Abstract
Cancer stamceller (CSC) ble isolert via et ikke-klebende neurosfære analyse fra tre glioma cellelinjer : LI, U87 og U373. Ved hjelp av en klonal analyse, to kloner (D2 og F11) ble valgt ut fra kuler som stammer fra LI celler og ble preget for: uttrykk for stamcellemarkører (CD133, nestin, Musashi-en og Sox2); spredning; differensiering evne (bestemt av uttrykket av GalC, SIII-Tubulin og GFAP); Ca
2 + signalering og tumorgenisiteten i nakne mus. Både D2 og F11 kloner uttrykte høye nivåer av alle stamcelle markører i forhold til den opphavelige cellelinje. Clones vokste saktere enn LI celler med en dobling i duplisering tid. Markører for differensiering (SIII-Tubulin og GFAP) ble uttrykt i høye nivåer i både LI celler og i neurosfærer. Ekspresjonen av nestin, Sox2, og SIII-Tubulin ble nedregulert i D2 og F11 når dyrket i serumholdig medium, mens Musashi-en ble øket. I denne tilstanden, duplisering tiden av D2 og F11 økt uten å nå det av LI celler. D2, F11 og foreldre cellene uttrykte ikke spenningsavhengig Ca
2 + -kanaler, men de viste økte intracellulære Ca
2 + nivåer i respons til ATP. Disse Ca
2 + signalene var større i LI-celler og i sfærer dyrket i serumholdig medium, mens de var mindre i serumfritt medium. ATP behandling påvirke ikke celleproliferasjon. Både D2 og F11 indusert tilsynekomst av tumorer når ortotopically injiseres i atymiske nakne mus ved en tetthet 50 ganger lavere enn den for LI celler. Alle disse data indikerer at begge klonene har karakteristikkene av CSC og deler de samme stemness egenskaper. Funnene vedrørende uttrykk for differensiering markører og Ca
2 + -kanaler viser at begge kloner er ikke i stand til å nå terminal differensiering. Både D2 og F11 kan representere en god modell for å bedre kunnskapen om CSC i glioblastom og å identifisere nye terapeutiske tilnærminger
Citation. Iacopino F, Angelucci C, Piacentini R, Biamonte F, Mangiola A, Maira G, et al. (2014) Isolering av kreftstamceller fra Three Menneskelig glioblastom cellelinjer: Karakterisering av to utvalgte kloner. PLoS ONE 9 (8): e105166. doi: 10,1371 /journal.pone.0105166
Redaktør: Giovanni Camussi, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: 7 mars 2014; Godkjent: 21 juli 2014; Publisert: 14. august 2014
Copyright: © 2014 Iacopino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har fått en fransk statlig støtte gitt til CominLabs fortreffelighet laboratorium og administreres av National Research Agency i «Investing for the Future» programmet under henvisning ANR-10-LabX-07-01. Det ble også støttet av Rennes universitetssykehus (Corec prosjekt kalt Connexion, 2012-14). Vi takker også European Research Council for ERC-2011-ADG – tilskuddsavtale N ° 290901 – Akronym «NEUCOD». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er økende bevis for at svulster er hierarkisk organisert av heterogene populasjoner, inkludert en liten brøkdel av kreft stamceller (CSC). CSC har mange likhetstrekk med normale stamceller, som selvfornyende kapasitet og multilineage differensiering eiendommer [1]. I tillegg er CSC er svært tumorgene og kan generere phenocopies av de primære humane kreftform i immunkompromitterte mus [1]. Fra et klinisk synspunkt, CSC er ansvarlig for svulst vedlikehold, sustentation, gjentakelse og motstand mot konvensjonelle behandlinger [2] – [4].
