Abstract
proteintyrosinkinase 6 (PTK6) er en ikke-reseptor typen tyrosinkinase som kan være involvert i noen kreftformer. Imidlertid er den biologiske rolle og ekspresjon status av PTK6 i bukspyttkjertelkreft ukjent. Derfor er i denne studien evaluerte vi den funksjonelle rolle av PTK6 på bukspyttkjertelkreft invasjon. Fem bukspyttkjertelkreft cellelinjer uttrykte PTK6 med varierende grad. PTK6 uttrykk ble også observert i menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinomer. PTK6 undertrykkelse av siRNA betydelig redusert både cellulær migrasjon og invasjon (0,59 /0,49 ganger for BxPC3, 0,61 /0,62 for Panc1, 0,42 /0,39 for MIAPaCa2 henholdsvis
p 0,05
for hver). I kontrast, tvunget overekspresjon av PTK6 ved transfeksjon av en PTK6 uttrykk vektor i Panc1 og MIAPaCa2 celler økt cellulær migrasjon og invasjon (1,57 /1,67 ganger for Panc1, 1,44 /1,57 for MIAPaCa2 henholdsvis
p 0,05
) . Dempe PTK6 redusert ERK1 /2-aktivering, men ikke AKT eller STAT3 aktivering, mens PTK6 overekspresjon øket ERK1 /2 aktivering. U0126, en spesifikk inhibitor av ERK1 /2, fullstendig opphevet virkningen av PTK6 overekspresjon på cellulær migrering og invasjon. Disse resultatene tyder på at PTK6 regulerer cellemigrasjon og invasjon i bukspyttkjertelkreft via ERK signalering. PTK6 kan være en roman terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Ono H, Basson MD, Ito H (2014) PTK6 Fremmer Cancer Migrasjon og invasjon i kreft i bukspyttkjertelen celler avhengig av ERK signalnettverk. PLoS ONE 9 (5): e96060. doi: 10,1371 /journal.pone.0096060
Redaktør: Noriko Gotoh, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Japan
mottatt: 22 november 2013; Godkjent: 02.04.2014; Publisert: 01.05.2014
Copyright: © 2014 Ono et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av forfatternes interne avdelinger forskningsfond. Den Funder (Department of Surgery, Michigan State University) hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksistere.
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødelighet i USA. [1] Utfallet av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen har vært trist med en 5% 5-års-overlevelse. [2] Den dødelighet av kreft i bukspyttkjertelen er på grunn av sin aggressive biologiske atferd, inkludert et stort potensial for invasjon og metastasering, og motstand mot tilgjengelige anti-kreft agenter. De molekylære mekanismene som er ansvarlig for disse egenskapene er i stor grad ukjent, og må forstås å forbedre behandlingsresultatene av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Protein tyrosinkinase 6 (PTK6), eller bryst svulst relatert kinase (BRK) er en ikke-reseptor typen tyrosin kinase. Det er relatert til c-Src-kinase-familien, som har SH2 SH3 og domener. [3] PTK6 fremmer celledifferensiering i normale epitelceller og er så vidt uttrykt i modne epiteliale celler i mage-tarmkanalen, brystet eller hud. [3] – [5] Selv om avvikende overekspresjon av PTK6 har blitt identifisert i en rekke epiteliale kreftformer, inkludert kreft i bryst, lunge, melanom, prostata, tykktarm, og eggstokk, funksjoner av PTK6 i kreft biologi har ikke blitt fullstendig karakterisert. [3], [6] -. [12]
I denne studien evaluerte vi rolle PTK6 på kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og utforsket nedstrømssignalene som kan medierer en slik virkning. Våre funn tyder på at PTK6 regulerer invasivitet ved å aktivere ERK og øker muligheten for at PTK6 kan være en viktig ny molekylære mål å forbedre effektiviteten av behandling for kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Material
Dyrkingsmedier medier~~POS=HEADCOMP, føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (P /S) ble erholdt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anti-PTK6 antistoff ble hentet fra Santa Cruz biokjemi (Santa Cruz, California), anti-P44 /42 ERK1 /2, anti-fosfor-P44 /42 ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), anti-p38 MAPK, anti-fosfor -p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), anti-STAT3, og anti-fosfo-STAT3 (Tyr705) antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA), og anti-β-aktin-antistoff ble oppnådd fra Sigma-Aldrich. Den selektive ERK1 /2-hemmer U0126 ble hentet fra Sigma-Aldrich.
