proteiner som har minst en ikke-katalytisk domene som binder reversibelt og spesielt mono- eller oligosakkarider [10], [11]. På grunn av disse egenskaper, er slike proteiner blir brukt i karakterisering av glykokonjugater og i celle-overflate eller celle-celle-arkitektur studier [12], [13]. Et par proteaseinhibitorer viser også aktivitet lektin, et eksempel gitt av inhibitor isolert fra epidermis hos ål, kalt Eel-KPI-1 [14]. Troncoso et al. [15] isolert en hemmer med lektin egenskaper fra
Peltophorum dubium
frø som reduserer levedyktigheten til NB2 rotte lymfom celler.
Crataeva tapia plakater (også kjent som
crateva tapia
) tilhører kapersfamilien familien som finnes i det nordøstlige Brasil. Et protein fra
Crataeva tapia
bark har blitt renset ved hjelp reverseres miceller i isooktan [16] og gjennom kromatografiske prosesser [17]. Oppkalt CrataBL (
Crataeva tapia
Bark lektin), dette proteinet ble vist å ha noen spesifisitet for binding glukose og galaktose [17]. Et antall av sine biologiske egenskaper er blitt karakterisert, inkludert forsinkelse i dannelse av blodpropper ved å nedsette den indre vei av koagulasjonskaskaden, [18]. I tillegg ble CrataBL vist seg å utvise anti-inflammatorisk, analgetisk [19], insekticid [17], og anti-tumor [19] aktiviteter.
Prostatakreft er den vanligste kreft hos menn [20], med DU145 og PC3 er den mest omfattende studert prostatakreft cellelinjer som fungerer som
in vitro
modeller for kreftbehandling studier [21], [22], [23]. Prostatakreft er forbundet med et høyt nivå av ekspresjon av proteaser [24] og glykoproteiner [25], noe som gjør CrataBL en potensielt nyttig verktøy for studier som involverer prostatakreftcellelinjer, på grunn av sin kombinasjon av egenskaper som omfatter både protease-inhibering og karbohydratbindende.
i dette arbeidet har vi fastslått aminosyresekvensen og den tredimensjonale struktur av CrataBL og også undersøkt en rekke biokjemiske aktiviteter, sammenligner dem med egenskapene til andre medlemmer av denne superfamilie. Deretter, karakterisert vi effekten av CrataBL på vekst og stabilitet av human prostata cancer-cellelinjer.
Materialer og metoder
Isolering av CrataBL
Isolering av proteinet ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Araújo et al. [17]. Kort, 10% (w /v) ekstrakter fra
Crataeva tapia
bark ble fraksjonert med 30-60% ammoniumsulfat. Fraksjonen inneholdende proteinet ble dialysert mot 10 mM fosfatcitratbuffer pH 5,5 og satt på en kolonne av CM-cellulose ekvilibrert med den samme buffer. Adsorberte protein ble eluert med en ekvilibreringsbuffer som inneholder 0,5 M NaCl og innholdet i enkelt topp ble forelagt størrelse-utelukkelses-kromatografi på Superdex 75-kolonne, ekvilibrert i 0,15 M NaCl ved anvendelse av en ΔKTA renser (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Dette ble etterfulgt av høy ytelse væskekromatografi (HPLC) på en C18-kolonne, for å bekrefte homogeniteten til prøven. De elueringer ble overvåket ved 280 nm.
Protein konsentrasjon og karbohydrat analyser
Protein bestemmelse ble utført som beskrevet av Lowry et al. [26] ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som standard. Sukkerinnholdet av CrataBL ble bestemt ved fenol-svovelsyre-metoden for Masuko et al. [27], med mannose i konsentrasjoner på 2, 4, 6, 8, og 10 ug som en standard.
