Abstract
Aktivering av bypass signaler, for eksempel MET og AXL, er blitt identifisert som en mulig mekanisme for EGFR-TKI motstand. Fordi ulike teinene avhenge HSP90 for modning og stabilitet, undersøkte vi effekten av AUY922, en nyutviklet ikke-geldanamycin klasse HSP90 inhibitor, i lungekreftceller med metaller og AXL-mediert motstand. Vi etablerte resistente cellelinjer med HCC827 celler huse en ekson 19-sletting mutasjon i for
EGFR
genet via langvarig eksponering for økende konsentrasjoner av gefitinib og erlotinib (HCC827 /GR og HCC827 /ER, henholdsvis). HCC827 /GR motstand ble mediert av MET aktivering, mens AXL aktivering forårsaket motstand i HCC827 /ER celler. AUY922 behandling effektivt undertrykkes proliferasjon og indusert celledød i begge resistente cellelinjer. Følgelig nedregulering av EGFR, MET, og AXL førte til redusert Akt aktivering. De inhiberende virkninger av AUY922 på hver reseptoren ble bekreftet i gen-transfekterte celler LK2. AUY922 også effektivt kontrollert tumorvekst i xenograft musemodeller som inneholder HCC827 /GR og HCC827 /ER celler. I tillegg AUY922 redusert invasjon og migrering av begge typer av resistente celler. Våre funnene viser altså at AUY922 er en lovende behandlingsalternativ for metaller og AXL-mediert resistens mot EGFR-TKI i lungekreft
Citation. Choi YJ, Kim SY, så KS, Baek IJ, Kim WS , Choi SH, et al. (2015) AUY922 overvinner effektivt metaller og AXL-mediert Motstand mot EGFR-TKI i lungekreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0119832. doi: 10,1371 /journal.pone.0119832
Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 26 august 2014; Godkjent: 16 januar 2015; Publisert: 17 mars 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: J.K. Rho hadde blitt tildelt et stipend på National Research Foundation of Korea (NRF, 2013R1A1A2005112) og S. H. Choi hadde blitt tildelt et stipend av Asan Institute for miljø- og biovitenskap (2014-597). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor-tyrosinkinase inhibitor (EGFR-TKI) er en av de mest vellykkede målretting midler som brukes til å behandle kreft. Imidlertid er utviklingen av resistens, til tross for gode start responser, hos pasienter med EGFR-mutant lungekreft uunngåelig [1,2]. Selv om nesten halvparten av alle TKI motstand skyldes en sekundær T790M mutasjon [3,4], kan aktivering av bypass signaler som MET eller AXL også bidra til oppkjøpet av motstanden [5,6].
MET genamplifisering fører HCC827 celler som sensibiliserende EGFR mutasjon å bli resistente mot gefitinib via ErbB3 avhengig aktivering av phosphoinositide 3-kinase /Akt (PI3K) veien [5]. Innledende studier har rapportert at ca 20% av pasienter med ervervet resistens mot EGFR-TKI viste
MET
genamplifisering med eller uten T790M [5,7], mens en fersk undersøkelse på hyppigheten av resistensmekanismer avdekket at
MET
forsterkning utviklet i omtrent 5% av pasientene etter motstand [8]. Kombinasjonsbehandling med MET og EGFR-hemmere kan oppheve aktivering av nedstrøms signaler, og dermed overvinne ervervet resistens mot EGFR-hemmere [5,9]. Flere MET tyrosinkinasehemmere og MET-blokkerende monoklonale antistoffer, inkludert SU11274, ARQ197 og onartuzumab, er i kliniske studier [10].
Nylig, tre uavhengige studiegrupper rapportert at AXL, som er inkludert i TAM ( Tyro-Axl-Mer) reseptortyrosinkinasehemming (RTK) familie, kan være en årsak til EGFR-TKI motstand i prekliniske modeller [6]. Selv om ca 20% av pasientene viste AXL over-uttrykk etter å ha utviklet resistens i den studien, den eksakte andelen blant pasienter med ervervet resistens og behandlinger som kan brukes til å overvinne virkningene av målretting AXL i kliniske settinger gjenstår å bli bestemt [11] .