menneskelig vev
kreft i bukspyttkjertelen vev lysbilder ble hentet fra Avdeling for patologi ved Sparrow Hospital, Lansing MI. Bruk av arkiverte prøver for denne studien ble godkjent av Michigan State University (MSU) og Sparrow Hospital Institutional Review Boards (IRBs). Vår IRB komiteen fravikes behovet for samtykke. Ni pasienter som gjennomgikk pankreas reseksjon for pankreatisk duktus adenokarsinom fra 2002 om 2012 ble valgt ut og ble inkludert i denne studien. De arkiverte formalinfikserte, parafininnstøpte prøvene ble delt på en rotasjonsmikrotom på 4 mikrometer tallet. Enzyminduserte epitop gjenfinning ble utført ved 0,03% protease E i 10 minutter ved 37 ° C. Anti-PTK6-antistoff ble fortynnet i 1/100 med normal antistoffdiluent (NAD) (Scytek – Logan, UT) og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Antigen-antistoffreaksjoner ble visualisert med avidin-biotin-peroksidasekompleks system (R.T.U. Vectastain Elite ABC-reagens, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Skinnene ble gjennomgått og PTK6 uttrykk ble gradert i henhold til cytoplasma fargeintensitet som følger; negativ, ingen flekker eller svak intensitet flekker på mindre enn 5% av cellene; svak til moderat positiv, svak til moderat intensitiy; sterk positiv, sterk intensitet.
cellekulturer
Menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer BxPC3, Capan1, Hs766T, Panc1, og MIA PaCa2 ble hentet fra American Type Culture Collection. BxPC3 ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% P /S i en fuktet (37 ° C, 5% CO
2) kammer. De andre cellelinjer ble holdt i DMEM medium inneholdende 10% FBS og 1% P /S.
Western Blot analyse
Cellene ble lysert i cellelyseringsbuffer (Cell Signaling Technology) med 1 mM fenylmetansulfonylfluorid (Cell Signaling Technology). Proteinkonsentrasjonen av hver cellelysat ble estimert ved BCA-analyse (Pierce Chemical). Cellelysater inneholdende totalt 20 pg protein, ble påført på 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Invitrogen, Grand Island, NY). Etter å ha blitt blokkert med Tris-bufret saltoppløsning med 0,2% Tween-20 (TBST) inneholdende 5% BSA eller skummet melk i 4 timer ved romtemperatur ble membranene inkubert med antistoff i passende fortynning ved 4 ° C. Pepperrot-peroksidase-konjugert esel-anti-kanin-IgG eller sau anti-mus IgG (GE Healthcare, Piscataway, NJ) ble anvendt som sekundære antistoffer og inkubert med membranene i en 1/3000 fortynning i 1 time. β-actin ble brukt som en lasting kontroll markør for normalisering av hvert kjørefelt.