MALDI-TOF /MS-analyse
Molekylmassen av CrataBL ble analysert ved hjelp MALDI-TOF /MS. 1 mL CrataBL (2 mg /ml) ble tilsatt til 1 pl α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (10 mg /ml) matriseoppløsningen, flekket på en rustfri stål MALDI måleplate og tørket ved romtemperatur før analysering. Massespektra ble oppnådd med et Bruker Daltonics Micro LT instrument (Billerica, USA) som opererer i lineær, positiv ion-modus, som på forhånd er kalibrert med insulin, ubiquitin, cytokrom C, og myoglobin. For analyse av proteinet, ble massespektra ervervet ved hjelp av de følgende instrument parametere: puls ion ekstraksjon forsinkelse på 30 ns, ione-kilde spennings en, 20 kV, ione-kilde spennings to, 18,65 kV, og ione-kilde spennings linse 7,1 kV. For hver prøve ble massespektra ervervet ved å samle 50 laser skudd på 50% laser makt i m /z spekter av 8000-25000 Da.
Primær strukturen CrataBL
sekvensering av native protein ble utført ved Edman degradering [28]. Prøven ble redusert, alkylert, og deretter sendt til spalting med trypsin, chymotrypsin, Asp-N og Lys-C endopeptidaser (sekvense karakter, Roche, Tyskland). Fragmenter etter behandling med endopeptidaser ble renset på en 1 x 150 mm Jupiter Proteo 90A-kolonne (Phenomenex, Aschaffenburg, Tyskland) ved en strømningshastighet på 0,1 ml /min, ved bruk av en acetonitril-gradient (0-60%) sammen med 0,1% ( v /v) trifluoreddiksyre i 40 min. Sekvensering ble utført på en automatisk gassfase sequencer (492cLC, Applied Biosystems, Foster City, USA). De glykosylerte peptider ble analysert ved hjelp av massespektrometri for å bestemme molekylvekt av karbohydratenhetene. Sequence likheter ble vurdert med programmet BLAST mot NCBI protein databasen [29]. Sekvensene ble justert ved bruk av programmet MULTALIN [30].
enzyminhibering assays
Den hemmende aktivitet av CrataBL mot proteaser ble målt ved anvendelse av spesifikke kromogene eller fluorogene substrater i 96-brønners mikrotiterplater ved 37 ° C. Enzymene (human Faktor Xa, bovint trypsin, bovin chymotrypsin, humant plasmakallikrein (HuPK), porcin pankreatisk kallikrein (PoPK), human neutrofil elastase (HNE), humant plasmin, og papain) ble pre-inkubert med enten CrataBL eller med oppløsningsmiddel i 10 min. Reaksjonene ble initiert ved tilsetning av substrater, og den farge eller fluorescens ble overvåket kontinuerlig ved 405 nm ved bruk av et spektrofotometer (Packard, SpectraCount), eller ved 380/460 nm ved anvendelse av en Hitachi F-2000 spectrofluorimeter (Tokyo, Japan), henholdsvis, i 30 minutter og stoppet ved tilsetning av 50 ul 30% (v /v) eddiksyre. Enzymatiske aktiviteter ble analysert i de følgende buffere (sluttkonsentrasjoner): human faktor Xa (21 nM i 0,02 M Tris-HCl, pH 7,4 inneholdende 0,14 M NaCl, 5,0 mM CaCl
2 og 0,1% bovint serumalbumin, 0,57 mM Boc -Ile-Glu-Gly-Arg-AMC); bovint trypsin (40 nM i 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 inneholdende 0,02% (v /v) CaCl
2; 0,8 mM Bz-Arg-pNan); bovin chymotrypsin (88 nM i 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0; 0,8 mM Suc-Phe-pNan); HuPK (14,7 nM i 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 inneholdende 0,5 M NaCl, 0,4 mM H-D-Pro-Phe-Arg-pNan); PoPK (2,6 nM i 0,1 M Tris-HCl, pH 9,0, 0,16 mM HD-Val-Leu-Arg-pNan); HNE (1,3 nM i 0,05 M Tris-HCl, pH 7,0 inneholdende 0,5 M NaCl; 0,88 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNan); humant plasmin (3,5 nM i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4 inneholdende 0,2 M NaCl; 0,9 mM HD-Val-Leu-Lys-pNan) og papain (87 nM i 0,1 M Na
2HPO
4, pH 6,3 inneholdende 0,4 M NaCl, 0,01 M EDTA, 0,4 mM Z-Phe-Arg-pNan). De tilsynelatende K
IAPP verdier ble bestemt ved å tilpasse de eksperimentelle punkter til ligningen for sakte tett binding [31] ved hjelp av Grafit programmet, versjon 4.0 (Erithacus Software, Staines, UK) [32].
