Abstract
Endre i verts og /eller humant papillomavirus (HPV) DNA metylering profil er trolig en av de viktigste faktorene ansvarlig for ondartet progresjon av livmorhalskreft til kreft. For å undersøke disse endringene vi studerte 173 livmorhalsprøver med ulike grader av livmorhals lesjon, fra normal til livmorhalskreft. Metylering status for ni cellular genet arrangører,
CCNA1
,
CDH1
,
C13ORF18
,
DAPK1
,
HIC1
,
RARβ2
,
hTERT1
,
hTERT2 Hotell og
TWIST1
, ble undersøkt ved metylering Specific Polymerase Chain Reaction (MSP). Den metylering av HPV18 L1-genet ble også undersøkt av MSP, mens denaturert cytosines innen fire regioner, L1, 5’LCR, Enhancer, og pådriver for HPV16 genomet som dekker 19 CpG steder ble evaluert av bisulfite sekvensering. Statistisk signifikante metylering biomarkører som skiller mellom livmorhals forstadier fra normal cervix var hovedsakelig
C13ORF18 Hotell og dernest
CCNA1
, og de skiller livmorhalskreft fra normale eller livmorhals forstadier var
CCNA1
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2 Hotell og
TWIST1
. I tillegg metylering analyse av enkelt CpG områder av HPV16-genomet i forskjellige prøvegrupper, i særdeleshet 7455 og 7694 områder, vist seg å være viktigere enn den samlede metylering frekvens. Flertallet av HPV18-positive prøver inneholdt både denaturert og unmethylated L1 genet, og prøver med L1-genet metylerte former alene hadde bedre prognose når korrelert med vertscelle-genet promo «metylering profiler. I konklusjonen, bør både mobilnettet og viral metylering biomarkører brukes for å overvåke livmorhals lesjon progresjon for å forhindre invasiv livmorhalskreft
Citation. Milutin Gašperov N, Sabol jeg, Planinić P, Grubisic G, Fistonić jeg, Ćorušić A, et al. (2015) denaturert Host Cell Gene arrangører og humant papillomavirus type 16 og 18 forutsi livmorhalskreft og kreft. PLoS ONE 10 (6): e0129452. doi: 10,1371 /journal.pone.0129452
Academic Redaktør: Robert Dante, Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE, FRANCE
mottatt: 24 desember 2014; Godkjent: 08.05.2015; Publisert: 09.06.2015
Copyright: © 2015 Milutin Gašperov et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den kroatiske departementet for vitenskap, utdanning og idrett (tilskudd 098-0982464-2510). MG ble også støttet av syvende rammeprogram EUs for forskning, teknologisk utvikling og demonstrasjon etter tilskuddsavtalen Ingen 316289. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forholdet mellom humant papillomavirus (HPV) status og livmorhalskreft (CC) utvikling er godt etablert. Det er minst 15 onkogene eller høy risiko (HR) -HPV typer, hvorav typer 16 og 18 bidrar opptil 71% av krefttilfellene [1]. I motsetning til dette, DNA-metylering av cellulære og virale gener, noe som resulterer i stanse av genekspresjon, har vært mindre studert i livmorhals cancerogenesis [2], selv om det er en av de tidlige hendelsene i karsinogenese i mange andre typer kreft [3]. DNA metylering oppstår ofte på cytosines i CpG dinukleotider av gener for kreftdempere, transkripsjonsfaktorer og cellesyklus regulatorer og dermed hemme genekspresjon av arrangøren stanse [4].
