Abstract
Bakgrunn
Bukspyttkjertel adenokarsinom er en dødelig sykdom med 5 års overlevelse på mindre enn 5%. 5-fluorouracil (5-FU) er et viktig førstelinjebehandling, men behandlingen strekker bare overlevelse beskjedent og er sjelden kurativ. Legemiddelresistens og tilbakefall av sykdommen er typisk, og det er et stort behov for å overvinne dette. For å undersøke kjøpte 5-FU motstand i bukspyttkjertelen adenokarsinom, etablerte vi kjemoresistent monoklonale cellelinjer fra Panc 03,27 cellelinje ved langvarig eksponering for økende doser av 5-FU.
Resultater
5 -FU-resistente cellelinjer utstilt økt uttrykk av markører assosiert med multiresistens forklare deres redusert følsomhet for 5-FU. I tillegg er 5-FU-resistente cellelinjer viste endringer som er typiske for et epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), inkludert oppregulering av mesenchymale markører og økt invasivitet. Mikromatriseanalyse avslørte L1CAM vei som en av de mest oppregulert baner i kjemoresistent kloner, og en betydelig oppregulering av L1CAM ble sett på RNA og proteinnivå. I kreft i bukspyttkjertelen, er uttrykk for L1CAM forbundet med en kjemoresistent og vandrende fenotype. Ved hjelp av esiRNA målretting L1CAM, eller ved blokkering av den ekstracellulære del av L1CAM med antistoffer, viser vi at den økte invasivitet observert i kjemoresistent cellene funksjonelt avhengig av L1CAM. Bruke esiRNA rettet mot β-catenin og /eller Slug, viser vi at i de kjemoresistent cellelinjer, avhenger L1CAM uttrykk på Slug snarere enn p-catenin.
Konklusjon
Våre funn etablere Slug-indusert L1CAM uttrykk som en formidler av en kjemoresistent og vandrende fenotype i bukspyttkjertelen adenokarcinomceller
Citation. Lund K, Dembinski JL, Solberg N, Urbanucci A, Møller IG, Krauss S (2015) Slug-Dependent oppregulering av L1CAM er Ansvarlig for økt invasjon Potential av kreft i bukspyttkjertelen celler etter Long-Term 5-FU behandling. PLoS ONE 10 (4): e0123684. doi: 10,1371 /journal.pone.0123684
Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt: 02.10.2014; Godkjent: 02.02.2015; Publisert: 10 april 2015
Copyright: © 2015 Lund et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Microarray data kan finnes i GEOarchive, tiltredelse nummer GSE58386. Alle andre relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. KL er grunnlagt av Forskningsrådet i Norge, gi nr. 205 783, og Affitech Research AS. Affitech Forskning støttet AS delvis KL under en industriell PhD, sammen med Forskningsrådet Norge, gi nr. 205783. AU ble finansiert av Molecular Life Sciences (Universitetet i Oslo) og Helse Sør-Øst. NS ble finansiert av Den Norske Kreftforening. JLD ble finansiert av Norges forskningsråd Norge. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Affitech Forskning støttet AS delvis KL under en industriell PhD, sammen med Forskningsrådet av Norge, gi nr. 205783. Imidlertid har Affitech Research AS ingen økonomiske interesser i dette arbeidet. Forfatterne herved staten at dette ikke endrer sin tilslutning til eventuelle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
bukspyttkjertelen adenokarsinom er en svært dødelig sykdom. Den tidlige forløpet av sykdommen er ofte asymptomatiske fører til bare 8% av tilfellene blir diagnostisert på dette stadiet. Utsiktene for sent stadium adenokarsinom pasienter er dyster, med bare 20% av pasientene være kandidater for kirurgi (på grunn av sen diagnose /metastase), noe som resulterer i en 5-års overlevelse på mindre enn 5% [1]. Nåværende behandlingstilbud tilgjengelig kan forlenge overlevelse og lindre symptomer hos pasienter, men ikke helbredende i de fleste tilfeller.
