Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er svært motstandsdyktig mot dagens kjemoterapiregimer, delvis på grunn av endringer i p53 tumor suppressor veien. p53 homolog p63 er en transkripsjonsfaktor avgjørende for utvikling og differensiering av epitelceller overflater. Men dens funksjon i kreft er omstridt, og dens rolle i PDAC er ikke kjent. Vi oppdaget at ΔNp63α var overveiende uttrykt p63 variant i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. ΔNp63α protein og mRNA nivåene var høy i T3M4, BxPC3 og Colo-357 bukspyttkjertelen kreftceller og lite ASPC-en og PANC-1 celler. Overekspresjon av ΔNp63α i PANC-1 celler og shRNA-mediert knockdown i T3M4 celler indikerte at ΔNp63α fremmet forankringsavhengig og-uavhengig vekst, motilitet og invasjon, og forbedret motstand mot cisplatin-indusert apoptose. Epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signalveier bidra til den biologiske aggressivitet av PDAC, og vi fant at motogenic effektene av ΔNp63α ble utvidet i nærvær av EGF. Ektopisk uttrykk for ΔNp63α resulterte i oppregulering av EGFR og β1-integrin i PANC-1 celler. Motsatt ΔNp63α knockdown hadde en motsatt effekt i T3M4 celler. ΔNp63α forsterkes EGF-mediert aktivering av ERK, Akt og JNK signalering. Kromatin immunpresipitering og funksjonelle reporter analyser viste at ΔNp63α aktivert EGFR transkripsjon. 14-3-3σ transkripsjon ble også positivt regulert av ΔNp63α, og vi har tidligere vist at 14-3-3σ bidrar til chemoresistance i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Omvendt, shRNA-mediert knockdown av 14-3-3σ førte til opphevelse av ΔNp63α effekter på celleproliferasjon og invasjon. Dermed øker p53 homolog ΔNp63α den onkogene potensialet for kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom trans-aktivering av EGFR og 14-3-3σ
Citation. Danilov AV, Neupane D, Nagaraja AS, Feofanova EV, Humphries LA, DiRenzo J, et al. (2011)
DeltaNp63alpha-
Mediert Induksjon av epidermal vekstfaktor reseptor Fremmer bukspyttkjertelkreft cellevekst og Chemoresistance. PLoS ONE 6 (10): e26815. doi: 10,1371 /journal.pone.0026815
Redaktør: Toru Ouchi, University of Chicago, USA
mottatt: 07.07.2011; Godkjent: 03.10.2011; Publisert: 28 oktober 2011
Copyright: © 2011 Danilov et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Department of Medicine Junior fakultet Award (Dr. Danilov), en Norris Cotton Cancer Center Prouty Pilotprosjekt Award (Dr. Danilov), en Hitchcock Foundation Award (Dr. Danilov), og ved National Cancer Institute Grant CA- R37-075059 (Dr. Korc). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
studier i menneskelig sykdom viser at de fleste etablerte svulster bære mer enn en genetisk defekt. Pankreas duktalt adenokarsinom (PDAC) et resultat av den suksessive akkumulering av genmutasjoner [1]. Aktiverende mutasjoner i K-Ras onkogen og inaktivering av tumor suppressors CDKN2A, p53 og SMAD4 er innblandet i PDAC utvikling og progresjon [2]. Genmanipulerte musemodeller har støttet «double-hit» hypotese hvor innføringen av enten mutant p53 allel eller biallelic sletting av ink4a /Arf i mus resultater i utviklingen av pankreas intraepitelial neoplastiske lesjoner med lokal invasjon og metastaser [3], [4]. p53-mutasjoner er funnet i 60 til 70% av PDAC. Derimot, p63, en anen medlem av p53-familien, er sjelden mutert i kreft.