CC forekomsten er relativt sjelden sammenlignet med utbredt HPV-infeksjon ; de fleste kvinner er trolig smittet med minst en om ikke flere typer HPV i løpet av sitt seksuelle liv, og bare en liten andel vil utvikle livmorhals forstadier til kreft og invasiv kreft [5,6]. Faktorer assosiert med progresjon fra forstadier til livmorhalskreft,
i
.
e
. subklinisk HPV-infeksjon til kreft ikke er godt etablert. Både virus og vertsceller gener kan bli målrettet av DNA metylering maskiner [4]. Det faktum at metylering av cellulære gener kan påvises selv i prøver som er tatt opp til syv år før livmorhalskreft diagnose [7], var en av grunnene for denne studien. I tillegg, basert på vår observasjon metylgruppene er stabile i flere år etter at DNA-isolering og lagring ved -20 ° C og i linje med diagnosen tatt ved sampling. Videre kan metylering av HPV-genomet være et vertsforsvarsmekanisme for å undertrykke transkripsjon av fremmed DNA eller strategi at viruset anvender for å opprettholde en langvarig infeksjon av immunosurveilance flukt, eller begge deler [8,9]. Vi antok at metylering i CpG nettsteder HPV16 og HPV18 genomer som undertrykker transkripsjon av HPV gener er en av faktorene som er muligens relevant i livmorhalskreftfremkallende progresjon. Derfor, i denne studien, har vi fokusert på HPV16 og HPV18 positive livmorhalsprøver og analysert CpG metylering av HPV16 og HPV18 genomer samt flere sentrale vertsceller gener.
Det er et sterkt behov for å etablere nøyaktig diagnose og prognostisk metylering profil for et panel av gener som kan diskriminere mellom normale cervices, livmorhalskreft og kreft. Etter gjennomgang av litteraturen fokus på denne saken ved hjelp av lignende prøve basseng og laboratorieutstyr [10-14], har vi snevret valget til ni cellulære gener for å bli undersøkt i denne studien:
CCNA1 plakater (CCNA1, cyclin A1)
CDH1 plakater (CDH1, cadherin 1, type 1, E-cadherin),
C13ORF18 plakater (KIAA0226L, KIAA0226-aktig),
DAPK1 plakater (DAPK1, død-forbundet protein kinase 1),
HIC1 plakater (HIC1, hypermethylated i kreft 1),
RARβ2 plakater (R R, retinsyrereseptor, beta),
hTERT1
,
hTERT2 product: (TERT, telomerase revers transkriptase), og
TWIST1 plakater (TWIST1, vri familie bHLH transkripsjonsfaktor 1). Arrangøren metylering av
CCNA1
,
C13ORF18 Hotell og
RARβ2
fører til forstyrrelse av cellesyklus, metylering av
CDH1
,
DAPK1
hTERT1
,
hTERT2 Hotell og
HIC1
bidra til kreft progresjon ved å øke spredning, invasjon, og /eller metastase mens metylert
TWIST1
betyr svekket cellulær Differensiering. Målet med denne studien var å fastslå metylering profil av vertscelle genet arrangører og samtidig metylering status for HPV16 og 18 genomer for å identifisere de beste metylering diagnostiske og prognostiske biomarkører for livmorhals endringer.
og Diskusjon
Dette er en av de få studier på en omfattende samling antall livmorhalsprøver med veldefinert forskjellig cytologisk /histopatologiske diagnose som analyserer DNA metylering av flere mobilnettet genet arrangører samt HPV16 og HPV18 genomer. Lignende studier har blitt gjennomført av flere forfattere, men enten på et begrenset antall mobil gen arrangører eller begrenset antall analyserte HPV-typer [15-17].
Det er noen relevante litteratur data om metylering status av cellulære gener, følgende
CCNA1
,
CDH1
,
C13ORF18
,
DAPK1
,
HIC1
,
RARβ2
,
hTERT1
,
hTERT2 Hotell og
TWIST1
i livmorhalskreft cellelinjer CaSki, Siha og HeLa [12,18-20]. Heri metylering profiler av de ni genet arrangører testet på cellelinjer CaSki og Siha bekreftet at alle testede genet arrangører ble metylert i CC. I cellelinjen HeLa, bare
DAPK1
arrangøren ble ikke metylert. Metylering profiler av nevnte gen arrangører ble evaluert i ulike utvalgsgrupper: prøver med normal, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3 cytologi, og histopathologically bekreftet CC (tabell 1). I prøven gruppen med normal cytologi var det 20,0% (8/40) HPV positive med en eller flere HR-HPV, hvorav fire HPV16. De fleste av prøvene ble metylert i de fleste testede gen-promotorer.