Heat shock protein 90 (HSP90) spiller en avgjørende rolle i å opprettholde cellulære protein homeostase ved å påvirke protein modning og stabilitet [12]. Fordi ulike teinene avhenge av sin rette funksjon, har HSP90 blitt anerkjent som en attraktiv terapeutisk mål [13]. Kliniske studier rettet mot mutant EGFR, inkludert T790M mutant med HSP90-hemmere, er i gang. Noen prekliniske studier har rapportert lovende resultater [14-16]. Det er imidlertid ikke tilstrekkelige data om hvordan Met- eller AXL-mediert resistens mot EGFR-TKI i lungekreft kan overvinnes ved å hemme HSP90. I vår nåværende studie, vi undersøke effekten av AUY922, et ikke-geldanamycin klasse HSP90 inhibitor av metaller og AXL-mediert resistente cellelinjer og dyremodeller.
Materialer og metoder
Cellekultur og reagenser
HCC827 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Gefitinib- og erlotinib-resistente cellelinjer (HCC827 /GR og HCC827 /ER, henholdsvis) ble etablert som en del av en tidligere studie [17]. Celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. AUY922 ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, TX).
Celleviabilitet analyser
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av MTT analysen. Kort sagt ble cellene i logaritmisk vekstfase høstet, sådd ut på 96-brønners plater, og dyrket over natten. Celler ble utsatt for forskjellige doser av AUY922 i medium inneholdende 1% FBS. Etter 72 timer ble MTT-analyse utført som beskrevet av Carmichael et al. [18]. Å validere kreft effekter av AUY922, ble cellene behandlet med de angitte doser av AUY922 i 72 timer, og de festede celler ble farget med 0,2% trypanblått-oppløsning inneholdende 50% metanol. Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av en ADAM-MC automatisk celleteller (NanoEnTek, Seoul, Korea) i accordiance med produsentens instruksjoner. Resultatene er representative for minst tre uavhengige forsøk, og feil linjene viser standardavviket (SD).
Western blot analyse
For western blotting, proteiner ble separert på SDS-polyakrylamidgeler og elektrooverført til Immobilon-P-membran (Millipore, Bedford, MA). Antistoffer spesifikke for p-EGFR (Tyr1173), EGFR, AXL, MET, Akt, p-Erk, Erk, Myc, og β-aktin ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California), og antistoffer for p-MET ( Tyr1234 /1235), p-AXL (Tyr702), p-Akt, PARP og caspase-3were hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Proteiner ble påvist ved hjelp av en forbedret chemiluminescence western blotting kit (Amersham Biosciences, NJ) i henhold til produsentens anvisninger.
Transient transfeksjon
pcDNA3 /EGFR (WT) og pcDNA3 /EGFR (delE746- A750) ble gitt av Dr. TY Kim (College of Medicine Seoul National University, Seoul, Sør-Korea). pCMV6-Entry /MET ble kjøpt fra OriGene (Rockville, MD). pcDNA3.1 /AXL (WT) ble konstruert som del av en tidligere studie [6]. Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger.
Cell syklus analyse
Celler ble sådd på 6-brønners plater og behandlet for de angitte ganger med en mikromol /L AUY922. Både adherente og flytende celler ble innsamlet for analyse. Celler ble fiksert i 70% iskald etanol i 1 time og inkubert i 50 pg /ml RNase A og 25 ug /ml propidiumjodid (PI) i 30 minutter ved 37 ° C. Kvantitativ analyse av cellesyklus distribusjon ble utført ved hjelp FASCalibur flowcytometri (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
In vivo
studie
Kvinne alvorlig kombinert immunsvikt (SCID ) mus (18-20 g, 5 uker gamle, 5 mus /gruppe) ble kjøpt fra Charles River Laboratories. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført etter en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Asan Institute for miljø- og biovitenskap (2013-01-066). Svulster ble dyrket ved implantering av celler (1 x 10
6 HCC827 /GR celler eller 5 × 10
6 HCC827 /ER celler) i Matrigel (BD Biosciences) og deretter inn i muse flankene. Behandling med den bæremiddelkontroll startet når tumorene nådde et volum på 50-100 mm
3 (20 mg /kg AUY922 via intra-peritoneal injeksjon, 5 dager /uke). Behandlingen ble stoppet på den angitte dagen, og musene fikk en oppfølgingsundersøkelse for å dokumentere tumorresidiv. For å måle tumorstørrelse, lengde (
L
) og bredde (
W
) av hver tumor ble målt ved hjelp calipers, og tumor volum (TV) ble beregnet som TV = (
L
×
W
2) /2. Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av en bestemt primær antistoff (Ki-67, DakoCytomation, Los Angeles, CA), Envision Plus farging kit (DakoCytomation), og APO-Direct terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) assay kit (Millipore) som ledes av leverandørens anvisninger. Kvantitativ analyse av hver farget seksjon ble utført ved å telle alle immunopositive celler i 5 vilkårlig utvalgte felt (× 400 forstørrelse).