Seks varianter av p63 genereres gjennom transkripsjon fra to forskjellige arrangører og alternativ spleising. Isoformer transkribert fra P1 inneholde en full-lengde trans-aktivering domene (TAp63α, β og γ). Transkripsjon fra P2 genererer amino-terminalt trunkerte varianter (ΔNp63α, p og y), hvis eksakte rolle i kreft er ikke klart. Den ΔNp63 varianten er overuttrykt i en rekke menneskelige kreft, inkludert tumorer av plateepitelkarsinom opprinnelse (hode og hals, lunge), bryst og blære [5]. I hodet og nakke plateepitelkarsinom og «triple-negative» brystkreftceller, undertrykker ΔNp63 p73-avhengig apoptose og dermed fremmer svulst overlevelse [6], [7]. I motsetning til nedregulering av ΔNp63α i urothelial carcinom cellelinjer fremmer kreft invasivitet [8], som tyder på at HEK293 humane embryonale nyreceller og H1299 humane lunge carcinoma-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Colo-357 og T3M4 menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer var en gave fra Dr.R.Metzgar (Duke University, Durham, NC). Cellelinjer ble dyrket i RPMI eller i DMEM (HEK293) supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (komplett medium).
plasmidkonstruksjoner
det humane og muse ΔNp63α ekspresjonsplasmider og (p53RE)
5-tk-luciferase-plasmid ble rapportert tidligere [9]. TAp63α uttrykk plasmid ble kjøpt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). PBV-14-3-3σ promoter BDS 2 3 × (p53 bindingssetet) -luc plasmid ble hentet fra Addgene (Cambridge, MA). pGL3-EGFR promoter (p53 bindingsseter) -luc plasmid var en gave fra Dr. L. Pirisi [10]. Sekvens modifikasjoner innen en koding av en DNA-bindende domene av det menneskelige ΔNp63α uttrykk plasmid og innen EGFR promoter p53-bindingssetet 1 ble introdusert ved hjelp av Quick-Change Side mutagenese Kit (Stratagene, La Jolla, CA).
immunoblotting
Cellene ble lysert i RIPA-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM natriumfosfat, 1 mM NaVO3, 1 nM EDTA, 1 nM EGTA, supplert med protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN) og 1 mM PMSF). Proteiner ble analysert ved immunblotting som beskrevet tidligere [11]. Følgende antistoffer ble brukt: p63 (4A4, Millipore, Billerica, MA, 1:500); TAp63γ (Li et al, 2006;. 1:1,000), 14-3-3σ (Abcam, Cambridge, MA, 1:500), ERK-2 (C-14, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1: 10.000), p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, 0,4 ug /ml), EGFR (Calbiochem, 1:2,000), spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), spaltet caspase-3, ERK-1/2 , fosfor-ERK1 /2 [T202 /Y204], Akt, fosfor-Akt [S473] (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1,000), aktiv JNK (Promega, Madison, WI), pepperrot peroksidase-konjugert anti- mus og anti-kanin antistoffer (BioRad; 1:5,000).
Revers transkripsjon polymerase chain reaction (RT-PCR)
Total RNA ble isolert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA ). cDNA ble syntetisert fra 1 ug RNA ved tilfeldig heksamer priming ved hjelp av Superscript III RT Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført ved anvendelse av forover og revers primere som var spesifikke for p63 isoformer som tidligere er publisert [12]. De følgende PCR-sykkelbetingelser ble benyttet: 94 ° C i 3 minutter, 35 sykluser ved 94 ° C i 40 sekunder, 55 ° C i 40 sekunder og 72 ° C i 1,5 min; og 72 ° C i 4 min.
For analyse av ΔNp63 og TAp63 avskrift uttrykk kvantitativ real time PCR (Q-PCR) ble utført i en 7300 Sequence Detector bruker Universal PCR Master Mix i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, Foster City, CA), mal cDNA og genet spesifikke prober (Hs00978339_m1 [ΔNp63]; Hs00978349_m1 [TAp63]; Applied Biosystems). Alle prøvene ble analysert i duplikater.
Forbigående transfections, adenovirus infeksjon og luciferase analysene
Panc-1 og T3M4 celler ble transient transfektert med ExGen 500
in vitro
Transfeksjon Reagens ( Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Maryland), som bruker like mye eksperimentell eller kontroll plasmid. Celler ble inkubert i 48 timer og protein-ekspresjon ble bekreftet ved immunblotting. Styre- og ΔNp63α-uttrykkende adenovirus ble anvendt som beskrevet [13]. ASPC-1 og PANC-1-celler ble infisert med adenovirus ved MOI på ~ 5 i komplett medium i 24 timer.