genet Slå av Small interfering RNA
Loss-of-funksjon analyse ble utført ved hjelp sirnas målretting PTK6 (s11487, Ambion Grand Island, NY: følelse 5′-CAUCCAUGGUUAAGUCAUAtt-3 «, anti 5′-UAUGACUUAACCAUGGAUGaa-3′) og negativ kontroll (Silencer Velg negativ kontroll # 2 siRNA, Ambion). Et annet par siRNAs rettet mot PTK6 og negativ kontroll ble brukt (PTK6 og negativ kontroll, Invitrogen, St Louis, MO: Stealth RNAi-PTK6HSS183907 følelse 5»-CAGGCUGUGCGGCACUACAAGAUCU-3 «, antisense- 5′-AGAUCUUGUAGUGCCGCACAGCCUG-3» og Stealth RNAi Negative kontroll Medium GC Duplex, henholdsvis). Hver siRNA (10 nmol /l) ble transfektert inn i bukspyttkjertelcancerceller ved hjelp av Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Knockdown av et mål genet ble bekreftet på 96 timer med western blotting
Overuttrykte PTK6 av Stable Transfeksjon
Menneske PTK6 cDNA (cloneID: 5746034). Ble kjøpt fra Open Biosystems (Pittsburg, PA ) og amplifisert ved PCR ved anvendelse av primere (5′-CCCAAGCTTATGGTGTCCCGGGACCAGGC, og 3′-CGGGATCCTCAGGTCGGGTTCTCGTAGC). PCR-produktet ble satt inn i ekspresjonsvektoren pcDNA3.1-myc /His B (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Den etablerte PTK6 ekspresjonsvektor ble underkastet DNA-sekvensanalyse for å bekrefte den korrekte innskuddet av fulle lengder av PTK6 cDNA. PTK6 ekspresjonsvektor eller tilsvarende tom vektor ble transfektert inn kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 72 timers transfeksjon, ble cellene inkubert i dyrkningsmedium som inneholdt passende konsentrasjoner av G418. Ved kultur i seleksjonsmedium containg G418 over 2 uker, ble stabil transfektant celler valgt ut. Uttrykket av PTK6 protein ble senere bekreftet av western blotting.
Transwell migrasjon og invasjon analysen
Transwell migrasjon og invasjon analyser ble utført i 24-brønn modifiserte Boyden kamre forhåndsbelagt med (invasjon) eller uten (migrasjon) Matrigel (transwell-kammer, BD Biosciences, San Jose, CA,). Kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC3 1 × 10
5 celler, Panc1, 5 × 10
4 celler, og MIAPaCa2, 7,5 × 10
4 celler per brønn, henholdsvis) i serumfritt medium ble sådd på trans-membran i det øvre kammer med 10% FBS i det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter en 24 timers inkubering ble cellene som hadde migrert gjennom membranen fiksert og farget med Diff-Quik Stain Set (Siemens, Newark, DE). De ble deretter telles under forstørrelse i 5 tilfeldig utvalgte høy effekt felt. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer
Statistical Analysis
Sammenligning av de kontinuerlige verdier ble utført ved hjelp av t-test og 2-sidig
p
-verdier. 0,05 ble ansett signifikant.
Resultater
PTK6 Expression Status i bukspyttkjertelen
Vi har sammenlignet PTK6 nivåer i fem etablerte menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer (BXPC3, Capan1, Hs766T, MIAPaCa2, og Panc1 ) og kreft i bukspyttkjertelen vev tatt direkte fra 9 pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon. Western blot viste at de 5 bukspyttkjertelcellelinjer uttrykte PTK6 på ulike nivåer; BXPC3 og Capan1 uttrykt PTK6 robust, mens MIAPaCa2 uttrykte et mye lavere nivå av PTK6 (figur 1A). Farging for PTK6 i bukspyttkjertelkreft vev fra 9 pasienter viste at PTK6 ble sterkt uttrykt i 4 pasienter (44%), svakt til moderat uttrykt hos 2 pasienter (22%), og ikke uttrykt i det hele tatt hos 3 pasienter (33%). I den tilstøtende normal bukspyttkjertelen duct epitel, immunoreactive PTK6 var ikke påvises i noen av prøvene vi undersøkt (Figur 1b).
En
, Endogen uttrykk for PTK6 i humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. PTK6 uttrykk ble bekreftet i 5 bukspyttkjertelkreft cellelinjer, BXPC3, Capan1, Hs766T, MIAPaCa2, og Panc1 på ulike nivåer ved Western-blotting.
B
, Immunhistokjemisk staning for PTK6 i tilstøtende normalt bukspyttkjertelen og kreft i bukspyttkjertelen vev. Mens det var ingen påviselig PTK uttrykk i tilstøtende normalt bukspyttkjertelen ductal epitel (øverst til venstre), ble PTK6 uttrykt på ulike nivåer (fra negativ gjennom sterkt positiv) i bukspyttkjertel kreft.