CDH1
ble funnet å være metylert i de fleste tilfeller (82,5%), etterfulgt av
HIC1 plakater (67,5%),
RARβ2 plakater (62,5%), og
DAPK1 product: (55,0%). Siden de har blitt funnet svært metylert i normal cervix, disse genet arrangører er ikke ideelt metylering biomarkører for livmorhalskreftutvikling. I motsetning til våre funn, Flatley
et al
. [21] funnet
CDH1
promoter metylert i bare 2,3% normale livmorhalsprøver. I kontrast,
hTERT1
ble funnet unmethylated i alle tilfeller.
hTERT1
arrangøren synes å være en lovende metylering biomarkør være unmethylated i normal cervix. Så langt som dette, er det motstridende funnene i Iliopoulos
et al
. [22] som fant den
hTERT1
promoter metylert i en høyere andel på 26,6% i normal cervix. Det faktum at metylering profil av
hTERT1
arrangøren fortsatt relativt lav i livmorhalsen forløper endringer, nemlig LSIL /CIN1 (12,5%), HSIL /CIN2 (5,1%) og HSIL /CIN3 (7,1%), og økninger i CC prøver (70,0%) favoriserer vår hypotese (tabell 1). Selv om litt mindre uttrykt lignende metylering dynamikk er observert med
hTERT2 Hotell og
TWIST1
arrangører. Følgelig hypermethylation av alle tre genet arrangører,
hTERT1
,
hTERT2 Hotell og
TWIST1
kan være bra livmorhalskreft biomarkør, ved bekreftelse på større prøve bassenget. I prøven gruppen med LSIL /CIN1 diagnose var det 55,0% (22/40) HPV positive prøver blant annet seks HPV16 og ni HPV18.
CDH1 Hotell og
HIC1
arrangører ble metylert i den høyeste andelen av tilfeller (75,0%, begge deler), mens
TWIST1
var unmethylated i alle tilfeller. I kontrast, Flatley
et al
. [21] har funnet
CDH1 Hotell og
HIC1
arrangører metylert i mye lavere grad i prøver med samme diagnose, i 1,8% og 7,7% tilfeller, henholdsvis. I tråd med våre funn, høye
HIC1
metylering (67,6%) og fullstendig mangel på metylering i
TWIST1
arrangøren innen samme diagnose ble funnet av Feng
et al
. [23]. HPV ble påvist i 32 av 40 prøver (80,0%) med HSIL /CIN2 diagnose, inkludert seks HPV16 og syv HPV18. På grunn av mislykket bisulfit konvertering i en prøve, studiegruppen inkluderte 39 HSIL /CIN2 prøver, som er spesielt klassifisert som sådan av den kroatiske livmorhals cytologi klassifisering, videre «Zagreb 2002» [24], for å dechiffrere fin forskjeller mellom LSIL og HSIL. Her igjen, ble de fleste av prøvene metylert i de fleste testede gen arrangører,
CDH1
blir metylert i de fleste tilfeller (79,5%), mens
hTERT2
var unmethylated i alle tilfeller. Blant 42 prøver med HSIL /CIN3 diagnose HPV ble påvist i 36 prøver (85,7%), inkludert 17 HPV16 og fem HPV18. ble observert flest denaturert tilfeller i
CDH1 plakater (76,2%), og lavest i
hTERT2 plakater (2,4%) promoter. Andre forfattere rapporterte metylering av de samme genene innenfor det samme prøvegruppen, men litt forskjellige prosentandeler av metylering for hver genpromoteren [21,23]. Men når det gjelder dynamikken i metylering profilen til disse to gen arrangører, virker det som
CDH1
arrangøren er i stadig hypermethylated, mens
hTERT2
promoter er mye mindre denaturert fra normal til høy grad av celleforandringer . I CC gruppen var det 81,8% (9/11) prøver positive for HR-HPV, hvorav syv HPV16 og en HPV18. En CC prøven, stadium IV-A, sterkt nekrotiske, HPV-negative og unmethylated i enten genpromotoren ble utelukket fra videre analyse. De fleste av de undersøkte genet arrangører ble metylert i dette utvalget gruppen, fra 60,0% for
DAPK1
til 100,0% for
CDH1
promoter. Blant CC diagnose
hTERT2
promoter ble metylert i 60,0% av prøvene. I tilfelle av
hTERT