For luciferase-assays, PANC-1-celler ble ko-transfektert med plasmid eksperimentell eller kontroll og luciferase reporter konstruksjon (PBV-14-3-3σ promoter BDS 2 3 × (p53 bindingssetet) -luc, eller pGL3-EGFR promoter-luc) sammen med pCMVβ vektor (Clontech Laboratories, Mountain View, California). Mengden av DNA pr transfeksjon ble holdt konstant ved hjelp av tom vektor pcDNA3.1. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon og luciferase analysene ble utført ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega). Relative lysenheter ble bestemt ved hjelp av et luminometer (LMaxII
384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) for ildflue luciferase. β-galaktosidase-aktivitet ble bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk metode for å normalisere transfeksjonseffektivitet [14].
Lentiviral shRNA-mediert gen tie
Lentivirus innehold shRNA målretting α-spesifikke, TAp63 spesifikk, alle p63 og isoformene sh kontroll ble beskrevet tidligere [15]. Lentivirus-basert 14-3-3σ-målretting og kontroll shRNA ble også beskrevet av oss tidligere [11]. Lentiviral partiklene ble produsert ved fire plasmid transfeksjon system [11]. Knockdown av p63 isoformer og 14-3-3σ i T3M4 og PANC-1-celler ble bekreftet ved Western blotting og Q-PCR.
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5 -diphenyltetrazolium-bromid (MTT) assay
Celler ble sådd ut i 96-brønn plater (3000 celler per brønn, 6 brønner per prøve) og dyrket i fravær eller nærvær av 10 ug /ml cisplatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 48 timer. MTT (Sigma-Aldrich) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon 0,55 ug /ml. Etter ytterligere 4 timers inkubasjon, ble absorbans ved 570 nm bestemt ved anvendelse av en Emax presisjonsmikroplateleser (Molecular Devices). Vi har tidligere sett at i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer MTT analysen korrelerer med cellevekst som bestemmes i en dobling og [
3H] tymidin inkorporering analyser [16].
soft agar analyser
soft agar analyser ble satt opp i tolv-brønners plater hvor hver brønn inneholdende et bunnlag på 0,5% Difco agar edel (BD Biosciences), et midtre lag av 0,3% agar, inkludert 1500-celler, og et toppsjikt av 0,3% agar. Platene ble inkubert i 14 dager. Deretter 150 ul av 5 mg /ml MTT-oppløsning ble tilsatt til hver brønn. Etter inkubasjon ved 37 ° C i 4 timer plater ble fotografert og kolonier ble talt opp.
Cell migrasjon og invasjon analyser
Cell bevegelighet ble vurdert i
in vitro
sårtilheling og Transwell migrasjon analyser. For sårheling analysene ble celler dyrket til konfluens i 6-brønners vevskulturplater, og serum-sultet i 12 timer. Den resulterende celle-monosjikt ble oppskrapt med en 10 ul pipettespiss generering av to parallelle sår og inkubert i 18 timer i serumfritt medium (SF, 0,1% bovint serumalbumin) i fravær eller nærvær 1 nM EGF (Millipore). Bildene ble tatt av hver brønn ved fire avmerkede stedene under 40 år x forstørrelse på null og 18 timer etter såret. Såret området matchet bildene ble målt ved hjelp av ImageJ programvare (National Institutes of Health). For Transwell migrerings assays, ble cellesuspenderes i 100 ul SF medium og plassert på det øvre rom av Transwell kamre (8 um porestørrelse, Corning Incorporated, Corning, NY). For invasjon analyser ble cellene suspendert i 500 mL SF medium og plassert på øvre kammeret av Matrigel-belagte Transwell kamre (8 mikrometer pore størrelse, BioCoat Matrigel Invasion Chambers, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). I begge Transwell analyser, ble det nedre rom fylt med 750 ul SF medium i fravær eller nærvær av 1 nM EGF. Etter 18-20 timer, ble membraner løst i metanol, farget med toluidinblått (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) og telles ved hjelp av et lysmikroskop.