En CSC brøkdel har vært isolert i mange kreftformer, inkludert gliom [2 ] – [5], ved anvendelse av forskjellige fremgangsmåter [5] – [9]. De fleste glioma CSC er avledet fra kliniske vevsprøver [7], [10], [17] mens bare et fåtall er avledet fra etablerte cellelinjer: Rat C6 celler og humane ondartede glioma cellelinjer (U373, A172, U87 og SU3 ) har blitt brukt [9], [17] – [23], [24]. Enkelte forfattere anbefaler ikke cellelinjer som kilde for CSC fordi de vokser i serumholdig medium, noe som gir opphav til celler som er forskjellig genetisk og biologisk fra de av de primære tumorer fra hvilken de ble utledet [25]. Ikke desto mindre, cancer-cellelinjer har noen fordeler med hensyn til tumorvevet. Faktisk har de ikke presenterer noen kontaminerende normale stamceller, kan betraktes som en homogen prøve, og det er lett å få tak i store mengder av dem [21]. Derfor kan identifisering og karakterisering av CSC fra etablerte cellelinjer gir viktige verktøy for å utforske biologi CSC [26]. Ingen enkelt markør har vist seg å være tilstrekkelig til å meddele stamcelle-lignende egenskaper, er således en kombinasjon av ulike markører som brukes til å identifisere og isolere CSC i glioma, inkludert nestin, Sox2 (SRY relaterte HMG-box gen 2) og Musashi -1 (Msi-1). Disse molekylene er uttrykt ved høye nivåer i nevrale stamceller og er ofte ansett som et kjennetegn på udifferensiert tilstand [27] – [30]
Når det utsettes for storfefosterserum, CSC skille ned avstamning av foreldre. tumor [6], [9], [12], [16] – [23]. Derfor CSC avledet fra hjernesvulst fortrinnsvis differensiere til astrocytter, men multilineage differensiering kan tidvis bli observert med nevrale slektsnavn, og noen unormale celler med blandede fenotyper. Det skal bemerkes at disse linjer er karakterisert på basis av molekylære markører, slik som astrocytic markør GFAP, den oligodendrocytic markør GalC, og neuronal markør (SIII-Tubulin) [7], [9], [16] – [ ,,,0],23], [25], i stedet for på funksjonelle parametre. For eksempel bør den avgjørende test for å identifisere et nevron er å måle dens evne til å generere aksjonspotensialer [31], [32], men denne testen er vanligvis ikke utført. Dessuten har den viktige rollen av Ca
2+ signaler i utviklingen av glioblastoma (GBM) har nylig blitt gjennomgått [33].
Noen interessante resultater er blitt oppnådd ved anvendelse av CSC avledet fra etablerte cellelinjer vedrørende invasive egenskaper, chemoresistance, narkotika screening, apoptose, spredning, immunreaksjoner, og genekspresjon [34] -. [39]
i denne studien fant vi at U87, U373 og LI cellelinjer inneholder en brøkdel av celler som kan danne tumor sfærer når dyrket i serumfritt neural stamcelle medium. Celler fra tumor kuler har evnen til selvfornyelse og sekundære kuler formasjonen.
Det er velkjent at det i GBM det er en histologisk variabilitet og heterogenitet [40], [41] som resulterer i isolering av distinkte CSC subpopulasjoner som opprettholder den primære svulsten fenotype og genotype, som nylig beskrevet [19], [25]. Våre resultater viser tydelig at alle de menneskelige glioma cellelinjene vi studerte inneholde CSC. Videre ble to kloner valgt fra LI cellelinje preget på: uttrykk for stemness markører, spredning, evne til å skille, tilstedeværelse av de spenningsstyrte Ca
2 + kanaler og ATP-avhengige Ca
2 + signaler, og tumorigenicity etter orthotopic transplantasjon. Så vidt vi vet, ingen data er tilgjengelige i litteraturen om tilstedeværelse av CSC i denne LI cellelinje. Disse to kloner kan representere modeller nyttige for fremtidige studier av ondartet hjernesvulst med sikte på å finne nye terapeutiske tilnærminger.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Kultur glioma cellelinjer .
human cellelinje U373 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, USA), astrocytom grad III /glioblastom, ble vennlig levert av professor Pierluigi Navarra, institutt for farmakologi, katolske universitetet i Sacred heart, Roma.
human cellelinje U87 (ATCC, USA), astrocytom grad III /glioblastom, ble vennlig levert av Dr. Emilio Ciusani, National Neurological Institute «Carlo Besta», Milan [42].