5-Fluorouracil (5-FU) har i lang tid vært en etablert form av cellegift for bukspyttkjertelen adenokarsinom, sammen med medikamentet gemcitabin [2]. Men iboende (de novo) og ervervet resistens er store hindringer for å lykkes med 5-FU basert kjemoterapi i bukspyttkjertelen adenokarsinom og andre svulster [3]. Ervervet medikamentresistens, som utvikles under behandling, blir ofte manifestert ved flere motstandsdyktig mekanisme, og er derfor terapeutisk vanskelig å reversere.
5-FU reduserer biosyntesen av pyrimidinnukleotider ved å inhibere tymidylatsyntase (TS), et enzym som katalyserer det hastighetsbegrensende trinn i DNA-syntese [4]. Selv om mekanismene for resistens mot 5-FU er fortsatt uklart, har flere rapporter knyttet chemoresistance i forskjellige solide tumorcellelinjer til epitelial til mesenchymale overgang (EMT) [5-8]. EMT er en fundamental embryologiske prosess som kjennetegnes ved forandringer i morfologi, cellulær arkitektur, signalisering og adhesjon som fører til en vandrende fenotype [9]. Når EMT skjer i kreftceller, disse cellene mister epitelceller funksjoner og få en mer invasiv og vandrende fenotype som fører til utvidet metastatisk potensial. Molekylære markører for EMT er økt uttrykk for vimentin og N-cadherin og økt uttrykk av transkripsjonsfaktorer som undertrykker E-cadherin uttrykk, inkludert Twist, sneglen, og Slug [10].
L1 celleadhesjonsmolekyl (L1CAM ) er et høyt konservert trans glykoprotein av immunglobulin super som først ble identifisert til å spille en rolle i utviklingen og regenerering av nervevev [11]. L1CAM ekspresjon er blitt observert i en rekke kreftcellelinjer og vev, og høy L1CAM ekspresjon er ofte assosiert med dårlig prognose og korte overlevelsestid [12]. L1CAM har vært knyttet til EMT i flere forskjellige krefttyper, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [13-18]. Spesielt har L1CAM vært forbundet med en kjemoresistent og vandrende fenotype i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) [19-21]. For å undersøke mekanismene som er involvert i oppkjøpet av 5-FU motstand, etablerte vi 5-FU-resistente kloner fra bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje Panc 03,27, og utsatt cellelinjene til funksjonelle tester og microarray analyse. De kjemoresistent Panc 03.27 celler gikk fenotypiske forandringer forenlig med en EMT, og uttrykk for EMT-relaterte markører, særlig L1CAM, økt betydelig. Knockdown studier viste at L1CAM uttrykk i 5-FU-resistente kloner var avhengig av transkripsjonsfaktor Slug men ikke på β-catenin, og knockdown av L1CAM bekreftet en funksjonell kobling mellom L1CAM og proliferativ og invasiv potensialet i kjemoresistent Panc 03,27 kloner. Knockdown studier viste videre at L1CAM moderat beskyttet kjemoresistent B1V celler fra apoptose indusert av 5-FU. Våre funn gi ytterligere innsikt i de molekylære mekanismene som fører til en kjemoresistent og vandrende fenotype i kreft i bukspyttkjertelen celler og fremheve viktigheten av å ta Slug-indusert L1CAM uttrykk i tilbakevendende PDAC.
Resultater
Utvikling av 5-FU-resistente kloner
Panc 03.27 5-FU-resistente cellelinjer ble generert ved kontinuerlig eksponering av tumorcellene til 5-FU i løpet av en seks måneders periode, som starter ved 0,5 ug /ml 5-FU og økes til 1 ug /ml over tid. For å verifisere den doseavhengige chemoresistance av de oppnådde kloner, ble en dose kurve kjøres til et område på 5-FU konsentrasjoner (0,5-10 ug /ml) over en seks dagers periode. Som forventet, kloner som ble dyrket uten 5-FU utvalg (kalt Nt og Nw) var følsomme for alle konsentrasjoner av 5-FU. I kjemoresistent kloner ble B1Q og B1V normal vekst observert med doser på opptil 1 ug /ml 5-FU, mens høyere konsentrasjoner av 5-FU (5-10 ug /ml) fortsatt hemmet vekst
(figur 1A)
.