Invasion og migrasjonsanalyser
Alle celle migrasjon og invasjon analyser ble utført i henhold til et tidligere beskrevne metode [19]. Resultatene er representative for minst tre uavhengige forsøk, og feil linjene viser SDS.
Resultater
AUY922 hemmer effektivt spredning av gefitinib /erlotinib-resistente celler
Gefitinib /erlotinib-resistente underlinjer avledet fra foreldre, følsom HCC827 cellelinje ble etablert som en del av en tidligere studie [17]. Celler ble behandlet med AUY922 på en doseavhengig måte for å fastslå om den hemmer cellevekst i gefitinib /erlotinib-resistente celler. Som vist på fig. 1, både resistente cellelinjer viste kryssresistens overfor gefitinib eller erlotinib, henholdsvis, og var også motstandsdyktig mot afatinib. Likevel AUY922 behandling effektivt undertrykt spredning av foreldrelinjen og begge resistente cellelinjer (Fig. 1D). Den veksthemmende effekter av AUY922 ble observert selv når legemiddelkonsentrasjonen var lav (Fig. 2A).
Celler ble behandlet med de angitte doser av gefitinib, erlotinib, afatinib, eller AUY922 i 72 timer i medium som inneholdt 1% FBS. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen.
A, Celler ble behandlet med de angitte doser av AUY922 i 72 timer i medium inneholdende 1% FBS. Festede celler ble farget med trypanblått-oppløsning (øverst). Celleviabilitet basert på celletelling er også vist (nederst). Barer representerer gjennomsnitt ± SD av tre brønner. B, Celler behandlet med AUY922, tilsvarende panel A. Etter 48 timer ble cellene høstet og EGFR-relatert signalmolekyler ble evaluert ved hjelp av western-blotting. C, LK2 celler ble behandlet med vektor som inneholder vill-type EGFR, del E746-E750, MET, eller AXL og de angitte doser AUY922 12 timer.
Vi har tidligere vist at motstanden av HCC827 /GR og HCC827 /eR celler er mediert av MET eller AXL aktivisering, henholdsvis [6,17]. Tidligere rapporter har også indikert at et stort antall klient HSP90-proteiner har viktige roller i progresjon av kreft, og at inhiberingen av HSP90 degraderer proteiner klient [13,20,21]. Derfor undersøkte vi om AUY922 påvirker stabiliteten i MET eller AXL. Inhiberingen av HSP90 ved AUY922 ble funnet å føre til signifikant nedbrytning av EGFR, MET, og AXL i et dose (Fig. 2B) og tidsavhengig måte (S1 fig.). I samsvar med dette, AUY922 behandling også redusert nivå av kunstig induserte proteiner i LK2 celler som ble transfektert med gener som
EGFR plakater (WT),
EGFR plakater (Del E746-E750),
MET
, og
AXL plakater (fig. 2C).
Mange HSP90 hemmere indusere cellesyklus og apoptose i ulike kreftceller [22-26]. For ytterligere å bekrefte effekten av AUY922, undersøkte vi cellesykluskinaser endringer i PI-farget celler ved hjelp FACS analyse. Som vist på fig. 3A, AUY922 behandling øket antall celler i G2 /M fase og induserte sub-G1 (dvs. celledød) etter 48 timer. I samsvar med disse resultatene, ble tidsavhengig PARP og caspase-3 cleavage også observert (Fig. 3C). Disse data indikerte at antitumor-virkningene av AUY922 for paren og resistente celler kan resultere i induksjonen av cellesyklus-stans og celledød.
A og B, Celler ble behandlet med 0,1 umol /l AUY922 for 24-72 timer. For å analysere cellesyklusfordeling, ble de høstede celler analysert ved flow-cytometri. C, Cellelysater ble analysert ved hjelp av western-blotting. De angitte antistoffer ble brukt for å evaluere apoptotisk celledød.