De menneskelige LI cellelinje, astrocytom grad IV, ble velvillig donert av professor Gabriella Zupi, Regina Elena Institute, Roma [43], [44].
De tre cellelinjer (foreldrecellelinjer ) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium /Ham F-12 (DMEM /F12) (Gibco, Carlsbad, CA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Euroclone, Milano, Italia), antibiotika (penicillin /streptomycin 100 IE /ml /100 um /ml, Euroclone), 4-2-hydroksyetyl-1-piperazinyl-etansulfonsyre (10 mM, Euroclone), glutamin (2 mM, Euroclone) og glukose (0,3% vekt /volum, Sigma-Aldrich, St Louis , MO, USA), heretter kalt: standard medium. Cellene, som vokser i monolag, ble dyrket til konfluens, og holdt ved 37 ° C i fuktig atmosfære som luft: CO
2. (95%: 5%)
neurosfære (NS) kultur
Alle de monolags voksende cellelinjer, U373 (22-25
th passasje), U87-MG (52-55
th passasje) og LI (93-95
th passasje) ble sådd ved en tetthet på 100.000 celler /ml, i et definert serumfritt medium, DMEM /F12 supplert med antibiotika (penicillin 100 IU /ml, streptomycin 100 um /ml), HEPES (10 mM), glutamin (2 mM), glukose (0,3% w /v), rekombinant human epidermal vekstfaktor (rhEGF) (20 ng /ml, R anti-nestin (Chemicon, Tamecula, CA, USA); anti-Sox2 monoklonale, (R D System, MAB2018); anti-Musashi-en (monoklonalt, R D System, MAB2628); anti-galaktocerebrosid (GalC, monoklonalt IgG3, Millipore Corp., Bedford, MA, USA); anti-Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP, monoklonalt, IgG3, Millipore), anti-neuronal klasse IIIβ-Tubulin (monoklonalt IgG2a, TUJ1 Clone, Covance Research Group Inc.).
Flowcytometri
for å evaluere CD133-ekspresjon ved strømningscytometri, cellene ble mekanisk dissosiert, vasket to ganger i en oppløsning av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) 2 mM i fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA), og deretter inkubert med anti -CD133 /1 (AC133) -PE antistoff (Miltenyi Biotec, Tyskland) 01:20 i 30 min. ved 4 ° C i mørket. Cellene ble vasket og suspendert i PBS for analyse. De ble deretter analysert ved flowcytometri i en PCA-96 System maskin (Guava Technologies, Hayward, CA, USA).
Caco-2 cellelinje, en kontinuerlig linje av en heterogen human epitelial kolorektal adenokarsinom, var brukt som en positiv kontroll.
Immunocytochemistry
Cryosectioning av NS.
Hele NS ble samlet inn fra kulturflasker, vasket med PBS for å fjerne overskudd av kulturmediet, og fast i 4%
paraformaldehyde plakater (PFA) i 10 min. ved romtemperatur. NS ble deretter plassert i en PBS /20% sukrose over natten ved 4 ° C. De ble så montert i OCT (optisk kappetemperatur) forbindelse (Sakura, Tissue Tek, Torrance, CA), etterfulgt av frysing ved -80 ° C. Skiver av 10 mikrometer ble oppnådd på en cryostat, og plassert på lysbilder ( «Super Frost Plus», Menzel-Glaser, Braunschweig, Tyskland).