reaktivt sete bestemmelse ved affinitetskromatografi på trypsin-Sepharose
en prøve som inneholdt 1,8 mg protein i 0,1 M Tris-HCl-buffer pH 8,0 ble påsatt på en 1,0 ml trypsin-Sepharose-kolonne ekvilibrert med den samme buffer. Inhibitoren ble eluert ved 0,5 M KCl /HCl, pH 2,0 og holdt på denne pH inntil den N-terminale bestemmelsestrinnet.
Protein krystallisering
En høyt renset proteinprøve oppsamlet fra en Superdex 75 kolonnen ble dialysert i en buffer bestående av 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl og 3% glycerol, og deretter ble konsentrert til 8,5 mg /mL ved å bruke sentrifugalfilter Units (Millipore, Billerica, Massachusetts). Innledende krystallisering forsøk ble utført ved hjelp av en Phoenix robot (Art Robbins Instruments, Mountain View, California). En rekke hits ble hentet fra flere ulike krystallisering skjermer [JCSG (Qiagen, Valencia, CA), Crystal Screen HT, Index (Hampton Research, Aliso Viejo, California), og Wizard1-2 (Emerald Biosystems, Bedford, MA)]. Diffraksjon kvalitet krystaller ble hentet fra skjermene JCSG-CORE-II D12 (0,2 M Li
2SO
4, 30% PEG 3350 «) og G8 (0,16 M ammoniumsulfat, 0,08 M natriumacetat pH 4,6, 20% PEG4000, 20 % glycerol). Krystaller dukket opp på den andre dagen, og vokste til full størrelse i løpet av noen dager ved 20 ° C.
X-ray datainnsamling og prosessering
Diffraksjon data var samlet på Sørøst Regional Collaborative Tilgang teamet (SER-CAT) beamline 22-ID på Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory. Enkle krystaller ble overført til en kryobeskyttende oppløsning (moderlut med ekstra 10-20% glycerol) i ca. 2 minutter og deretter ble flash-frosset ved 100 K i en strøm av flytende nitrogen. En krystall fra JCSG-CORE-II tilstand G8 (oppkalt skjema jeg) diffracted røntgen til oppløsningen på 1,5 Å. Diffraksjon data ble indeksert, integrert, og skalert med programmet XDS [33]. Krystallen tilhører romgruppen
C
2 med enhetscelleparametrene er a = 114,9 Å, b = 46,2 Å, c = 71,5 Å, β = 103,4 ° og inneholder en dimer av CrataBL i den asymmetriske enheten. Den estimerte Matthews koeffisienten er 2,26 Å
3 Da
-1, tilsvarende 45,5% løsemiddel innhold. En krystall fra JCSG-CORE-II tilstand D12 (oppkalt skjema II) diffracted røntgenstråler til løsning av 1,75 Å. Diffraksjonsdata ble også behandlet med programmet XDS. Krystallen også tilhører romgruppen
C
2, men med forskjellige enhetscelleparametrene er a = 95,6 Å, b = 76,3 Å, c = 62,3 Å, β = 120,1 °, med en enkelt CrataBL dimer i asymmetrisk enhet. Den estimerte Matthews koeffisienten er 2,66 Å
3 Da
-1, tilsvarende 53,9% løsemiddel innhold. Databehandling statistikk for begge krystallformer er vist i tabell 1.