Formaldehyd kryssbinding, kromatin immunpresipitering (chip) og PCR forsterkning
for DNA-histon tverrbinding, 2 x 10
6-celler ble inkubert med 1% formaldehyd i komplett medium i 10 minutter. Celler ble vasket to ganger i iskald PBS og lysert i SDS Lysis Buffer (Millipore) utstyrt med protease inhibitor cocktail (Roche). Protein lysater ble ultralydbehandlet for å gi kromatin fragmenter av rundt 500 bp som bestemt ved agarosegel-elektroforese. Etter pre-clearing, ble proteinlysatene inkubert ved 4 ° C over natten med 2 ug p63α antistoff (H-129, Santa Cruz) eller med kanin IgG som isotype-spesifikke styre antistoffer (Santa Cruz). Immunokomplekser ble vasket og DNA ble renset ved anvendelse av brikken Assay Kit (Millipore) og QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. PCR-betingelser og primere for 14-3-3σ konsensus-bindingsseter 1 og 2 som tidligere er rapportert [17]. De følgende PCR-primere og betingelser ble anvendt for EGFR-promoteren p53-bindingssete: forover primer 5′-GGCCGCTGGCCTTGGGTC 3 «; revers primer 5»-GCCGTGCGCGGTGGTTG 3 «; En syklus på 94 ° C i 5 minutter, 43 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 50 sekunder, etterfulgt av en syklus på 72 ° C i 10 min. PCR ble utført ved anvendelse av HotStarTaq polymerase Kit (Qiagen), med bruk av Q-Solution i EGFR-PCR-analyse.
cisplatin-indusert apoptose
bukspyttkjertelkreft-celler ble inkubert i 24 timer i komplett medium i fravær eller nærvær av 5 eller 10 pg /ml cisplatin for den første 2 timer, 6 timer, eller hele 24 timer. Både flytende og tilhenger celler ble samlet og utsatt for immunoblotting.
Resultater
ΔNp63α uttrykk i bukspyttkjertelen kreftcellelinjer
Vi fant at p63 ble uttrykt forskjellig i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer . p63 protein nivåer var høyest i T3M4 og BxPC3 celler, middels i Colo-357 og under deteksjonsnivå i ASPC-en og PANC-1 celler (Fig. 1a). Siden p63-antistoff (klon 4A4) føres alle seks kjente isoformer av p63, vi sammenlignet med p63-mRNA-transkriptnivåene i de ovennevnte cellelinjer. Alle cellelinjene uttrykte lave nivåer av mRNA TAp63 (Fig. 1B). I motsetning ble ΔNp63 mRNA transkripter relativt forhøyet i BxPC3, Colo-357, og T3M4 celler (Fig. 1B).
En
, Protein nivåer av p63, 14-3-3σ, TAp63γ og p53 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer.
B
, mRNA uttrykk for TAp63 og ΔNp63 isoformer av p63 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Total RNA isolert fra PDAC cellelinjer ble revers-transkribert og utsatt for real-time PCR med prober spesifikke for 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen.
C
, nedregulering av ΔNp63α bremser spredning av T3M4 celler i en klonogene analysen. Tilberedning av ΔNp63α delvis gjenoppretter proliferativ evne. Celler ble sådd ut på 6-brønners plater i en tetthet på 500 celler /brønn. 14 dager senere, platene ble løst i 03:01 metanol: iseddik og farget med 2% krystallfiolett. Dataene er gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo. *, P 0,01 sammenlignet med kontroll (sh ctrl).
D-F
, Effekt av p63 på cellemotilitet målt i sårhelende analyser i PANC-en (
D
) og T3M4 celler (
E, F
). Celler ble inkubert i serumfritt (SF) betingelser i fravær eller nærvær av 1 nM EGF i 18 timer etter at en skramme. Kvantitativ analyse av bildene ble utført. Ektopisk uttrykk for mus ΔNp63α i sh p63α T3M4 celler resulterte i en delvis restaurering av cellemotilitet (
F
); tilsvar ΔNp63α protein nivåer vist nedenfor. Dataene er den m ± SE av minst tre uavhengige forsøk. Representative bildene vist (forstørrelse × 40). *, P 0,001 sammenlignet med kontroll (sh ctrl).