Celler som vokser i monolag ble sådd på «Super Frost Plus» lysbilder og ved de forskjellige kultur ganger, ble de fiksert i 4% PFA i 10 min. Etter vasking med PBS, ble objektglass holdt ved -80 ° C inntil de ble bearbeidet.
For immunocytokjemisk analyse, etter rehydratisering med PBS, den samme fremgangsmåte ble fulgt for frysesnitt og dekkglass. Snittene ble dekket med blokkering løsning (Super blokk, UCS Diagnostics, Roma, Italia) for 8 min. eller med 0,3% (v /v) TritonX-100, 1% (w /v) BSA og 10% (v /v) «normal esel serum» i PBS i en time. Deretter ble de inkubert over natten ved 4 ° C med følgende primære antistoffer (fortynnet i blokkeringsløsning): anti-nestin (1:200); anti-Sox2 (01:50); anti-Msi-en (1:200); anti-GalC (1:100); anti-GFAP (1:500); anti-SIII-Tubulin (1:200). Etter skylling med saltvannsbuffer, ble skivene inkubert med HRP-polymer-konjugat (SuperPicture Polymer Detection Kit, Zymed, San Francisco, CA, USA), og etter et vasketrinn, 3,3′-diaminobenzidin (Vector, Burlingame, CA, USA ) ble anvendt som kromogen. Kjerner ble kontra med Harri haematoksylin. Negative kontroller ble utført ved å utelate det primære antistoff.
Western-blot-analyse
Celler fra både monolagskulturer og NS, etter 0-45 dagers dyrking, ble oppsamlet i en lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% Triton X-100, 0,5 mM EDTA, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6), inneholdende protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich), og 17,4 ug /ml fenylmetylsulfonylfluorid (Sigma-Aldrich). Proteinekstrakter ble kvantifisert ved Bradford Protein Assay. For Western-blot-analyse, ble 50 ug av totalproteiner løst på denaturerende polyakrylamidgeler (SDS-PAGE): 10% (Msi-1, SIII-Tubulin) og 8% (nestin) og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF; Immobilon P , Millipore, USA) membran ved elektroblotting. Membranene ble blokkert med PBS-T (PBS-buffer saltoppløsning med 0,1% Tween-20) inneholdende 5% BSA og deretter inkubert over natten med primære antistoffer. Etter vasking for 3 x 5 min., Ble membranene probet 1 time ved romtemperatur med sekundært antistoff (anti-mus-IgG-konjugat, Sigma, 1:10,000). Åpenbaringen ble utført av chemiluminescence
Signalene ble kvantifisert ved densitometrisk scanning (ChemiDoc dokumentasjonssystem /QuantityOne kvantifisering programvare, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)..
Confocal Ca
2+ avbildning
Confocal Ca
2+ avbildning ble utført som tidligere beskrevet [32]. I korthet ble cellene platet ut på dekkglass ble inkubert i 30 min. ved 37 ° C med den Ca
2 + -sensitive fluorescerende fargestoff Fluo-4 AM (2,5 uM, Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia) i Tyrodes oppløsning inneholdende: 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl
2, 10 mM glukose, 10 mM HEPES og 2 mM CaCl
2. PH ble justert til 7,4 med NaOH. De fargestoff lastet Cellene ble vasket og holdt på dekkglass i 30 min. ved romtemperatur (23-25 ° C) i frisk Tyrodes løsning for å tillate fullstendig fargestoff de-forestring. Objektglassene ble så overført til en perfusjon kammer plassert på fasen av et invertert mikroskop (DM IRE2; Leica Micro, Wetzlar, Tyskland) som er festet til en konfokal laser-skanning (TCS-SP2, Leica). Fluo-4-belastede celler ble spent med 488 nm-linjen i en Ar /ArKr laser, og utslipps signalet ble samlet opp ved en fotomultiplikator innenfor et vindu som varierer 500-535 nm. Intracellulær Ca
2+ transienter ble stimulert med enten celle utsettes for ATP (50 uM) eller membran depolarisering (oppnådd ved å utsette cellene for et modifisert Tyrodes oppløsning inneholdende 100 mM KCI). Intracellulær Ca