(A) kjemosensitiv (NT, NW) og resistente (B1Q og B1V) cellelinjer ble behandlet med 0-10 ug /ml 5-FU) over 6 dager. Grafen viser vekst vs. dager eksponering. (B) Western blot som viser nivåene av tymidylatsyntase (TS) i det kjemosensitiv og kjemoresistent cellelinjer. (C) RNA-nivåer (relativ mengde) av ABCB1 (MDR1) og ABCC5 målt ved RT-PCR. (D) Western blot som viser nivåene av Survivin i kjemosensitiv og kjemoresistent cellelinjer. Feilfelt representerer standardavvik. Statistisk signifikant forskjell mellom kjemosensitiv og kjemoresistent kloner (P 0,05) er angitt med *
5-FU-resistente kloner vise resistensmekanismer
5-FU følsomhet har. vist seg å være omvendt relatert til nivået av tymidin-syntase (TS) protein i kreftceller, og 5-FU-resistente tumorer som vanligvis uttrykker høye nivåer av TS-protein [22,23]. Høy ekspresjon av TS i kreftvevet er en indikator på dårlig prognose for 5-FU-kjemoterapi for pasienter med kolorektal kreft [24]. Proteininnholdet av TS ble analysert i alle de fire kloner. TS ble drastisk økt i kjemoresistent kloner B1Q og B1V, som vist ved Western blot analyse
(fig 1B)
. Bruke Taqman RT-PCR, vi neste analyserte RNA nivåer av efflukspumper forbundet med 5-fram og multiresistens [25,26]. Vi har observert en statistisk relevant økning i ekspresjonen av efflukspumper ABCB1 (MDR1) og ABCC5 (MRP5) i de kjemoresistent kloner i forhold til kjemosensitiv klonene
(figur 1C).
Nivået av Survivin ble også sterkt økt i de kjemoresistent kloner som vurdert ved Western blotting
(fig 1 D).
survivin er en inhibitor av apoptose uttrykt i G2 /M-fasen av cellesyklusen, og overekspresjon av survivin er knyttet til motstand mot apoptotiske stimuli induserte av cellegifter [27,28].
5-FU-resistente kloner vise morfologiske endringer som er assosiert med EMT
Når morfologi av 5-FU-resistente kloner ble sammenlignet med sensitive kloner, vises det tidligere en mer mesenchymale-lignende fenotype, med celle spredning og økt dannelse av pseudopodia, mens de sensitive kloner vise et tettpakket epitelial morfologi
(fig 2A)
. 5-FU-resistente celler først større og mer utstrakt enn de følsomme celler. Den mesenchymale-lignende fenotype, som ble opprettholdt i over 30 passasjer, er i tråd med tidligere observasjoner av legemiddelindusert chemoresistance i cellelinjer [29,30].
(A) Phase kontrast bilder som viser celle morfologi normal (NW, Nt) og kjemoresistent kloner (B1Q, B1V), 40x. (B-D) RNA-nivåer (relativ mengde) av vimentin, E-cadherin, og N-cadherin, som målt ved hjelp av RT-PCR. Feilfelt representerer standardavvik. Statistisk signifikant forskjell mellom de kjemosensitiv og kjemoresistent kloner (P 0,05) er angitt med *. (E-G) Western blot immunfarging og som viser nivåene av vimentin, E-cadherin, og N-cadherin, i kjemosensitiv (NT, NW) og kjemoresistent (B1Q, B1V) cellelinjer. (H) og immunfarging (I) Western blot som viser nivåer av CD19 i kjemosensitiv og kjemoresistent cellelinjer. (J) graf som viser resultatene fra 24 timers invasjons analyser utført på klonene, med fasekontrastbilder (20x) som viser representative områder av invaderende celler farget med krystall-fiolett flekk (K). Analysen ble utført tre ganger. Statistisk signifikant forskjell mellom de kjemosensitiv og kjemoresistent kloner (P 0,05) er angitt med *
viktige kjennetegnene ved EMT er en nedregulering av den epiteliale markør E-cadherin ledsaget av en oppregulering av N. -cadherin og vimentin [9]. Følgelig kjemoresistent klonene viste en økning i vimentin
(Fig 2B og 2E) Hotell og N-cadherin
(Fig 2D og 2G)
på både protein og RNA nivåer, og en nedregulering av E -cadherin
(fig 2C og 2F).