PTK6 Expression påvirker celle migrasjon og invasjonen av bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Flere studier har antydet at PTK6 påvirker cellemaskineriet formidling migrasjon og invasjon. [13] – [15] Vi har derfor en hypotese om at PTK6 er en viktig regulator av kreft i bukspyttkjertelen migrasjon og invasjon og vi evaluert effekten av redusert PTK6 uttrykk på disse celle atferd. Etter PTK6 uttrykk ble undertrykt av genet Slå hjelp siRNA (fra Ambion) i 3 bukspyttkjertelkreft cellelinjer (figur 2A), ble den vandrende potensialet for kreft i bukspyttkjertelen celler analysert ved hjelp av en Boyden kammer. Som vist i figur 2B, genet Slå av PTK6 betydelig redusert migrering i alle 3 bukspyttkjertelcancercellelinjer (0,59 gangers nedgang i BXPC3, 0,61 i Panc1, 0,42 i MIAPaCa2, henholdsvis
p
0,05 for hver) . Cellulær invasiv potensial på samme måte ble analysert ved hjelp av Matrigel-belagte Boyden kammere, og invasjon ble betydelig redusert av genet Slå av PTK6 i alle 3 bukspyttkjertelcancercellelinjer, slik som vist i figur 2C (0,49 gangers nedgang i BXPC3, 0,62 i Panc1, 0,39 i MIAPaCa2 henholdsvis
p
0,05 for hver). Disse hemmende effekter av PTK6 genet Slå på celle migrasjon og invasjon ble bekreftet av lignende eksperimenter med annen siRNA rettet mot annen sekvens av PTK6 (fra Invitrogen) (figur S2).
En
, PTK6 genet demping. Cellene ble transfektert med PTK6 spesifikke siRNA (siRNA-PTK6) eller negativ kontroll-siRNA (siRNA-NC) i 96 timer. Knockdown av PTK6 uttrykk ble comfirmed ved Western-blotting. Tallene nederst viser den relative intensiteten av bandene for PTK6 til tilsvarende kontroller (normalisert ved β-aktin).
B
,
C
, Effekten av PTK6 genet Slå på cellemotilitet (B) og invasjon (C). Celler ble behandlet med PTK6 spesifikke siRNA eller negativ kontroll-siRNA i 48 timer, deretter utsatt for migrering og invasjon analyse ved bruk av Boyden kammere uten eller med Matrigel. Gene stanse av PTK6 redusert cellemigrasjon i alle 3 bukspyttkjertelkreft cellelinjer (0,59 ganger reduksjon i BXPC3, 0,61 i Panc1, 0,42 i MIAPaCa2 henholdsvis *
p
0,05 ved t-test). Tilsvarende genet Slå av PTK6 redusert cellulær invasjon i alle 3 bukspyttkjertelkreft cellelinjer (0,49 ganger reduksjon i BXPC3, 0,62 ganger i Panc1, 0,39 ganger i MIAPaCa2 henholdsvis *
p
0,05 etter t-test). Hver analyse ble utført i tre eksemplarer.
Omvendt evaluert vi neste effekten av PTK6 overekspresjon om migrasjon og invasjon. En ekspresjonsvektor som koder for full lengde PTK6 cDNA ble transfektert inn i Panc1 og MIAPaCa2 celler og stabile transfektanter overekspresjon PTK6 ble etablert for hver cellelinje (figur 3A). I motsetning til effekten av PTK6 genet Slå, PTK6 overekspresjon økt cellulær migrering og invasjon sammenlignet med kontroller. (1,6 /1,7 ganger økning i Panc1, og 1.4 /1.6 i MIAPaCa2, for trekkfugl og invasiv potensial, henholdsvis
p
0,05) (figur 3B, 3C) Disse funnene tyder på at PTK6 uttrykk i bukspyttkjertelen kreft er assosiert med mobilnettet trekkfugl og invasiv potensial.
En
, Overuttrykte PTK6. Cellene ble transfektert med pcDNA3.1-Mock (tom vektor) eller pcDNA3.1-PTK6. Overekspresjon av PTK6 i stabil trasfectant ble bekreftet ved Western blotting i Panc1 og MIAPaCa2 celler, henholdsvis. Tallene i bunnen indikere den relative intensiteten av båndet for PTK6 til de tilsvarende kontroller (normalisert ved β-aktin).