2 + transienter indusert av disse stimuli ble kjøpt til 0,5 Hz og deres amplitude ble målt i AF /F ratio, dvs. hvor F
max representerer fluorescens registrert på toppen av Ca
2+ transienter beregnet over all den innspilte tiltaket (som varer 60 s) i en region av interesse spores rundt hver celle kroppen; F
pre er den gjennomsnittlige fluorescensintensitet målt under pre-stimulus periode (20 s); og F
bgnd er bakgrunnen fluorescensen målt i et område av feltet mangler fargestofffylte strukturer. I en undergruppe av eksperimenter som tar sikte på å evaluere bidraget fra ekstra-vs. intra-cellulær Ca
2+ til den målte intracellulær Ca
2+ transienter, to påfølgende ATP-stimuleringer ble utført på celler ved differensiering dag 5. Den første anvendelse av ATP ble utført i normal Tyrodes løsning. Etter 5 min., Ble ATP søknad gjentatt i en modifisert Tyrodes løsning hvori Ca
2+ ble fjernet (det vil si praktisk talt Ca
2 + -fri oppløsning). Før testing effekten av Ca
2 + fjerning på ATP-indusert Ca
2 + transienter, stabilitet i Ca
2 + svar på to påfølgende ATP-stimuleringer gjentatte ved 5-min. intervall er undersøkt: forskjellene mindre enn 5% ble funnet
spredningsanalyse
LI celler ble sådd på multibrønnplater i standard medium mens NS-kloner ble sådd i NSCM (25.000 celler per brønn).. Celler ble bestemt på dagene 2, 4, 6, 8 og 10 etter seeding ved hjelp av en automatisk celleteller (NucleoCounter, ChemoMetec A /S, Allerød, Danmark). Mediet ble endret hver 2 dager.
vekstkurve ble generert slik at horisontal koordinere datum definert dager og vertikale koordinere datum definerte celletettheter. Cell dobling ganger i løpet av logaritmisk vekst ble beregnet i henhold til Hayflick formel: (T = befolkning dobling tid; t = fastsatt tid etter subkultur, N
t = antall celler på den fastsatte tid; N
0 = antall celler ved begynnelsen av subkulturen).
Et sett av cellevekstforsøk ble utført for å teste effekten av ATP på celleproliferasjon. Celler (LI, D2, F11, og D2 og F11 samlet opp etter en dag og 5 dager under differensiering medium) ble sådd ut i en tetthet på 50.000 celler /brønn i 1 ml kulturmedium i 24-brønners plater og behandlet med ATP konsentrasjoner fra 0 til 100 ug /ml for 0, 1, 2, 3, 4, 5 og 7 dager. Celletellinger ble utført med en cytometer. Eksperimenter ble kjørt i tre eksemplarer.
In vivo
analyse av tumorigenitet
Etikk erklæringen.
Alle dyrene brukte ble eksperimentert i henhold til de institusjonelle Animal Care og bruk komité retningslinjer som gjelder på det katolske universitetet i Sacred Heart og hver innsats ble gjort for å minimere lidelse. Arbeidet ble utført under myndighet av dyreetikk Committee, «A. Gemelli «, School of Medicine, Catholic University of the Sacred Heart, Roma, Italia (godkjent prosjekt lisens: prot.pdc.CESA /A /42/2011).
atymiske nakne mus (nu /nu; 6 -8 uker gamle, Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) ble bedøvet med ip ketamin og xylazin, og stereotaktisk implantert med enten isolert D2, F11 celler (10.000 eller 1.000 per mus) eller LI celler (500,000 eller 10.000 per mus) i 3 mL PBS i høyre striatum. En kontrollgruppe mottok bærer bare (PBS). De implanterte mus, 4 dyr per gruppe, ble veid en gang per uke, overvåket to ganger per uke og ble drept da de utviklet nevrologiske symptomer (ataksi /manglende koordinasjon /svimlende /ubalansert). Mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon under dyp anestesi. Hjerne seksjoner ble undersøkt for forekomst av svulster, som beskrevet nedenfor.