Cytokeratin 19 (CK19) er en mellomglødetråd som er delvis ansvarlig for den strukturelle integriteten av celler. Forskjellige cytoskeletal modifikasjoner innenfor en celle er forbundet med malign transformasjon, og et tap av CK19 har vært forbundet med EMT [31] og multimedikamentresistens [32]. Når Nt, NW, B1Q og B1V kloner ble analysert for ekspresjon av CK19 av immunocytokjemi og Western blot ble en massiv reduksjon av CK19 funnet i kjemoresistent kloner i forhold til 5-FU sensitive kloner
(fig 2 H og 2I).
å vurdere om det endrede morfologi som ble observert i kjemoresistent klonene var funksjonelt signifikant, undersøkte vi de invasive egenskapene til de kloner ved hjelp av en matrigel invasjon analysen
(fig 2J og 2K).
kjemoresistent kloner B1Q og B1V var 4 til 6 ganger mer omfattende enn de to kjemosensitiv kloner Nt og Nw.
L1CAM er oppregulert i 5-FU-resistente celler
for å etablere en mer utfyllende molekylære profil mellom de følsomme og ikke-sensitive cellelinjer utførte vi microarray analyse inkludert 5-FU resistente cellelinje B1V og kjemosensitiv klone Nt. 607 gener ble ansett som de presenteres med log2 endring 1
(S1 figur)
. 319 gener ble funnet å være oppregulert og 288 gener ble nedregulert minst to ganger i B1V forhold til Nt (P 0,05)
(S1 og S2 Bord, henholdsvis)
. Gene Ontologi analyse av de 319 oppregulert gener viste at L1CAM interaksjonen veien var en av de mest oppregulert baner i chemosresistant klonene, sammen med cytokin og inflammatoriske responser
(figur 3A)
. L1CAM selv ble oppregulert 4 ganger i de B1V cellene i forhold til NT celler. Kjennetegn på Wnt signal og pluripotency, apoptose, serotonin transporter aktivitet, monoamin transport og glykogen metabolisme ble også funnet å være oppregulert i B1V kjemoresistent cellelinje
(fig 3A og S1 tabell).
(A) Gene ontologi analyse av 319 gener oppregulert i B1V klone forhold til Nt klone av Panc 03,27 cellelinje. (B) RNA-nivåer (relativ mengde) av L1CAM i kjemosensitiv (Nt, Nw) og den kjemoresistent (B1Q, B1V) cellelinjer, som målt ved hjelp av RT-PCR. Feilfelt representerer standardavvik. Statistisk signifikant forskjell mellom de kjemosensitiv og kjemoresistent kloner (P 0,05) er angitt med *. (C) Western blot som viser nivåene av L1CAM i alle cellelinjer. (D) Strømningscytometrisk analyse ved anvendelse av anti L1CAM-PE-antistoff på alle cellelinjene. Ufargede celler er vist i grått og antistoff-fargede celler er vist i sort. (E) immunfarging av L1CAM. Økt membran lokalisering av L1CAM kan sees i den av de kjemoresistent linjer (B1Q, B1V). Bildene er tatt med 40x forstørrelse
Økningen i L1CAM i kjemoresistent kloner ble bekreftet av real-time PCR (P 0,05). Og Western blot analyse (
Fig 3B og 3C, henholdsvis )
. Videre flowcytometrisk analyse ved hjelp av et PE-konjugert anti-L1CAM antistoff viste berikelse av L1CAM positive celler i B1Q og B1V cellelinjene
(Fig 3D)
. Til støtte for denne observasjonen, immunhistokjemi viste en tydelig L1CAM uttrykk i membranen av kjemoresistent kloner B1Q og B1V men ikke i kjemosensitiv cellene Nt og Nw
(Fig 3E)., En del av de kjemoresistent celler også utstilt kjernekraft L1CAM immunoreaktivitets.