Struktur besluttsomhet og raffinement
Strukturen CrataBL ble opprinnelig fastsatt ved bruk av diffraksjon data fra krystallformen jeg og den resulterende koordinater ble senere anvendt som utgangsmodell for molekylær utskiftning med data som er samlet for krystallform II. Strukturen av CrataBL ble løst ved molekylær erstatning med programmet Phaser [34], [35] med strukturen av vannløselige klorofyll protein (PDB ID: 2DRE) som et utgangsmodell. Den sistnevnte protein ble valgt på grunn av sitt høyeste primærstrukturen identitet med CrataBL (mer enn 30%). En unik løsning som representerer to molekyler i den asymmetriske enheten ble funnet for data mellom 20,0 og 2,5 Å, med en Log-likelihood gevinst på 122,3. Den resulterende elektrontettheten kartet var fullt tolk, verifisere riktigheten av løsningen. Videre avgrensning ble utført med REFMAC5 [36] og PHENIX [34], ved hjelp av alle data mellom 20 og 1,5 Å, etter å sette av 2% av tilfeldig utvalgte refleksjoner (1172 totalt) for beregning av R
gratis [37]. Isotrope individuelle temperatur faktorer var raffinert, med TLS parametere lagt i sluttfasen av raffinement. Etter flere ytterligere runder av automatiserte raffinement og manuell korrigering bruker Kvakk [38], ble den strukturelle modellen endelig raffinert til en R-faktor på 17,3% og R
gratis på 20,8%. Strukturen i krystallform II ble løst med Phaser og formen jeg koordinerer som start modell; raffinement ble utført ved hjelp av en protokoll som ligner på det rapporteres for krystallform I. Den endelige modellen ble videreutviklet til 1,75 Å oppløsning, noe som resulterer i en R-faktor på 18,5% og R
gratis på 23,2%. Avgrensningen statistikk for strukturene CrataBL i de to krystallformene er vist i tabell 1. Strukturene ble sammenlignet under anvendelse av Dali server [39] med et sett av Protein Data Bank strukturer med mindre enn 90% sekvensidentitet.
Celleviabilitet analysen
cellelinjer.
cellelinjer DU145 (HTB-81 ™) og PC3 (CRL-1435 ™) ble kjøpt fra ATCC®. Celler ble opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medier supplert med 10% (volum /volum) varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 100 ug /ml streptomycin og 100 IE /ml penicillin, ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved den modifiserte kolorimetrisk analyse anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA). DU145 eller PC3 ble sådd ut i 96-brønners plater (TPP, Trasadingen, Sveits) ved en tetthet på 5,0 x 10
3-celler per brønn i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CrataBL (5, 10, 20, og 40 uM) eller soyabønne trypsin inhibitor (SBTI) (5, 25, 50, 100 uM) fremstilt i RPMI-medium ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. Etter 24, 48 og 72 timer i kultur, 10 ul av MTT (5 mg /ml i fosfatbufret saltoppløsning, PBS) ble tilsatt til brønnene (2 h, 37 ° C), etterfulgt av fjerning av mediet og tilsetning på 100 pl /brønn av dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) for å oppløse krystallene av formazan. Absorbansen ble målt ved 540 nm ved bruk av et spektrofotometer (Packard, SpectraCount). Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Celledød analyse av flowcytometri
DU145 og PC3 celler (1 x 10
5 celler) ble sådd på 6-brønners plater (TPP, Trasadingen , Sveits) i 24 timer for fullstendig adhesjon. Brønnene ble deretter vasket tre ganger med RPMI-medium uten FBS (ved inkubasjonsperioder på 15 minutter ved 37 ° C og 5% CO
2). Cellene ble inkubert i 24 timer i RPMI-medium uten FBS for å synkronisere cellesyklusen. Deretter ble cellene behandlet med CrataBL (40 uM) i 24 og 48 timer i RPMI uten FBS ved 37 ° C og 5% CO
2. Ved slutten av hver inkubering ble cellene fjernet fra platen ved hjelp av trypsin-EDTA-oppløsning (Cultilab, Campinas, Brasil) [40], overføres til cytometri-rør, vasket med 500 ul av bindingsbuffer (BD PharMingen kit), sentrifugert og resuspendert i 50 ul av den samme buffer som også inneholder 3 mL av Annexin V-FITC og 5 ul av propidiumjodid (PI). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 30 minutter i mørke, og deretter 300 ul av den samme bindende buffer ble tilsatt til hvert rør og analysert ved flowcytometri (FACSCalibur, BD, San Diego, USA) [41], [42].