AUY922 seirer ervervet resistens mot gefitinib /erlotinib i xenograft modeller
HCC827GRand HCC827 /ER tumorxenotransplantater ble etablert i SCID-mus til videre evaluere antitumor effekt av AUY922. Den tumor vekst på HCC827 /ER-celler var lavere enn for HCC827 /GR-celler. AUY922 behandling resulterte i en betydelig inhibering av vekst i begge celler (Fig. 4A). Undertrykt tumorvekst ble opprettholdt i HCC827 /ER xenografter gjennom 2 uker etter seponering av legemidlet, mens svulster i HCC827 /GR xenograft sakte vokste igjen etter seponering. Immunhistokjemiske analyser av tumorvev viste at celleproliferasjon hadde gått ned og apoptose ble indusert i begge svulster ved AUY922 behandling (Fig. 4B-C).
A, SCID-mus med etablert HCC827 /GR og HCC827 /ER tumorcelle xenotransplantater ble behandlet med AUY922. Tumorstørrelsen ble målt på de angitte dagene, og tumorvolumet ble beregnet. Piler bety siste dagen av medikamentell behandling (rød pil, HCC827 /GR, lilla pil, HCC827 /ER). Linjene representerer gjennomsnittlig tumorvolum ± SD. B og C, immunohistokjemisk farging for Ki-67 og TUNEL etterfulgt av kvantitativ analyse av proliferasjon og apoptose i (B) Ki-67
+ celler og (C) TUNEL
+ -celler.
* p
0,01 og
** p
0.001 sammenlignet med kontrollgruppen.
AUY922 reduserer mobil mobilitet
Induksjon av AXL eller MET er assosiert med økt cellulær mobilitet i kreft [6,10,27-29]. Vi undersøkte derfor endringer i cellemobilitet i både foreldrenes og gefitinib /erlotinib-resistente celler. Som forventet, trekk og invasive evner i begge resistente celletyper økt dramatisk sammenlignet med foreldre celler (fig. 5). AUY922 behandling resulterte i reduserte trekkende og invasive evner i både resistente og foreldre celler.
Celler ble sådd ut på enten kollagen eller Matrigel-belagt polykarbonat filtrene til å bestemme sine trekkende og invasive potensialer, henholdsvis. Celler ble inkubert i modifisert Boyden kammere med eller uten de angitte doser av AUY922 i 24 timer, og cellene som gjennomtrenges av filteret var farget og tellet ved hjelp av et lysmikroskop. Barer representerer gjennomsnitt ± SD av tre brønner.
* p
0,01 og
** p
0.001 sammenlignet med HCC827 celler.
Diskusjoner
Siden mutant EGFR varianter, inkludert T790M, ble først vist å være assosiert med HSP90 anstand proteiner [16], flere tilsvarende linjer av bevis har akkumulert. T790M-uttrykkende celler som er resistente selv til irreversible EGFR-TKI er følsomme for HSP90-inhibering. HSP90 inhibering fører til regresjon av EGFR
L858R
-driven murine lunge adenokarsinom, uavhengig av tilstedeværelsen av T790M [15]. Bao et al. Det er også rapportert at målretting HSP90 med CUDC-305, en HSP90 inhibitor, kan overvinne erlotinib-motstand i ikke-småcellet lungekreft [30]. Videre er 17-DMAG reduserer veksten av lungekreftceller med mutert EGFR, uavhengig av tilstedeværelsen av en mutasjon i T790M mus xenograft-modeller [14]. Foreløpig over et dusin HSP90-hemmere er registrert i kliniske studier, hvorav noen undersøker T790M-mediert resistens mot EGFR-TKI [20].
Flere tidligere studier har vist at MET er en HSP90 klient protein og er lagt degradering på HSP90 hemming. Snx-2112, en ny lite molekyl inhibitor av HSP90, reduserer EGF krysstale og aktivering av c-Met-reseptoren via c-Met nedbrytning i lungekreftceller [31]. Ueno et al. har vist at AUY922 er effektive mot de fleste NSCLC-cellelinjer, uavhengig av kjente molekylære forandringer. AUY922 behandling ble funnet å indusere vesentlig uttømming av klient proteiner, slik som EGFR, MET, og Akt, for derved å øke apoptose [32]. Selv om disse studiene har vist evnen til HSP90 hemmere til ned-regulere MET, gjorde de ikke vurdere MET-mediert resistens mot EGFR-TKI i lungekreft. Følgelig Koizumi et al. først demonstrerte effekt av HSP90-inhibitorer for å overvinne motstanden som skyldes MET signalering [33]. I den studien, HGF-genet transfektert MA-1 celler med EGFR
L858R plakater (Ma-1 /HGF) ikke svare på erlotinib, mens 17-DMAG hemmet celledeling og apoptose ved å redusere uttrykket av EGFR og MET, selv under HGF stimuli. Andre klinisk relevante modeller ble studert av Xu et al. [34]. Disse forfatterne generert transgene musemodeller uttrykker mutant Del19-T790M eller L858R-T790M EGFR (hver med samtidige MET over-uttrykk). Kombinasjon EGFR og MET hemming med WZ4002 (tredje generasjon EGFR-TKI) og crizotinib demonstrert svært effektiv kontroll i disse kreft modeller, men ingen av disse stoffene alene kan indusere en undertrykkende respons. Disse forfatterne videre funnet at effekten av 17-DMAG er sammenlignbare med crizotinib når den kombineres med WZ4002, således antyder at MET inhibering er mulig via HSP90. Videre ble en lignende effekt ble observert i en annen musemodell som bærer gefitinib bestandig MET-forsterkede xenografter HCC827. Disse resultatene er nesten enige med våre nåværende funn i et HCC827 /GR modell. Men vår nåværende resultatene bedre representerer en klinisk setting fordi våre HCC827 /GR celler ble etablert ved kontinuerlig langsiktig legemiddeleksponering.