L1CAM er involvert i spredning og invasivitet av 5-FU-resistente kloner, og moderat beskytter kjemoresistent celler fra 5-FU-indusert apoptose
EMT har blitt assosiert med økt invasivitet av tumorceller [33], og tidligere publiserte rapporter viste at L1CAM utløser celle migrasjon og invasjon i flere krefttyper [15,18,34]. For å undersøke om oppregulering av L1CAM er involvert i økt invasjon potensialet i kjemoresistent celler, ble uttrykket av L1CAM slått ned ved hjelp esiRNA. esiRNA er endoribonuclease forberedt siRNA bassenger består av en heterogen blanding av siRNAs at alle på den samme mRNA sekvens. esiRNA behandling dramatisk redusert proteinnivå L1CAM i kjemoresistent cellelinjer B1Q og B1V
(fig 4A)
, sammenlignet med celler transfektert med kontroll esiRNA (målretting EGFP). Når analysert for invasivitet i en matrigel invasjon kammer antall invasive celler etter L1CAM knockdown var signifikant lavere sammenlignet med den negative kontroll etter 24 timer invasjon
(figur 4B).
For å undersøke forholdet mellom invasivitet av ytterligere kjemoresistent kloner og L1CAM ekspresjon ble celler behandlet med enten et antistoff rettet mot den ekstracellulære del av L1CAM (klon UJ127.11), eller en mus isotype kontroll-antistoff, før en invasjon assay eksperiment (invasjonsanalysetidene ble øket til 48 timer). Våre resultater viser at behandling av B1Q og B1V celler med den L1CAM antistoffet betydelig redusert sin invasivitet sammenlignet med behandling med kontrollantistoffet. I motsetning behandling kjemosensitiv Nt og Nw celler med L1CAM antistoff hadde ingen effekt på invasivitet
(fig 4C).
(A) Kontroll western blot viser nivåene av L1CAM etter transfeksjon med esiRNA målretting L1CAM eller kontrollere esiRNA, som beskrevet i
Materiale og metode
. Actin brukes som lasting kontroll. (B) Diagram som viser antall invaderende celler (24 timer invasjon analyser) etter transfeksjon med esiRNA målretting L1CAM eller kontrollere esiRNA. Eksperimenter ble utført to ganger med lignende resultater. Representative resultater er vist. (C) Diagram som viser antall av invaderende celler (48 h invasjon analyser) med celler behandlet med 2 ug /ml anti-L1CAM antistoff (klon UJ127.11) eller kontroll isotype antistoff i 1 time ved romtemperatur før de ble tilsatt til invasjon analyseplate. (D) Incucyte vekstkurver (96 timer) av alle cellelinjer etter transfeksjon med esiRNA målretting L1CAM eller kontrollere esiRNA. Eksperimentet ble utført i tre paralleller. (E) Den kjemosensitiv cellelinje Nt og kjemoresistent cellelinje B1V (F) ble behandlet med 1 pg /ml 5-FU i 72 timer etter transfeksjon med esiRNA målretting L1CAM eller kontroll, og Annexin V strømningscytometriske analyser ble utført. Hvert forsøk ble gjentatt to ganger med lignende resultater. Prosenter i grafene viser annexin-V-positive celler.
Overekspresjon av L1CAM har vist seg å fremme tumorcelle-proliferasjon, og følgelig, kan inhibering av L1CAM ekspresjon eller funksjon undertrykke proliferasjon [35-37]. For å undersøke om knockdown av L1CAM hatt innflytelse på cellevekst i kjemoresistent celler, utførte vi
in vitro
spredning analyser. Alle cellelinjer ble utsatt for L1CAM og kontrollere esiRNA behandling, og andelen løpet ble målt over tid ved en IncuCyte automatisert leser
(Fig 4D)
. Målingene startet 24 timer etter esiRNA transfeksjon. Vi har tidligere observert at virkningen av esiRNA knockdown på proteinnivået avtar gradvis etter 72 timer (resultater ikke vist), men for å oppnå en riktig vekst kurve forsøkene ble utført i minst 96 timer etter transfeksjon. De vekstkurver viste ingen effekt av esiRNA behandling rettet mot L1CAM på kjemosensitiv cellelinjer Nt og Nw. Men kjemoresistent cellelinjer B1Q og B1V vises betydelig redusert vekst etter L1CAM knockdown
(Fig 4D)
viser at L1CAM uttrykk er involvert i celle spredning av kjemoresistent cellene.