Analyse av mitokondriell cytokrom c frigivelse
DU145 og PC3-celler ble sådd ut på 13 mm dekkglass (5 x 10
4 celler /brønn) plassert i 24-brønners plater og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO
2 for fullstendig tilslutning. Cellene ble deretter inkubert i RPMI-medium uten FBS i 24 timer, etterfulgt av behandling med 40 uM CrataBL i RPMI medium uten FBS og inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2 i 12 timer. Ved slutten av behandlingen ble cellene vasket med PBS og mitokondriene ble merket med Mitotracker Dyp rød 633 (1:500) (Molecular Probes) i 20 minutter i mørket og fiksert med 2% (v /v) paraformaldehyd i PBS i 15 min. Cellene ble vasket igjen tre ganger med PBS inneholdende 0,01 M glycin og deretter permeabilisert med 0,01% saponin i 15 min. Cellene ble deretter farget i 2 timer med det primære antistoff, mus anti-cytokrom c (1:400) (R 0,05; **
p
0,01; ***
p
. 0,001
Data deponering
Atom koordinater og struktur faktorer har blitt deponert hos Protein Data Bank, www.rcsb.org (PDB deponerings koder 4IHZ og 4II0 for krystallformer i og II, henholdsvis). Proteinsekvensen dataene som presenteres her vil vises i Uniprot Kunnskaps under deponeringsnumrene B8WI86 og C0HJA4.
Diskusjon
Rensing av CrataBL og vurdering av sin virksomhet
Resultater og
CrataBL er et basisk protein (pl 10) som kan renses i en forholdsvis enkel måte [17]. De første trinnene involvert utvinning i 0,15 M NaCl og ionebytterkromatografi i CM-Cellulose (Figur 1a). Størrelse-utelukkelses-kromatografi på en Superdex 75-kolonne (figur 1B) tillot rensing av proteinet til en homogen form som er egnet for strukturelle studier, med bare en enkelt hovedtopp synlig etter revers-fasekromatografi på en C
18 HPLC-kolonne (figur 1C ). Native protein migrerer for det meste som en homodimer ved den konsentrasjon som brukes i forsøkene krystallisering (se nedenfor).
(A) Fraksjon 30-60% ble underkastet ionebytterkromatografi på CM-cellulose ekvilibrert med 10 mM fosfat citrat-buffer (PCB), pH 5,5. To ml fraksjoner ble samlet ved en strømningshastighet 0,3 ml /min. En pil indikerer eluering med 10 mM fosfat-citrat-buffer, pH 5,5, inneholdende 0,5 M NaCl; (B) utelukkelse Størrelse kromatografi på Superdex 75 ekvilibrert med 0,15 M NaCl ved en strømningshastighet 0,5 ml /min. (C) Et proteinfraksjonen ble eluert med en lineær gradient (5-100%) av 90% acetonitril i 0,1% TFA i Milli-Q vann (oppløsningsmiddel B) ved en strømningshastighet på 0,7 ml /min (
t
= 0,1 min, 5% B;
t
= 5 min, 5% B;
t
= 30 min, 40% B;
t
= 50 min , 50% B;
t
= 60 min, 100% B;
t
= 65-68 min, 0% B)
lektin og hemaggluinerende. aktiviteter CrataBL ble nevnt tidligere [17] og disse egenskapene har ikke blitt analysert nærmere. Vi har imidlertid vurdert muligheten av CrataBL til å fungere som en protease-inhibitor. Vi fant at det kunne inhibere bovin trypsin og faktor Xa, men ingen andre serin-peptidaser, inkludert chymotrypsin, plasmin, human neutrofil elastase, humant plasma kallikrein, porcin pankreatisk kallikrein, eller en cystein protease papain (tabell 2). K
IAPP, beregnes ved hjelp av ligningen beskrevet av Morrison et al. [32], var 43 uM for trypsin og 8,6 uM for faktor Xa, som indikerer at CrataBL er en forholdsvis svak inhibitor, mye mindre potent enn noen andre inhibitorer som tilhører den samme familie som ofte er nanomolar av enda picomolar [43], [ ,,,0],44].