høyere genekspresjon oppnås ved hypermethylation. I studiet av Kumari
et al
. [25] behandling med 5-azacytidin og påfølgende demetylering av
hTERT
promoter ført til reduksjon i genuttrykk. Dette var i motsetning til det som har blitt observert for konvensjonelle tumorsuppressorgener. Det mulig forklaring på dette fenomenet er at metylering av
hTERT
promotorer er heterogen og at bare unmethylated alleler er uttrykt [12]. Faktisk, som ble observert i studiet av Zinn
et al
. [26] hvor de fleste kreftcellelinjer hadde
hTERT
promoter tett denaturert, men CPGs rundt transkripsjon start stedet for et betydelig antall
hTERT
lene var unmethylated. I konklusjonen, her observert hypometylering i normal cervix betyr lavere uttrykk for
hTERT
genet og lavere telomerase aktivitet. Dette kan forklare bedre prognosen for pasienter med CC som svulst cellene mangler
hTERT
arrangøren metylering [27]. Arrangøren metylering funn av andre forfattere på CC prøver korrelerer godt med vår. Metylering varierer over 65% for
hTERT Kjøpe og
DAPK
arrangører [22], 41% for
DAPK
, og mindre for
CDH1
,
HIC Hotell og
RARβ
arrangører [21]. For et høyere antall arrangører,
hTERT
,
CDH1
,
DAPK
,
HIC1 Hotell og
RARβ
metylering varierer selv mer, fra 0 til 100% [27-29].
Heri, har vi identifisert fem hoved metylering biomarkør kandidater,
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
, og
TWIST1
, hvis arrangøren metylering status skiller CC fra normal og HSIL /CIN3 prøvene (tabell 2). Progresjonen fra HSIL /CIN1 til HSIL /CIN2 synes å være relatert til høyere metylering av
RARβ2 Hotell og
TWIST1
promoter, selv om statistisk signifikans er lavere for
RARβ2 product: ( Fishers eksakte test p = 0.024696) enn
TWIST1 plakater (Fishers eksakte test p = 0,001030). Den sent stadium av livmorhals endringer, synes CC å være preget av høy metylering av
hTERT1
,
hTERT2
, og
TWIST1
promoter, og i en lavere grad i
RARβ2
promoter. Vi har også gruppert livmorhals forstadier (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3) for å evaluere forskjeller mellom normal, livmorhalskreft, og CC. I en slik sammenligning
CCNA1 Hotell og
C13ORF18
arrangører viser seg å være statistisk signifikant hypermethylated i livmor forstadier i forhold til normal cervices (Fishers eksakte test p = 0.023742 og 0.022603, henholdsvis). I tillegg virker det metylering av disse to potensielle biomarkører i forhold til normal cervices å være et tidlig hendelse i cervical cancerogenesis, med
C13ORF18
arrangøren blir statistisk signifikant metylert i LSIL /CIN1 og HSIL /CIN2 (Fishers eksakte test p = 0.036738 i begge tilfeller), mens
CCNA1
arrangøren blir statistisk signifikant metylert i HSIL /CIN3 (Fishers eksakte test p = 0,010994). Derfor har statistisk signifikante metylering forskjeller mellom normale cervices, sår og CC blitt observert i fem genet arrangører:
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
og
TWIST
. Oppsummert disse genene arrangører representerer mulige gode metylering biomarkører for påvisning av cervical endringer og kan være nyttig i klinisk praksis. Det virker som i cervical cancerogenesis det er en kaskade av DNA metylering. Primært noen genet arrangører er denaturert, for eksempel
C13ORF18
etterfulgt av
CCNA1
, og deretter andre, nemlig
hTERT1
,
hTERT2 Hotell og
TWIST1 product: (fig 1)
LSIL, lavgradig plateepitel intraepitelial lesjon.; HSIL, høyverdig plateepitel intraepitelial lesjon; CIN, cervikal intraepitelial neoplasi; ↑, hypermethylated; ↓, hypomethylated.