Når anti- L1CAM antistoff som hemmet invasjon i kjemoresistent cellene ble lagt til
in vitro
spredning analyser, kunne vi ikke se noen forskjell i prosent celle samløpet mellom celler behandlet med antistoffet sammenlignet med celler behandlet med kontroll antistoff. Dette ble utført på alle fire cellelinjer.
L1CAM har vist seg å spille en rolle i mediering av chemoresistance mot gemcitabin og etoposid i PDAC cellelinjer [38]. For å vurdere om L1CAM ble involvert i medie motstand til 5-FU i kjemoresistent Panc 03.27 cellelinjer, ble Annexin V flowcytometrisk analyser utført i Nt og B1V celler 72 timer etter at cellene ble behandlet med L1CAM eller kontrollere esiRNA i nærvær og fravær av 1 ug /ml 5-FU. Som forventet, Nt-celler behandlet med en kontroll esiRNA viste en signifikant dreining mot Annexin V-positive celler etter å ha blitt utsatt for 5-FU (fra 0,87% til 18,32%). I kontrast, fikk kontroll behandles B1V celler bare viser en liten økning (fra 1,19% til 2,22%) i Annexin V positive celler i respons til 5-FU behandling
(Fig 4E og 4F)
. Knockdown av L1CAM ikke vesentlig endre satsene for apoptose i kjemosensitiv cellelinje Nt, enten i nærvær eller fravær av 5-FU behandling sammenlignet med ctrl knockdown
(Fig 4E)
. Imidlertid knockdown av L1CAM økt prosentandel Annexin V-positive celler, både med og uten 5-FU-behandling. Dermed ser L1CAM til moderat beskytte kjemoresistent B1V celler fra apoptose i fravær av 5-FU, og mer så i nærvær av 5-FU
(Fig 4F).
Transkripsjonell regulering av L1CAM avhenger Slug, men ikke på β-catenin
Tidligere studier har involvert både Slug og β-catenin i transkripsjonsregulering av L1CAM [14,39-41]. Slug er en transkripsjonsfaktor som er involvert i EMT og invasivitet i bukspyttkjertelkreft [34,42]. L1CAM anses å være et mål for β-catenin, nøkkelen formidler av kanoniske Wnt signal med en rolle i den kontekstuelle regulering av spredning, beslutningspunkter mellom «stemness» og differensiering, cellenes stoffskifte og EMT [39,43]. Siden microarray analyse viste en oppregulering av komponenter som kan bidra til kanoniske Wnt signal i kjemoresistent cellene
(fig 3A)
, nivåene av β-catenin i kjemosensitiv og kjemoresistent cellelinjer ble undersøkt. RNA-nivåer av β-catenin ble betydelig høyere (P 0,05) i kjemoresistent kloner
(Fig 5A)
, men i microarray økningen var mindre enn to ganger og dermed ikke vises på listen av gener som var mer enn to ganger oppregulert i microarray
(S1 Table)
. Western blots viser ingen forskjell i nivåene av total β-catenin protein mellom kjemosensitiv og kjemoresistent cellene, hverken i cytoplasma eller i kjernen.
(Fig 5A)
. Aktive β-catenin nivåer, målt ved hjelp av et antistoff detektere bare aktiv (ufosforylert) protein, ikke ble endret enten (resultater ikke vist).
(A) RNA-nivåer (relativ mengde, RT-PCR) og western blot viser protein nivåer av β-catenin i kjemosensitiv (Nt, NW) og kjemoresistent (B1Q, B1V) cellelinjer. (B) RNA-nivåer (relativ mengde, RT-PCR) og western blot viser proteinnivåer Slug i kjemosensitiv (Nt, NW) og kjemoresistent (B1Q, B1V) cellelinjer. Protein nivåer av Slug i western blot ble kvantifisert ved hjelp av Image Studio Lite (versjon 3.1.4) (normalisert mot laste kontroller). (C) Nivåer av L1CAM følgende transfeksjon med esiRNA rettet mot β-catenin eller kontrollere esiRNA. (D) Nivåer av L1CAM følgende transfeksjon med esiRNA målretting Slug eller kontrollere esiRNA. Kvantifisering av båndintensitetene kan sees i de nedre plater i (C) og (D). (E) Diagram som viser antallet av invaderende celler (24 h invasjons assays) etter transfeksjon med esiRNA målretting Slug eller kontrollere esiRNA, i kombinasjon med 2 ug /ml anti-L1CAM antistoff (UJ127.11) eller kontroll isotype antistoff i 1 time ved værelses temperatur. Eksperimenter ble utført to ganger med lignende resultater. Representative resultater er vist. Actin brukes som lasting kontroll i alle vestlige blotter. Feil barer i RT-PCR grafer representerer standardavvik. Statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) mellom kjemosensitiv og kjemoresistent kloner er angitt med *
Slug viste ikke endringer i microarray, som også ble bekreftet av RT-PCR
. (fig 5B)
. Men en Western blot analyse viste en klar oppregulering av Slug protein nivåer i begge kjemoresistent cellelinjer i forhold til kjemosensitiv cellelinjene
(Fig 5B).