primær struktur, glykosylering, og biokjemiske egenskaper av CrataBL
Den primære struktur av modent CrataBL består av et enkelt polypeptid 164 eller 165 aminosyrer lang, til stede i minst to forskjellige isoformer, ulik i stillinger 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) og 97 (Leu /Ser) (figur 2). Den C-terminale Gly165 kan være til stede i bare en del av molekylene. Tilstedeværelsen av fem cysteinrester antydet en mulighet for å danne to intramolekylære disulfidbindinger, hvis nærvær ble bekreftet ved krystall-strukturer (se nedenfor).
En sammenligning av aminosyresekvensen til isoform I av CrataBL med sekvensene av strukturelt lignende proteiner, som bestemmes med programmet Dali [39]. Cysteinrester er vist i svarte boksene og høyt konserverte aminosyrer er markert i grått. Restposisjoner P1 og P1 «, mellom hvilke det proteolytisk spaltning finner sted, er angitt i boksen. Stjernene viser glykosyleringsseter i CrataBL. Sekvensen av isoformen II skiller seg i stillingene 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) og 97 (Leu /Ser).
Araújo et al. [17] estimert molekylvekt på CrataBL på omtrent 21 KDa på SDS-PAGE og har vist ved Schiff farging at proteinet er glykosylert. Videre analyse av glykosylering ved massespektrometri og proteinsekvensbestemmelse har vist nærvær av N-bundne oligosakkarider på Asn27 og Asn57. MALDI-TOF-MS-analyse av den molekylære massen av nativt protein ga en topp ved m /z 20 388, med en skulder ved omtrent 19 700 (M + H)
+, indikerer tilstedeværelse av en isoform. En ytterligere topp av 10 229 er på grunn av molekylært ion (M + 2H)
+ (figur 3). Fenol-svovelsyre-metoden [27] ble anvendt for å bestemme konsentrasjonen av karbohydrat på proteinet, noe som indikerer ~6% karbohydrat-innhold.
Molekylmassen av karbohydratkomponentene ble beregnet ved forskjellen mellom massespektrometri av de glykosylerte peptider og deres aminosyresekvenser. I tilfelle av Asn57, er molekylvekten vist å være 1170 Da, mens ved Asn27, videre signaler av 162 Da eller mer ble påvist (data ikke vist).
Sekvensene til begge isoformer av CrataBL viser høy likhet med en rekke proteiner med β-trekløver fold (figur 2), inkludert Kunitz-typen inhibitorer fra STI (soyabønnetrypsininhibitor) familie [45]. Slike inhibitorer funksjon av tett binding til deres mål protease og innsetting av deres reaktive sløyfe inn i dens aktive sete, noen ganger også fungerer som substrater langsomme [2].