Hematoxylin-eosin og immunhistokjemi farging av hjerne seksjoner
De tumor-celle-implantert mus hjerner ble fiksert med 4% paraformaldehyde og kuttet med en mikrotom til korall seksjoner. For hematoxylin-eosin-farging, ble hjernen seksjoner montert på objektglass farget med hematoksylin Harri s til 2 min. først, og deretter kontra med alkohol eosin. For å karakterisere hjernevevet ved immunhistokjemi, ble seksjonene farget med primære antistoffer for human-spesifikt anti-nestin (1:200), anti-SIII-Tubulin (1:200), og anti-GFAP (1:500), etter samme prosedyre som er beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
Alle verdier i tallene og teksten ble vist som gjennomsnitt ± SD. Noen vesentlige forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene ble evaluert av Student t test eller enveis ANOVA. En tosidig p 0,05 ble akseptert som betydelig
Resultater
Isolering av CSC av neurosfærer (NS) dannelse analysen
Under dyrkningsforholdene for NSCM, kuler som likner. typiske NS hurtig dannet på toppen av monolag av alle cellelinjer (figur 1A). Om tre dager senere, U87 og LI cellelinjer vokste helt sfærisk (10-20 celler) med ingen tilknyttede celler (primær NS), mens noen heftende celler vedvarte i U87 cellelinje. Etter 1-2 uker med kultur, ble dannelsen av tumor kuler detektert og fotografert under en invertert mikroskop. Kulene kan formeres og kontinuerlig dyrket i en frittflytende form (figur 1A). Derfor er alle cellelinjene som dannes selv fornybar kuler i kultur
(A). Den beste foreldrecellelinjer (LI, U87 og U373 celler) dyrket i deres standard medium tilsatt 10% serum. USA, dannelse av neurosfærer på toppen av monolag av U373-cellelinje. Bilder ble tatt etter 1, 2 og 3 dager i neurosfære medium. Bottom, bilder av primære NS generert av LI, U87 og U373 celler ved dag 8. (B) Clones avledet fra LI (D2 og F11) og U87 (C7 og E8) primære NS. Original forstørrelse 200 × eller 400 ×. Scale bar = 100 mikrometer.
begrensende fortynning /Spheres Tumor Initiation (TS-CI) Analyse
For å bestemme evnen av de tre cellelinjene for å danne NS, en TS-CI analysen ble utført. Hyppigheten av TS-ICs var 1,56% for de U373-celler (en celle hvert 64 viste evnen til å danne primære NS), 1,45%, av U87-MG-celler (en celle hvert 69 viste evnen til å danne primære NS), og 2,74% for LI-celler (en celle hver 36 oppviste evnen til å danne primære NS).
Enkeltkolonidannelse analyse
for å vurdere selvfornyelse kapasitet på primær NS, en klonogene analyse ble utført. Effektiviteten av kolonidannelse var 9,5%, 10,5% og 33,3% for NS avledet fra U373, U87 og LI, henholdsvis.
Voksende kloner ble valgt, disaggregert, og vedlikeholdt over mange subkulturer. To kloner (D2 og F11) ble oppnådd fra primære NS avledet fra LI og to (C7 og E8) fra U87 som dannet selv fornybar kuler i kultur (figur 1B). Ingen av klonene avledet fra U373 var i stand til å vedvare i kultur, selv når et annet medium ble benyttet. Morfologien av klonene var variabel. F11, C7 og E8 vokste helt sfærisk, mens D2 tendens til å danne både sfæriske eller avlange aggregater (Figur 1b).