Andre forfattere bestemt noen av de utvalgte gener som gode biomarkører, men mest som en enkelt biomarkør å skille en bestemt diagnose. For eksempel, Yang
et al
. [13] valgt
CCNA1 Hotell og
C13ORF18
som gode metylering biomarkører for å skille prøver med CIN2 + diagnose fra normale prøver. Kitkumthorn
et al
. [18] valgte hypermethylation av
CCNA1
promoter som biomarkør for tidlig diagnose av invasiv CC, De Wilde
et al
. [12] valgte differensiert metylering av
hTERT
å diagnostisere CC, mens Eijsink
et al
. [14] identifisert
C13ORF18 Hotell og
TERT
, sammen med
EPB41L3 Hotell og
JAM3
, som beste metylering biomarkører for CC. Derfor, fra litteraturen er det vanskelig å bestemme de beste metylering biomarkører. I et genom-wide studie med Illumina infinium HumanMethylation450 BeadChip metoden vi bekreftet det høye metylering nivå av
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
og
TWIST1
arrangører i CC sammenlignet med normalt vev. Men uten tilsyn hierarkisk clustering førte til et annet sett av gener som kandidat biomarkører,
RGS7
,
LHX8
,
STGALNAC5
,
TBX20
,
KCNA3
, og
ZSCAN18 product: [30], som ikke ble vurdert her. Videre i samme studie [30], ved hjelp av mRNA uttrykk datasett for ekstern validering, viste vi en god sammenheng mellom DNA metylering data og genuttrykket array. Derfor kan vi konkludere med at DNA metylering er en god prediktor for genekspresjon; dermed DNA-metylering testene er god og tilstrekkelig valg for å bedre diagnostikk, iscenesettelse og prognostics i klinisk undersøkelse på grunn av kostnadene og tiden fordel fremfor genekspresjonsanalyse.
Vi har også undersøkt CpG metylering status for HPV16 og HPV18 genomer i sammenheng med cytologisk /histopatologisk diagnose og metylering status av cellulære gener. Metyleringen mønstre av HPV16-genomet er blitt analysert ved bisulfitt-sekvensering for hver av 19 CpG områder på grunn av avvikende litteraturdata. Som forventet, metylering mønstre av HPV16-genomet i 12 prøver med forskjellige diagnoser, korrelert med de av Siha cellelinje (S1 tabell). De fleste denaturert CPGs i HPV16 genomet Siha celler ble påvist i L1 og promoter-regionen, mens de fleste av unmethylated CPGs i 5’LCR regionen og forsterker (fig 2). Ofte er begge kopier av HPV16, metylert og unmethylated ble funnet i alt diagnose som strekker seg fra normale cervices til livmorhalskreft, der metylering profiler av CC prøvene var svært lik en av Siha cellelinje. I nesten alle prøver med normal cytologi (N) metylering profilen var forskjellig fra de i Siha celler og CC prøver. Alle tre grupper av prøver med livmorhals forløper endringer (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3) hadde svært like HPV16 metylering profiler. På grunn av denne likheten av metylering mønster, er alle tre cervikal forløper-forandringer er vist sammen på fig 3B. I tillegg er alle CpG områder som ble metylert og unmethylated i den samme prøven presenteres som metylert (figur 3). Våre resultater støtter funnene fra Kalantari
et al
. [31] at HPV genom er normalt hypermethylated og trenger bare ett eksemplar å være transkripsjonelt aktiv. Videre, som presenteres her, for en god metylering biomarkør er det mer viktig å nøyaktig bestemme metylering andel av spesifikke CpG områder innen HPV16 genom enn den generelle metylering i ulike utvalgsgrupper. Heri, observerte vi at det cervikale forstadier lesjon gruppe hadde den laveste totale metyleringen frekvens (33%), mens prøver med normal cytologi og CC hadde 53% totalt metylering hastighet både. Disse resultatene er delvis uenig med konklusjonene fra andre forfattere som hevder