G og H
, Effekt av ΔNp63α på invasjonen i Matrigel kamre. PANC-1 (
G
) eller T3M4 (
H
) celler ble sådd ut i matrigel kamre (5 x 10
4 /ml) og inkubert i fravær (SF) eller nærvær av 1 nM EGF i 18 timer. Effekten var normalisert til invasjon av kontroll i SF forhold. *, P. 0.001 sammenlignet med kontroll (sh ctrl)
Siden forankringsuavhengig vekst er et kjennetegn på ondartede celler, studerte vi om ΔNp63α har en effekt på forankringsuavhengig vekst og celledeling i PDAC. PANC-1ΔN, men ikke PANC-1TA celler utstilt økte kolonidannelse i myke agar analyser og økt celledeling i MTT-analyser (Fig. 2B). Siden T3M4-celler er i stand til å danne kolonier i myk agar, ble proliferasjon studert i en klonogene assay. Sammenlignet med kontrollceller ble spredning av T3M4 celler redusert respons på shRNAs som er rettet mot DBD eller α-spesifikke C-terminalen og uendret i respons til sh TAp63 (Fig. 2C). Transient overekspresjon av mus ΔNp63α cDNA, som bærer en taus mutasjon i regionen som skal oppnås med α-spesifikke shRNA, resulterte i en delvis redning av den proliferative evne sh p63α T3M4 celler, sammenlignet med celler transfektert med kontroll-vektor (Fig. 2C ).
ΔNp63α er kjent for å regulere adhesjonen programmet i mammary epitelceller og keratinocytter [15]. Gitt viktigheten av celleadhesjon i tumorinvasjon og progresjon, studerte vi effektene av ΔNp63α på motilitet og invasive egenskapene til kreft i bukspyttkjertelen celler. I sårhelende analyser, PANC-1ΔN celler vist forbedret bevegelighet i SF forhold, mens overekspresjon av TAp63α hadde ingen effekt (fig. 2D). Siden aktivering av EGFR reaksjonsveien er forbundet med økt tumor aggressivitet og minsket overlevelse i PDAC [21], søkte vi å bestemme virkningen av EGF på motilitet. EGF-stimulering forbedret migrasjon i PANC-1ΔN og kontrollceller (fig. 2D). Tilsvarende T3M4 celler uttrykker sh p63α, men ikke sh TAp63, viste redusert bevegelighet både ved start og i nærvær av EGF (Fig. 2E). Transient overekspresjon av mus ΔNp63α i T3M4 celler som uttrykker sh p63α resulterte i en delvis redning av bevegeligheten fenotype (Fig. 2F). Manipulering av ΔNp63α ekspresjonsnivåer hadde ingen effekt på invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler i matrigel kamre i SF betingelser (fig. 2G, H). Imidlertid stimulering med EGF ført til en dramatisk økning i invasiv evnen til PANC1-Sn-celler (fig. 2G). I samsvar med ovennevnte funn, shRNA-mediert hemming av ΔNp63α, men ikke TAp63, betydelig redusert evne T3M4 celler til å invadere gjennom Matrigel respons på EGF stimulering (Fig. 2 H).
Samlet tyder våre resultater at ΔNp63α forbedrer kolonidannende, proliferative og invasiv kapasitet av kreft i bukspyttkjertelen celler.
ΔNp63α oppregulerer EGFR og sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler for virkningene av EGF
Sammenlignet med de vanlige bukspyttkjertelen, EGFR protein og mRNA blir uttrykt i høye nivåer i bukspyttkjertelkreft [22]. EGFR mRNA uttrykk spår redusert overlevelse og dårlig respons på kjemoterapi hos pasienter med PDAC [23]. I vårt arbeid, ΔNp63α dramatisk potenseres kreft i bukspyttkjertelen celle motilitet og invasive evner i nærvær av EGF. For å forklare dette fenomen, studerte vi effekten av ΔNp63α på EGFR nivåer. Vi fastslått at konstruert uttrykk for ΔNp63α i PANC-1 celler forbedrede EGFR uttrykk, mens ektopisk TAp63α hadde ingen effekt (fig. 3A). I samsvar med denne observasjonen, fant vi at EGFR nivåene ble redusert i T3M4 celler som respons på shRNA-mediert hemming av ΔNp63α (Fig. 3B), og dermed dokumentere en direkte sammenheng mellom ΔNp63α og EGFR uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. For å studere effekter av ΔNp63α overekspresjon på EGFR-signalering, vurdert vi aktivering av nedstrøms kinaser ved EGF stimulering. Behandling av PANC1-Sn-celler med EGF resulterte i forbedret fosforylering av ERK, JNK og Akt (Fig. 3C). I disse celler, oppviste alle tre kinaser øket nivå av aktivering på et så tidlig som 10 minutter etter cellestimulering, og ERK-aktivitet vedvarte i 60 minutter.