Uttrykk for stamcellemarkører og avstamning-spesifikke markører
CD133, nestin, Sox2 og Msi-en ble evaluert for å vurdere staminal natur utvalgte kloner. Ved å bruke immunocytokjemi, var 50% av LI-celler og 100% av U87 nestin-positive og fargingen var plassert på den cytoplasmiske nivå. I både D2 og F11 kloner avledet fra primære NS Li celler, ble det observert en økning i stamcelleforskningen markør uttrykk. Mer enn 80% av cellene fra begge kloner var positive for nestin. Det ble ikke observert noen økning i nestin farging i begge kloner avledet fra U87-celler i forhold til den opphavelige cellelinje (figur 2).
Innsatsene refererer til negative kontroller. Original forstørrelse 400 ×. Målestokk = 100 um.
På bakgrunn av dette bevis og morfologisk aspekt, er etterfølgende eksperimenter blitt utført bare på kloner D2 og F11 med sikte på å verifisere om de observerte forskjellene kan tilsvare forskjeller i oppførsel.
Analysere CD133 uttrykk ved flowcytometri, vi har oppdaget 0,04, 0,13 og 1,44% CD133 positive celler i LI, D2, og F11 celler, henholdsvis (figur 3A). Disse verdiene vedvarte etter ulike sykluser av nedfrysing. Ved å bruke immunocytokjemi, har vi funnet at 30% LI celler tilstede i små grupper i monolagskultur var positive for Sox-2 som er typisk lokalisert i kjernen; endelig 100% LI celler viste svak Msi-en cytoplasma farging (figur 3B). I begge D2 og F11 kloner, ble det observert en økning av stamcelle markør uttrykk. Åtti prosent av celler fra begge kloner var positive for nestin og 100% for Sox-2. En sterkere ekspresjon av Msi-1 ble detektert i 100% av cellene (figur 3B). Nestin ekspresjon i begge klonene ble bekreftet ved Western blot-analyse. Figur 4C viser til data innhentet i F11-klone
A:. Flowcytometri analyse for å måle CD133 uttrykk for celler avledet fra LI monolagkulturer og D2 og F11 kloner. CaCo
2-celler er positiv kontroll. CD133 uttrykk ble evaluert i begge kloner ved 5
th passasje (5
THP) og 16
th passasje (16
THP). B: Data fra et representativt eksperiment immunocytokjemisk farging for Msi-en og Sox2 uttrykk i LI, D2 og F11 celler. Innleggene viser til negative kontroller. Original forstørrelse 400 ×. Scale bar = 100 mikrometer
A:. Immunocytokjemisk farging for nestin, Msi-en, Sox2 og SIII-Tubulin uttrykk i D2 og F11 celler dyrket i neurosfære medium (uten serum) eller i differensiering medium ( nærvær av serum) i 5-45 dager. Original forstørrelse 400 ×. Scale bar = 100 mikrometer. B: Noen SIII-Tubulin positive celler som utviser en typisk neuronal lignende morfologi. Original forstørrelse 630 ×. Scale bar = 50 mikrometer. C: Western blot-analyse av nestin, Msi-1 og SIII-Tubulin ekspresjon i F11 celler dyrket i forskjellige tidsrom i differensieringsmedium. Proteiner nivåene ble analysert ved immunblotanalyse og ble kvantifisert ved densitometri og standardisert mot nivåene β-aktin som en lasting kontroll. Verdier er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Lignende resultater ble oppnådd fra D2-celler. Immunoblottings fra representative eksperimenter er vist. * P 0,05 Student
t
-test vs foreldrecellelinjer, * p. 0,01 vs. F11 celler
Spheres ble dyrket under differensiering forhold for ulike tider og ble analysert for uttrykket av stamcellemarkører og avstamning-spesifikke markører. Etter inkubering over natten i differensiering medium, neurosfærene cellene var vedheftende til kulturplaten og vokste i monolaget. Ekspresjonen av neural-spesifikke SIII-Tubulin, GFAP og GalC ble evaluert ved immunocytokjemi. Både SIII-Tubulin og GFAP ble sterkt uttrykt i opphavelige cellelinje og i begge kloner, mens GalC ikke ble uttrykt (data ikke vist). Ved differensierings forhold, ekspresjon av neural-spesifikke SIII-Tubulin redusert (figur 4A), mens det av GFAP ikke endrer seg vesentlig (data ikke vist). Spesielt, noen av SIII-Tubulin uttrykkende celler hadde et nevron-lignende morfologi (figur 4B), mens andre var multinucleated celler.