at metylering av HPV16 er den laveste i normal og den høyeste i CC prøver [17,32,33]. I denne studien fra bassenget av 19 undersøkte CpG områder av HPV16-genomet, to synes å være den mest betydningsfulle, CpG 7455 (5’LCR) og CpG 7694 (enhancer), i hvilken den fullstendige mangel på metylering ble funnet i karsinomceller prøvene og Siha cellelinje, mens de sterkt metylert (100% av de normale cervices og 83% av forstadier i CpG 7455) og moderat metylert (75% av de normale cervices og 33% av forstadier i CpG 7694) i andre prøvegrupper. Videre ble CPGs i posisjonene 7434 og 7461 metylert i 50% av prøvene med normal cytologi, men ingen metylering ble observert i forstadier, CC eller Siha cellelinje. I motsetning til dette ble CpG 31 metylert bare i CC-prøver (50%) og Siha cellelinje. CPGs i posisjonene 37 og 52 ble metylert i 75% prøver med normal cytologi og 100% av forstadier, CC og Siha cellelinje. CpG 58 ble metylert i 50% prøver med normal cytologi og 100% av forstadier og CC, samt i Siha cellelinje. Metylering ble ikke observert i CPGs i posisjonene 7535 og 7862 i verken en av prøvene eller Siha cellelinje. I motsetning til dette ble CpG 7682 metylert i alle undersøkte prøver, precursor cervikale lesjoner, CC og Siha cellelinje (figur 2 og 3). Ulike metylering frekvenser innenfor HPV16 genom på de samme CpG nettsteder fra våre funn og ulike konklusjoner har blitt rapportert av Kalantari
et al
. [34]. Imidlertid ble lignende funn på CpG metylering profiler i CC prøvene til vårt identifisert i studiet av Bhattacharjee og Sengupta [35]. Det er således avgjørende for HPV-aktivitet og følgelig immortalisering av vertsceller fullstendig mangel eller lav CpG metylering i 5’LCR og enhancer, snarere enn i promotor omegn
N, normal cytologi.; Jeg, LSIL /CIN1 diagnose; II, LSIL /CIN2 diagnose; III, HSIL /CIN3 diagnose; CC, livmorhalskreft; Siha, livmorhalskreft cellelinje; M, metylert; U, unmethylated; M + U, metylert og unmethylated med overveiende metylert DNA; U + M, metylert og unmethylated med overveiende unmethylated DNA
Normal cervices (N = 40).; cervical forstadier, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3 (N = 121); livmorhalskreft prøver (N = 10). CpG områder som var denaturert og unmethylated i samme prøve presenteres her som metylert.
Gransker HPV18 L1-genet metylering på 22 prøver (S1 tabell) ved MSP metoden vi observert at det korrelerer med cytologisk /histopatologiske diagnose, og bedre kan forutsi sykdom prognose. Spesielt har de fleste av de analyserte prøver og HeLa-cellelinjen inneholdt både denaturert og unmethylated former av HPV18 L1-genet (tabell 3). Faktum er at L1-genet forblir intakt i livmorhalskreft og kreft prøver, selv når HPV-genomet integreres inn i en vertscelle [36]. Metylering av HPV18 L1-genet i cervical forstadier og CC-prøvene var på linje med diagnose og metylering profilen av HeLa-cellelinjen. Spesielt våre prøver som bare inneholder denaturert form av HPV18 L1-genet hadde bedre prognose;
i
.
e
. i disse prøvene cellulære gener ble metylert ved en lavere grad, og for det meste de som ikke er statistisk vist seg som potensielle biomarkører. Turan
et al
. [37,38] også funnet begge kopier av HPV18 i HeLa cellelinje, med det overskytende av metylert form, mens hypermethylation av HPV18 L1 i alle karsinomer og mangel på metylering i de fleste asymptomatiske flekker og lavgradige lesjoner. Videre Badal
et al
. [39] har erklært at HPV18 genom hypermethylation i HeLa cellelinje og CC prøvene viser at HPV er faktisk målrettet av cellulær DNA metylering maskiner som kan påvirke sent og tidlig gentranskripsjon.