For å teste effekten av β-catenin og Slug på uttrykk for L1CAM, både β-catenin og Slug var målrettet av esiRNA. Knockdown av Slug, men ikke β-catenin, føre til en nedgang i L1CAM protein nivåer
(Fig 5C og 5D).
Når Slug og β-catenin ble slått ned samtidig i kjemoresistent celler, ingen ytterligere reduksjon i nivåene av L1CAM ble observert (resultater ikke vist)
Når analysert for invasivitet etter Slug knockdown, B1Q og B1V celler viste redusert invasivitet i forhold til de esiRNA kontrollcellene (24 h invasjon;
fig 5E). , etter på en lignende måte som det som ble sett med knockdown av L1CAM
(figur 4B).
Forbehandling med L1CAM-antistoff i tillegg til Slug knockdown ikke ytterligere redusere invasiv evne til kjemoresistent linjene
(fig 5E).
Selv om kjøp av 5-FU-motstand induserte en rekke endringer i Panc 03.27 bukspyttkjertelen adenokarcinomceller identifiserte vi L1CAM og regulering gjennom Slug som en viktig formidler av en invasiv fenotype og ervervet chemoresistance, og som en potensiell terapeutisk mål.
Diskusjoner
5-FU var systemisk behandling av valget for avansert kreft i bukspyttkjertelen i mange år, men i slutten av 90-tallet ble det vist at stoffet gemcitabin var overlegen i forhold til 5-FU i å kontrollere sykdomsrelaterte symptomer [44]. Imidlertid er 5-FU fortsatt en anbefalt behandlingsalternativ for kreft i bukspyttkjertelen i dag [45], og flere nyere studier har vist en verdifull rolle for 5-FU i kombinerte behandlingsprotokoller sammenlignet med enkelt gemcitabin kjemoterapi [46,47].
Motstand mot cellegifter er en viktig årsak til behandlingssvikt og dårlig prognose i bukspyttkjertelkreft. I denne studien har vi vist at kreft i bukspyttkjertelen cellelinje Panc 03,27 utsatt for langvarig eksponering for 5-FU utviklet resistens og kjøpte prototypiske molekylære funksjoner, inkludert oppregulering av tymidylatsyntase, Survivin og narkotika pumper. Videre viste vi at kjemoresistent cellene ble flere mesenchymale-lignende og gjennomgikk EMT-relaterte endringer, inkludert tap av epiteliale markører (E-cadherin og CK19) og økt uttrykk av mesenchymale markører vimentin og N-cadherin og transkripsjonsfaktoren Slug . Vi viste en oppregulering av L1CAM i 5-FU-resistente celler, noe som er i tråd med tidligere funn som støtter hypotesen om at L1CAM blir oppregulert ved kreftceller som en del av EMT prosessen [13-18]. Vi var videre i stand til å koble L1CAM til prosessen med å EMT ved å demonstrere at den økte invasivitet av kjemoresistent cellene var avhengig av L1CAM, og at ekspresjon av L1CAM var avhengig av Slug. I tråd med denne observasjonen, Gavert
et al
. viste at stimulering av pankreas duktale epitelceller med TGF-β1 førte til anskaffelse av en spindel-formet celle morfologi og oppregulering av mesenchymale proteiner og L1CAM uttrykk, som var avhengig av JNK-mediert aktivering av Slug [40].