Reduksjonen i SIII-Tubulin-ekspresjon ble også vurdert ved Western blot-analyse i begge D2 ( data ikke vist) og F11 (Figur 4C) kloner.
i D2 og F11 kloner en nedgang i både nestin og Sox-2 immunopositivity til ikke målbare nivåer ble observert etter mer langvarig NS cellekultur i differensiering medium (figur 4A ). Den slående reduksjon av nestin nivåer ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse (Figur 4C viser til data oppnådd i F11-klon). Ingen tilsynelatende variasjon i Msi-1-ekspresjon, analysert ved immunocytokjemi, ble det observert, men dens plassering er endret mellom kjernen og cytoplasmaet avhengig av tidspunktet av varighet i serumholdig medium (figur 4A). Western blot-analyse viste at LI celler og begge kloner oppviste en lignende uttrykk for Msi-1, mens celler fra begge kloner i henhold til differensiering viste et høyere nivå av proteinet. Figur 4 viser data innhentet i F11-klone.
Confocal Ca
2 + bildebehandling
I udifferensierte celler (omtalt som tids punkt dag 0), KCl stimulering produsert Ca
2+ transienter på mindre enn 10% av totale celler (
n
= 9 med 127), og den midlere amplitude av disse transienter var 0,36 ± 0,02. En lav respons til depolariserende stimuli ble også observert i differensierende celler. Faktisk er den prosentandel av celler som reagerer på KCl-stimulering med Ca
2+ transienter var lavere enn 10% ved dag 5, dag 15 og dag 30 for, med gjennomsnittlige amplituder på 0,75 ± 0,25 [
n
= 7 av 287], 0,42 ± 0,07 [
n
= 10 ut av 418] og 0,34 ± 0,02 [
n
= 7 av 418], henholdsvis. Disse resultatene indikerer at LI-avledet humane stamceller, enten udifferensierte eller på ulike stadier av differensiering, ikke viser funksjonelle spenningsstyrte Ca
2 + kanaler. Imidlertid, når disse cellepreparater ble eksponert for 50 uM ATP, tydelig påvisbar intracellulær Ca
2+ transienter ble observert. I udifferensierte celler (dag 0), ATP som produseres Ca
2+ signaler i 16,1 ± 9,8% av totalt antall celler (39 av 127) med midlere amplitude på 0,79 ± 0,10. Etter en dag i kulturen differensiering medium, prosentandelen av responderende celler steg til 89,2 ± 7,2% (
n
= 115 ut av 132) og den midlere amplitude av transienter ble likeledes øket (1,49 ± 1,13). På dag 5, ikke lenger øker i andel responderende celler ble observert (86,3 ± 3,5%;
n
= 430 av 492), men forbigående amplituden nådd en maksimumsverdi på 2,69 ± 0,07. Ingen vesentlige endringer i Ca
2 + signalamplituder ble observert i løpet av de neste dagene for differensiering opp til 30 dager: de AF /F verdier er 2,48 ± 0,07 på dag-15 (77,8 ± 7,1% av respons celler;
n
= 334) og 2,55 ± 0,11 på dag-30 (80,5 ± 5,1% av respons celler;
n
= 306).