A
, ektopisk ekspresjon av ΔNp63α resultater i økt uttrykk av EGFR og β1-integrin i PANC-1 celler. Etter at cellene ble inkubert i 48 timer, ble de totale proteinlysatene utsatt for immunblotting. Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist.
B
, nedregulering av ΔNp63α i T3M4 celler resulterer i redusert uttrykk av EGFR og β1-inte. Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist.
C
, PANC-1ΔN og PANC-1 kontrollceller ble stimulert med EGF under angitte tidsperioder. Protein lysater ble utsatt for immunblotting. Et representativt bilde av tre uavhengige eksperimenter er vist.
Deretter benyttet vi en tyrosinkinasehemmer å hevde at effekten av ΔNp63α ble formidlet gjennom EGFR veien. Erlotinib er en reversibel inhibitor av EGF-signalering, som assosierer med den ATP-bindingssetet til reseptoren. Inkubasjon av PANC-1-celler med 1 uM erlotinib dempes den ΔNp63α-mediert økning av kolonidannelse, motilitet og invasjon (fig. S2) og derved utelukke en mulighet for en ikke-spesifikk effekt. I motsetning til dette ble p63 protein nivåer ikke påvirket når cellene ble inkubert med enten EGF eller erlotinib (data ikke vist).
Tidligere rapporter antydet at ΔNp63α er i stand til å regulere celle adhesjonsproteiner i mammary epitelceller [15]. Siden integrin-mediert tumorcelle interaksjoner med den ekstracellulære matrise spille en avgjørende rolle i å bestemme invasiv fenotype i PDAC, vi undersøkt om ΔNp63α hatt en effekt på inte uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler. Ektopisk ekspresjon av ΔNp63α i PANC-1-celler økt ekspresjon av β1-integrin, mens ekspresjonen av α3- og a5-integriner var uendret (fig. 3A). Omvendt, shRNA-mediert undertrykkelse av ΔNp63α førte til en nedgang i β1-integrin i T3M4-celler (fig. 3B).
således ΔNp63α bidrar til onkogene potensialet av kreft i bukspyttkjertelen celler, i det minste delvis, via oppregulering av EGFR og β1-inte.
ΔNp63α bidrar til cellegift resistens i kreft i bukspyttkjertelen celler
Siden PDAC er notorisk resistent mot kjemoterapi agenter, studerte vi rollen som ΔNp63α i kjemoterapi motstand. Det har tidligere vært vist at cisplatin induserer nedbrytning av ΔNp63α via stimulering av IKB-kinase [24]. I samsvar med disse dataene, inkubasjon av bukspyttkjertelkreft cellelinjer med 10 mikrogram /ml cisplatin resulterte i degradering av endogen ΔNp63α. Denne effekten av cisplatin var tydelig etter 6 timers inkubering og ble ledsaget av økt apoptose i alle testede cellelinjer (Fig. 4A). Vi deretter undersøkt om ektopisk uttrykk for ΔNp63α ville bidra til resistens mot cisplatin-indusert apoptose i PDAC. PANC-1-celler ble inkubert i 24 timer i komplett medium supplert med 5 ug /ml cisplatin i 2, 6 eller 24 timer. PANC-1ΔN celler oppviste en svak dempning av apoptose sammenlignet med kontrollceller, som manifestert ved redusert PARP og caspase spalting (Fig. 4B). Denne reduksjonen av cisplatin-indusert apoptose korrelert med en økning i levedyktigheten til PANC-1ΔN-celler som bestemt i en MTT analyse, mens PANC-1TA celler oppviste en litt redusert overlevelse (fig. 4C). I motsetning til dette ble T3M4 celler som uttrykker sh p63α sensibilisert overfor cisplatin-indusert apoptose, som vist ved et øket spaltning av PARP og caspase (fig. 4D). Dermed ΔNp63α demper følsomheten av kreft i bukspyttkjertelen celler til cisplatin.