B
,
C
, Effekten av PTK6 overekspresjon på cellemigrasjon (B) og invasjon (C). Etablerte transfektant celler ble evaluert med migrasjon og invasjon analyser. Tvunget overekspresjon av PTK6 økt cellemigrasjon i Panc1 og MiaPaCa2 bukspyttkjertelen kreftceller (1,6 ganger økning for Panc1, og 1,4 ganger for MIAPaCa2 henholdsvis *
p
0,05 ved t-test). Tilsvarende tvunget overekspresjon av PTK6 økt cellulær invasjon i disse 2 cellelinjer (1,7-dobling for Panc1, og 1,6 ganger for henholdsvis MiaPaCa2, *,
p
0,05 ved t-test). Hver analyse ble utført i tre eksemplarer.
MAPK /ERK Signa er en kritisk megler i PTK6 relaterte cellemotilitet
For å belyse den mekanismen som PTK6 regulerer cellulær migrasjon og invasjon, vi utforsket signalveier nedstrøms til PTK6. Flere signalmolekyler er tidligere blitt rapportert å være nedstrøms for PTK6, inkludert STAT3 [16], Akt [17], [18], Erk5 [15], [19], p38 MAPK [19], og ERK1 /2 [20] (anmeldt i Ostrander 2010). Når PTK6 uttrykk ble manipulert ved hjelp av siRNA, fosforylering av STAT3, Akt, og p38 MAPK ikke ble endret konsekvent blant 3 cellelinjer vi testet (Figur S1). Aktivering av ERK5 var ikke påvisbar i våre studier (data ikke vist) I motsetning til dette, aktivert (phospholylated) ERK1 /2 var signifikant redusert i alle PTK6-gen-stilnet bukspyttkjertelcancerceller sammenlignet med deres tilsvarende kontrollceller, mens tvungen overekspresjon av PTK6 indusert aktivering av ERK1 /2 i både Panc1 og MIAPaCa2 celler (Figur 4A.B). ERK1 /2 dukket derfor som kandidat til formidler av PTK6 regulert cellular motilitet i bukspyttkjertelkreft og vi følgelig forsøkt å finne ut om effekten av PTK6 på cellulær migrasjon og invasjon avhenge ERK1 /2 aktivitet. Vi brukte selektiv inhibitor av ERK1 /2, U0126 for å hemme ERK1 /2-aktivitet. Som vist i figur 5A, PTK6-indusert ERK /1/2 aktivering ble fullstendig blokkert av U0126 ved 10 uM. Når vi analysert cellulær migrering og invasjon av Panc1 og MIAPaCa 2-celler i nærvær av U0126, U0126 redusert basal cellulær migrering og invasjon og avskaffet evnen til PTK6 overekspresjon å stimulere dem (figur 5B). Dette tyder på at PTK6 regulerer cellemigrasjon og invasjon gjennom ERK1 /2.
En
, Effekt av PTK6 genet Slå på total ERK1 /2 og aktivert (fosforylert) ERK1 /2. Gene stanse av PTK6 reduserte nivået av fosforylert ERK1 /2 i alle 3 bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Tallene i bunnen indikere den relative båndintensitet for pErk1 /2 til tilsvarende kontroller (normalisert ved total ERK1 /2).
B
, Effekt av PTK6 overekspresjon på total ERK1 /2 og aktivert ERK1 /2. Tvunget PTK6 overekspresjon indusert aktivering av ERK1 /2 i både Panc1 og MiaPaCa2 celler. Tallene nederst viser den relative bandet intensitet for pErk1 /2 til tilsvarende kontroller (normalisert ved total ERK1 /2).
En
, Cellene ble behandlet med den spesifikke ERK1 /2-inhibitor, U0126 ved 10 uM i 24 timer. ERK1 /2 fosforylering ble hemmet og PTK6-indusert aktivering av ERK1 /2 ble ikke lenger registreres i Panc1 eller MIAPaCa2 celler.