i bryst carcinoma cellelinje MCF7, og oppregulering av L1CAM vist seg å føre til forstyrrelse av E-cadherin-holdige adherens veikryss og derved å øke transkripsjonen aktivitet av β-catenin [48]. Aktivering av β-catenin bidratt til vedvarende L1CAM uttrykk og forbedret cellemotilitet [48], noe som er på linje med andre bevis som viser at L1CAM er et mål på β-catenin signal [39]. Imidlertid har våre resultater viser ikke endret protein ekspresjon eller lokalisering av β-catenin i kjemoresistent cellene, og enda viktigere, knockdown av β-catenin har ikke redusere nivåene av L1CAM, noe som indikerer at L1CAM ekspresjon ikke ble regulert av β-catenin i disse celler. Våre resultater er dermed i tråd med funn av Pfeifer
et al
. viser i endometriet som Slug, og ikke β-catenin, er ansvarlig for oppregulering av L1CAM [41].
Overekspresjon av L1CAM har vist seg å fremme tumorcelle-proliferasjon, og inhibering av L1CAM ekspresjon eller funksjon kan undertrykke spredning [35-37]. Knockdown av L1CAM redusert spredning i kjemoresistent Panc 03,27 cellelinjene
(Fig 4D)
. Denne reduksjonen i veksten ble ikke sett i kjemosensitiv cellelinjer ikke uttrykker L1CAM. Våre resultater peker mot en bestemt rolle for L1CAM i spredning av 5-FU-resistente kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre arbeid er nødvendig for å forstå effekten av L1CAM på spredning, men andre rapporter peker mot en link til ERK1 /2 og Akt-trasé, som begge er kjent for å akselerere spredning og vekst av kreftceller [35,37,49 , 50]. Videre kan den reduserte spredning sett de kjemoresistent kloner følgende L1CAM knockdown i figur 4D delvis være et resultat av den lille økning i apoptose sees på figur 4F, etter L1CAM knockdown.
Interessant nok viste det økte invasivitet ved vår kjemoresistent kloner ble redusert når L1CAM ble slått ned, eller når den ekstracellulære delen av L1CAM ble blokkert med et antistoff. Økt invasivitet gjennom oppregulering av L1CAM er muligens en av mange forskrifter nedstrøms Slug etter induksjon av EMT.
Det er noen motstridende rapporter om rollen L1CAM spiller i prosessen med EMT. For eksempel, Gavert
et al
. nylig viste at L1CAM mediert metastasering av tykktarm kreft celler var unnværlig for EMT induksjon og et endret uttrykk av epitel og mesenchymale markørproteiner [51]. Videre studier er nødvendig for å utdype hvorvidt oppregulering av L1CAM er en del av EMT eller til og med det induserende hendelsen. L1CAM kanskje ikke en EMT-mekler selv, men ser ut til å være regulert av EMT-indusert Slug, og en gang uttrykte det ser ut til å kjøre invasjon.
L1CAM har vist seg å være involvert i formidling av chemoresistance mot gemcitabin og etoposid i PDAC cellelinjer [38]. Vi undersøkte om knockdown av L1CAM redusert ervervet resistens mot 5-FU vises ved cellelinjen B1V. I våre hender, L1CAM ut til moderat beskytte cellene mot apoptose i fravær av 5-FU, og mer så i nærvær av 5-FU.
Videre studier er planlagt for å undersøke om behandling med anti-L1CAM antistoffer vil redusere vekst eller metastasering av våre 5-FU-resistente bukspyttkjertelkreft cellelinjer
in vivo
. Oppdagelsen av at kreft i bukspyttkjertelen celler med ervervet resistens mot 5-FU viser økt uttrykk av L1CAM, i tillegg til æren av L1CAM tilstedeværelse i kreft vs. normalt vev [52], gjør at vi håper at målretting av L1CAM med terapeutiske antistoffer og /eller i kombinasjon med 5-FU kan potensielt ha nytte utvalgte pasienter med ildfaste pankreastumorer. follows;
ABCB1-Hs00184500_m1
ABCC5-Hs00981087_m1
CTNNB1-Hs00355049_m1
GAPDH-Hs02758991_g1
Vimentin-Hs00185584_m1
CDH1/Ecadherin-Hs01023894_m1
CDH2/Ncadherin-