En
, Effekt av cisplatin på ΔNp63α i PDAC. Celler ble inkubert med 10 ug /ml cisplatin for de første 6 eller hele 24 timer. Apoptose ble bestemt ved å overvåke PARP-spaltning.
B-D
, Effekt av ΔNp63α på cisplatin-indusert apoptose i PANC-en (
B, C
) og T3M4 celler (
D
). Celler ble inkubert med 5 pg /ml cisplatin under angitte tidsperioder. Celler ble pelletert etter 24 timer inkubering, proteiner isolert og kjørt på SDS-PAGE-gel. Apoptose ble bestemt ved å overvåke PARP og caspase-3 spalting. Et representativt bilde av minst tre uavhengige eksperimenter er vist. PANC-1-celler ble inkubert med 10 ug /ml cisplatin for de første 12 timer eller 48 timer i forveien. MTT-analysen ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Dataene er middelverdien ± SE av tre uavhengige eksperimenter.
ΔNp63α oppregulerer 14-3-3σ i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
Neste vi studert mekanismene for ΔNp63α-mediert chemoresistance i PDAC . Vi har tidligere vist at 14-3-3σ dramatisk forbedrer motstand mot cisplatin-indusert apoptose i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer [11]. Westfall et al. viste at ΔNp63α virker som en transkripsjons repressor av 14-3-3σ promoteren i humane epidermale keratinocytter [25]. Derimot, observerte vi at ekspresjon av ΔNp63α korrelert med 14-3-3σ protein ekspresjon i kreft i bukspyttkjertelen celler (Fig. 1A). I tillegg ble tie ΔNp63α ledsaget av reduksjon i 14-3-3σ proteinnivå i T3M4-celler (fig. 2A). 14-3-3σ er en p53 transkripsjonen målet, men BxPC3 er Panc-1 og T3M4 celler kjent for å bære mutant p53 som transkripsjonen aktivitet er defekt [26], mens Colo-357 celler uttrykker lave p53 protein nivå (Fig. 1A) . Derfor er 14-3-3σ uttrykk usannsynlig å være avhengig av p53 i PDAC.
For å finne ut om ΔNp63α modulerer 14-3-3σ uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler, introduserte vi ΔNp63α cDNA via adenovirus infeksjoner i ASPC- 1 og PANC-1-celler som uttrykker lave nivåer av 14-3-3σ og ΔNp63α. Det ble observert en økning i 14-3-3σ proteinnivåer i ΔNp63α overekspresjon celler sammenlignet med kontroll-infiserte celler (Fig. 5A). Dette ΔNp63α-mediert økning i 14-3-3σ ikke forbundet med endringer av proteinnivåene for de andre 14-3-3 isoformer (Fig. 5A). I motsetning til manipulering av 14-3-3σ nivåer i PANC-1 og T3M4 celler har ikke en effekt på ΔNp63α (fig. 5B og 5C).
A, ASPC-1 og PANC-1-celler ble infisert med adenovirus inneholdende enten tom vektor eller full lengde ΔNp63α, og hel celleprotein lysat ble fremstilt i 48 timer etter infeksjon og probet med anti-ΔNp63α og 14-3-3σ og andre 14-3-3 isoformer.
B
, Overuttrykte 14-3-3σ hadde ingen effekt på ΔNp63α nivåer. PANC-1-celler ble transfektert med tom vektor (Sham) eller med full-lengde human cDNA 14-3-3σ som ble merket med HA.
C
, Dempe 14-3-3σ påvirker ikke ΔNp63α. T3M4 celler ble infisert med lentivirus inneholder kontroll eller 14-3-3σ bestemt shRNAs (sh 14-3-3σ 1 og 2), ble helcellelysater utarbeidet 72 timer etter infeksjon og undersøkt for ΔNp63α og 14-3-3σ.