B
, Effekten av ERK1 /2-hemming på cellemigrasjon (
venstre
) og invasjon (
høyre
) ERK1 /2 hemming ikke bare redusert basal migrasjon og invasjon i Panc1 og MIAPaCa2 celler, men avskaffet effekten av PTK6-overekspresjon om migrasjon og invasjon. *
p
0,05 vs tilsvarende kontroll med DMSO kjøretøy (av
t
-test). **
p
0,05 vs PTK6-overuttrykt celler med DMSO kjøretøy (av
t
-test). Hver analyse ble utført i tre eksemplarer.
Diskusjoner
Selv om det er en samle bevis for at PTK6 er abnormt uttrykt i ulike epiteliale kreftformer, innblanding av PTK6 uttrykk og sin rolle i den biologiske oppførsel av kreft er kontroversiell og dårlig definert. Faktisk er den rolle og funksjon PTK6 trodd sterkt avhengig av i hvilken sammenheng PTK6 uttrykkes. For eksempel har PTK6 blitt grundig studert i bryst kreft for sin
pro
-oncogenic roller inkludert cellecyklusprogresjonen [21], angiogenese [22], anoikis motstand [23] og cellemigrasjon [13], mens PTK6 har vist seg å fungere
anti
-oncogenically i spiserørskreft [24]. Så vidt vi vet, er dette den første studien undersøkte uttrykk og funksjon PTK6 i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Våre viktigste funn i denne studien er at PTK6 overekspresjon øker cellulær migrasjon og invasjon og at PTK6 genet Slå i kontrast, synker dem i kreft i bukspyttkjertelen celler. Effektene av PTK6 på cellulær migrasjon kan variere mellom typene cacners. I de studier av brystkreftceller, er PTK6 blitt rapportert å forbedre EGF-indusert cellulær migrasjon [13] – [15], [19], mens overekspresjon av PTK6 ble rapportert å øke cellulær invasiv potensial ved indusering av epitel mesenkymale oversettelse (EMT) i prostatakreftceller [25]. I motsetning til dette, Ma et al rapporterte at PTK6 reduserer migreringen av esophageal kreftceller [24]. Disse tilsynelatende motsatte rapporter om påvirkning av av PTK6 på kreft biologi markere betydningen av studier som undersøker effekten av individuelle signaler i enkelte typer kreft. Det synes sannsynlig at virkningen av PTK6, i likhet med mange andre signaler, avhengig av den generelle kinome hvori PTK6 uttrykkes. Forstå kinomic forskjellene mellom kreft der PTK6 fremmer migrasjon og de hvor det hemmer migrasjon kan være et fruktbart emne for fremtidige studier. Flere nedstrøms effektor molekyler assosiert med PTK6 er tidligere blitt identifisert i andre kreftformer. Disse inkluderer p190RhoGAP, Rho, RAS [14], Rac1, Paxillin [13], p38MAPK, og ERK5 [15], [19] i brystkreft, og AKT, GSK3p, og βCatenin [24] i spiserørskreft. I denne studien av flere bukspyttkjertelcancercellelinjer, de fleste av molekylene som tidligere er rapportert å være forbundet med PTK6 signalering i andre kreftformer endret seg ikke i virksomhet ved manipulering av PTK6 uttrykk. Det er derfor mindre sannsynlig at disse molekylene spiller en rolle som formidler effekten av PTK6 på cellulær migrasjon /invasjon i bukspyttkjertelkreft. I stedet ERK1 /2 framstått som en viktig nedstrøms formidler av PTK6-forbundet signal som regulerer bukspyttkjertelkreft invasjon. ERK1 /2 er et medlem av mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) familie og er kjent for å påvirke cellulær migrering og invasjon i forskjellige krefttyper, inkludert kreft i bukspyttkjertel [26], [27]. Mekanismer som PTK6 overekspresjon induserer ERK1 /2 aktivisering har ennå ikke bestemt, og det er ukjent om PTK6 samhandler direkte med ERK1 /2. Castro og Lange rapportert at i brystkreftceller PTK6 /ERK5 kompleks er avgjørende for vekstfaktor indusert cellemigrasjon, mens PTK6 fortsatt øker cellemigrasjon av ERK1 /2-aktivering i keratinocytter når ERK5 er slått ned [15]. De spekulert i at ERK1 /2 kan fungere som et alternativ vei for PTK6 /ERK5 signaler i enkelte typer celler som mangler ERK5. Denne modellen vil være i samsvar med våre observasjoner siden vi ikke var i stand til å oppdage ERK5 aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler uavhengig av PTK6 uttrykk status. Imidlertid Xiang et al viste at PTK6 bindes direkte til Erb B2 og aktiverer ERK1 /2 i brystkreftceller. Erb B2 er godt kjent for å være overuttrykt vanligvis i pankreas-kreft [28], [29], så kan dette være en mulig mekanisme ved hvilken tvungen PTK6 overekspresjon i kreft i bukspyttkjertelen celler kan aktiveres ERK1 /2 uten ERK5 aktivitet.