Fremtidige studier bør validere bruk av metylert HR-HPV som en forutsigbar og /eller diagnostisk biomarkør for risikoen for livmorhalskreft blant HPV-positive kvinner [32,40,41]. Spesielt, MSP primere for HPV16-genomet som omfatter CPGs 7455 og 7694 bør være utformet for å unngå kostbare og tidkrevende bisulfitt sekvensering, og, som sådan, forenkle kliniske anvendelser. Vår vurdering av HPV genomet metylering testing sammen med cellular genet metylering testing som triage av kvinner med høy risiko for å utvikle livmorhalskreft ble også allerede diskutert [10,27,42], men spørsmålet gjenstår hvilke HPV-typer, som HPV genom regioner og som cellulære gener å analysere. Vi tror at resultatene som presenteres i denne studien, underforstått etter bekreftelse på et større antall prøver, kan løse disse bekymringene. Derfor vil vi foreslå at alle HR-HPV-positive kvinner får testet for metylering av
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
og
TWIST1
arrangører samt minst HPV16 CpG 7455 og 7694 sider, og HPV18 L1-genet metylering. Testresultatene bør være korrelert, og i tilfelle av økt metylering av kandidat biomarkør gener og endret metylering profil HPV16 og 18 genom kvinner skal styres og deretter overvåkes grundigere (fig 1). I tillegg basert på faktisk kunnskap om cellulære og viral DNA metylering mulig bruk av demetylering narkotika [27,43], for eksempel DNA metyltransferaser hemmere kan anses som terapeutiske men bør brukes med stor forsiktighet.
Material og metoder
Study gruppe
studie~~POS=TRUNC gruppen~~POS=HEADCOMP inkluderte 173 livmorhals eksemplarer av kvinner med normal cytologi, forstadier til kreft (plateepitelkarsinom intraepitelial lesjoner, lavgradig, LSIL og høy klasse, HSIL),
i
.
e
. cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) grad 1-3, klassifisert i henhold til «Zagreb 2002», som er i tråd med «NCI Bethesda System 2001» [24], og histopathologically bekreftet CC [44]. Fra bassenget på prøver samlet for vanlige diagnostikk ved Rudjer Boskovic Institute, Zagreb, 40 prøver med normal cytologi, 40 med LSIL /CIN1, 40 med HSIL /CIN2 og 42 prøver med HSIL /CIN3 diagnose ble tatt tilfeldig for metylering analyser. I tillegg ble 11 CC (8 plateepitelkarsinom og tre adenokarsinom) prøver tatt med cytobrush like før kirurgiske prosedyrer.
Etikk erklæringen
Verbal pasient /deltaker samtykke ble innhentet for hver livmorhalsprøve som ble samlet både for HPV diagnostiske og forskningsformål. Skrevet pasient /deltakersamtykke ikke var nødvendig fordi hver livmorhalsprøve er ledsaget av laboratoriet for forespørsel om service former, som må være signert og godkjent av den praktiserende lege som er ansvarlig for den verbale pasient /deltakersamtykke (innspilt av legen på laboratoriet serviceforespørsel former). Det er imidlertid kun eksempler på pasienter /deltakere som verbalt avtalt ble inkludert i denne studien. De relevante pasientdata (alder, cytologisk diagnose, HPV gjenkjenning og skrive resultat) og hentet DNA ble ytterligere kodet og behandles anonymt i laboratoriet. Studien ble oppnådd i forskningsprosjektet «Aberrant DNA metylering i HPV-assosiert lesjoner» (Grant 098-0982464-2510 støttes av ved den kroatiske departementet for vitenskap, utdanning og idrett), som ble godkjent samt prøvetaking prosedyren ved Etisk styre Rudjer Boskovic Institute, og etisk Board of Sisters of Mercy Hospital, og Clinical Hospital Center Zagreb som er i tråd med Helsinkideklarasjonen deklarasjonen~~POS=HEADCOMP (DOH /Oct2008).