Plasseringen av reaktivt sete av CrataBL ble bestemt ved kromatografi på trypsin Sepharose i 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0. Etter binding til bæreren, ble inhibitoren holdt i 30 minutter på kolonnen og ble deretter eluert med 0,5 M KCl /HCl pH 2,0 og holdt ved denne pH. Trypsin bundet til Sepharose hydrolyserer spesifikt inhibitoren ved reaktivt sete, og prøven ble holdt under forhold valgt for å unngå re-ligering av peptidbindingen. Den resulterende modifiserte protein ble sekvensert, og to N-terminale aminosyrer ble funnet i eluatet, en av dem svarende til den N-terminale Ala1 av det intakte inhibitor, mens den andre kan bli identifisert som Ser59. Dette resultatet indikerer at den sistnevnte rest må være til stede i P1-posisjonen, som definert av Schechter og Berger [46], og dermed Ser58 må oppta P1 stilling. De mest potente trypsin hemmere vanligvis inneholder en basisk rest (Lys eller Arg, slik som Arg63 i STI [44], [45]) i P1-posisjonen. Bare et fåtall kjente Kunitz-P-inhibitorer ha Ser ved posisjon P1 [47], men det er blitt funnet at tilstedeværelsen av serin i P1 «forbedrer interaksjoner med trypsin [48]. Den observerte området av spaltningen av CrataBL tilsvarer den reaktive sløyfe i de fleste kjente Kunitz-P-typen inhibitorer, slik som STI [44] (figur 4).
En sammenligning av aminosyresekvensen til isoform I av CrataBL med sekvenser av BvTI – trypsin inhibitor renset fra
Bauhinia variegata
; BuXI – hemmer av faktor Xa fra
Bauhinia ungulata
; ECTI – trypsin inhibitor renset fra
Enterolobium contortisiliquum trypsin inhibitor product: [42], [43]. Cysteinrester er vist i grått og svært konservert aminosyrer er markert med svart. Residuet stillinger P1 og P1 «, mellom hvilke det proteolytisk spaltning finner sted, er angitt i bokser. Stjernene viser glykosyleringsseter i CrataBL.
Crystal struktur av CrataBL
Den tredimensjonale strukturen av CrataBL ble bestemt i to krystallformer. Begge var i verdensrommet gruppe
C
2 og inneholdt to molekyler i den asymmetriske enheten, men enhetscelleparametere og krystall pakking var annerledes. Strukturene ble raffinert på relativt høy oppløsning, 1,5 A for krystallform I og 1,75 Å for krystallform II, med akseptable geometriske parametre (tabell 1). De siste modellene var komplett for alle fire uavhengige molekyler med rester 1-164 spores. Tilstedeværelsen av meget godt definerte C-terminale karboksylat i molekyl Et av krystallform I antyder at den siste rest ble Ser164, og at Gly165, selv om kommentert i primærstrukturen, ikke var til stede i krystallisert protein (figur 5). Selv om det, som nevnt ovenfor, CrataBL isolert fra dets naturlige kilde er en blanding av isoformer, synes det som først og fremst molekyler av isoform I ble krystallisasjon, fordi elektrontettheten svarende til rester som skilte seg mellom de to isoformene var helt klar. Omfattende glykosylering ved Asn27 ble notert, med opp til fire karbohydratenhetene knyttet til som rest blir synlig. Den beste tetthet var til stede i molekylet A av krystallform I, hvor den typiske plantetypen glykosyleringsmønster [Manβ1-4GlcNAcβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAcβ-Asn] [49] kunne observeres. Karbohydratene ble mindre godt organisert i andre molekyler av begge krystallformer. En svak tetthet som kan tilsvare et karbohydrat bundet til Asn57 i krystallform I ikke tillate riktig modellering. I krystallform II, men den tetthet som grenser til Asn57 var helt klar og tillatt modellering av et kovalent bundet GlcNAc. To disulfidbindingene ble gjort av Cys33-Cys80 og Cys126-133, mens Cys74 var til stede i alle molekyler i form av sulfensyre syre.
2F
på
c kartet ble profilert på 1,2 σ nivå. Formen på tetthet svarende til den C-terminale karboksylat tydelig at Gly165, selv om funnet i sekvensen, er ikke til stede i isoformen danner krystall. Figur forberedt med PyMol [69].
fold av CrataBL består av et β-trekløver, typisk for dette proteinet familien. Zhang et al.