det var interessant å merke seg at mens PTK6 uttrykk var jevnt undetectable i tilstøtende histologisk normale pankreasgang epitelceller, PTK6 nivåer variert betydelig blant bukspyttkjertel kreft vi studerte. Abberant overekspresjon av PTK6 er blitt beskrevet i andre typer av kreft, og det har tidligere vært foreslått at PTK6 kan være et nyttig biomarkør for å forutsi resultatene av pasienter med forskjellige typer kreft, inkludert bryst, hode og hals, eggstokk og lunge-kreft [6], [12 ], [30] – [33]. Potensialet prognostisk verdi av variasjon i PTK6 i bukspyttkjertelkreft venter videre studier.
I sammendraget, vi demonstrert at PTK6 er uttrykt abnormt i bukspyttkjertelkreft. Videre våre resultater tyder på at PTK6 kan fremme cellemigrasjon og invasjonen i bukspyttkjertelkreft ved å aktivere ERK1 /2. Videre undersøkelser av PTK6-avhengige signalveien som driver invasjonen i bukspyttkjertelkreft kan markere potensialet prognostisk og terapeutisk betydning i denne romanen signal i bukspyttkjertelkreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekt av PTK6 genet Slå på aktiviteten til ulike molekyler i signalveier; p38, STAT3, og AKT ble testet slik de var tidligere rapportert å være assosiert med PTK6. Aktiviteten av disse molekylene ble ikke konsekvent påvirket av genet Slå av PTK6 i 3 bukspyttkjertelkreft cellelinjer, BXPC3, Panc1 og MIAPaCa2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096060.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
En
, Effektene av PTK6 genet Slå på total ERK1 /2 og fosforylert ERK1 /2 ved hjelp av siRNA. Av notatet, siRNA brukt i dette eksperimentet har forskjellig sekvens målretting PTK6 fra siRNA brukt i forsøket i figuer 2 og 4. fosforylert ERK1 /2 ble redusert med PTK6 genet Slå i både Panc1 og MIAPaCa2 celler. Tallene i bunnen indikere den relative båndintensitet for PTK6 og pErk1 /2 til tilsvarende kontroller, henholdsvis (normalisert ved β-aktin for PTK6 og total ERK1 /2 for pErk1 /2).
B
, Effekten av PTK6 genet Slå på celle migrasjon (til venstre) og invasjon (til høyre). Gene stanse av PTK6 redusert cellemigrasjon i Panc1 og MIAPaCa2 celler (0,65 ganger reduksjon i Panc1, 0,72 i MIAPaCa2 henholdsvis *
p
0,05 ved t-test). Videre genet Slå av PTK6 redusert cellulær invasjon i Panc1 og MIAPaCa2 celler (0,48 ganger reduksjon i Panc1, 0,78 ganger i MIAPaCa2 henholdsvis *
p
0,05 ved t-test). Hver analyse ble utført i tre eksemplarer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096060.s002 plakater (TIF)
Takk
Vi takker William S. Spielman, Amy S. Porter og Kathy A. Joseph for teknisk assistanse.
Presentert i en del, så en plakat på årsmøtet til Society for Surgery av fordøyelseskanalen, 18. mai
th-21
th, 2013, Orlando, FL.