DNA forberedelse
DNA fra livmorhalsprøver ble isolert på BioRobot EZ1 (Qiagen, USA) i henhold til produsentens anvisninger. Etter DNA-ekstraksjon, ble det rensede DNA ble oppløst i 50-100 pl tri-destillat sterilt vann og oppbevares ved -20 ° C inntil videre analyse. Hver DNA ble analysert spektrofotometrisk og visuelt på 1% agarosegel-elektroforese, og visualisert ved UV-bestråling på Alliance 4,7 (UVItec Cambridge, UK) [45].
HPV påvisning og genotyping
Detection og genotyping av HPV ble tidligere beskrevet av Milutin-Gasperov
et al
. [46] I korthet, tre sett med konsensus primere (PGMY09 /PGMY11, L1C1 /L1C2-1 /L1C2-2 og GP5 + /GP6 +) ble brukt for HPV deteksjon, og typespesifikke primere for HPV genotyping typer 6/11, 16 , 18, 31, 33, 45, 52 og 58. PCR produktene ble analysert ved elektroforese på 2% agarosegel farget med etidiumbromid.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Isolerte DNA fra HPV16 positiv CC celle linjer, CaSki (ATTC CRL-1550) og Siha (ATCC HTB-35), og HPV18 positiv, HeLa (ATTC CCL-2), ble brukt som positive kontroller av avvikende metylering profiler av cellulære gener og de respektive HPV genomer. CaSki-celler inneholder en integrert HPV16-genomet (omtrent 600 kopier per celle) så vel som sekvenser relatert til HPV18. Siha cellene inneholder et integrert HPV16 genomet (1 til 2 kopier per celle), mens HeLa celler inneholder HPV18 sekvenser.
Bisulfite DNA konvertering
DNA av livmorhalsprøver ble modifisert med natriumbisulfitt hjelp EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, USA) og deretter renset i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt blir alle unmethylated cytosines omdannes til uracil av sulfitt behandling, mens denaturert cytosines forblir uendret.
Host cellen genet arrangører «metylering besluttsomhet
metylering profiler av
CCNA1 product: ( kromosom 13: 36432177-3643232),
CDH1 plakater (kromosom 16: 68737114-6873722),
C13ORF18 plakater (kromosom 13: 46387345-4638746),
DAPK1 plakater (kromosom 9 : 87497883-87497981),
HIC1
kromosom 7: 19117831-19118031,
RARβ2 plakater (kromosom 3: 25428191-2542842),
hTERT1 plakater (kromosom 5: 1295019-1295259 ),
hTERT2 plakater (kromosom 5: 1294824-1295014) og
TWIST1 plakater (kromosom 7: 19117831-19118031) genet arrangører ble identifisert. Genpromotoren metylering status ble oppnådd ved metylering Spesifikk Polymerase Chain Reaction (MSP) med primere som er spesifikke for metylerte former av gen-promotorer. Den samme metoden ble brukt for påvisning av unmethylated former av det samme genet arrangører unntatt for
C13ORF18
promoter. Positivitet av prøver med unmethylated former genet arrangører fungerte som den interne kontroll, ettersom cervical utstryk inneholde blandinger av celler med ulike metylering status for verts genet arrangører [17]. MSP-metoden og vilkår for de utvalgte gener ble allerede beskrevet av Yang
et al
. [13,47], Feng
et al
. [23], Kitkumthorn
et al
. [18], og Dessain
et al
. [19], men betingelsene ble endret i de fleste tilfeller heri. I korte trekk ble 5 minutter denaturering ved 95 ° C etterfulgt av 45 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 56-61 ° C i 30 sekunder, forlengelse ved 72 ° C i 50s, og den endelige 7 min forlengelse ved 72 ° C. Glødetemperaturen variert med forskjellige primere: 56 ° C for
hTERT1 plakater (U, unmethylated primere) og
TWIST1
(M, denaturert primere), 58 ° C for
CCNA1
(M) og
CCNA1 product: (U), 59 ° C for
CDH1 product: (U),
C13ORF18 product: (M),
DAPK1 product: (