I forhold til MET, er det få data om hvordan AXL avhenger HSP90 for stabilitet. Nylig, Krishnamoorthy et al. rapporterte at 17-AAG induserer nedregulering av endogen eller ectopically uttrykt AXL protein i skjoldbruskcancercellelinjer og i HeLa-celler i en tids- og doseavhengig måte, som fører til hemming av AXL-mediert signalisering og biologisk aktivitet [35 ]. Så vidt vi vet, er vår nåværende studien den første til å vise at HSP90 hemming av AUY922 kan overvinne AXL-mediert resistens hos lungekreftcellelinjer og dyremodeller. Tatt sammen indikerer derfor bevis på at fordi HSP90-inhibering kan overvinne den ervervet resistens mot EGFR-TKI forårsaket av de tre store resistensmekanismer (T790M, MET, og AXL), kan HSP90-inhibering være et lovende alternativ for behandling av EGFR-TKI motstand.
i foreliggende undersøkelser, har vi vist at AUY922 helt redusert tumorvekst i begge celler. Men begge resistente celler viste forskjellig mønster i vekst, og etterveksten etter seponering. HCC827 /GR celler vokse raskere enn HCC827 /ER celler under forutsetning av stoff-fri, og de viste gjenvekst etter seponering. Veksttakten av HCC827 /ER celler var tregere enn HCC827 /GR celler
in vitro plakater (S2 fig.). Selv om forskjellige faktorer kan påvirke tumorvekst i xenograft-modeller, kan forskjellene i veksthastighet påvirke tumorvekst. Egentlig HCC827 /ER-celler hadde lavere EGFR samt Akt-aktivitet enn HCC827 /GR celler i basalnivået (data ikke vist). Det var ingen forskjell i apoptose, nekrose, cellesyklus arrest (G2 /M arrest, S3 fig.) Og spredning mellom disse to svulster. Således er forskjellig respons til medikamenttilbaketrekning forble uklart.
Metastase er avhengig av flere prosesser, slik som løsgjøring av tumorceller fra den primære tumor, migrasjon, invasjon av de omkringliggende stroma og blodkar, og overlevelse og proliferasjon på fjerne områder. Hepatocytter vekstfaktor (HGF) er den eneste kjente ligand av MET, og det er anerkjent som en fibroblast-avledet faktor som fremmer epitelcelledifferensiering løsrivelse og stimulerer invasjonen [36,37]. MET påvirker celle migrasjon, vekst i embryogenese, og styrer vekst og metastasering i kreftceller [38]. Følgelig, Wu et al. har vist at LY2801653 (en MET-hemmer) hemmer både primær tumorvekst og metastaser til lymfeknuter og brystveggen i H441 ortotopiske modeller [39] betraktelig. AXL er også forbundet med tumorcelleinvasjon og metastase og fremmer tumorvekst i forskjellige typer kreft. Tvunget ektopisk AXL uttrykk induserer de svært invasive egenskaper sett i MCF7 brystkreftceller fra innledende svakt invasive fenotyper, mens ved hjelp shRNA behandling for å indusere AXL knockdown reduserer invasive og trekk mulighetene i svært invasive kreftceller [29]. I tillegg er AXL nødvendig for MDA-MB-231 brystcancerceller for å metastasere til lungene hos ortotopiske modeller [27]. I vår nåværende analyser, AUY922 redusert betydelig de invasive og trekk egenskapene til både tumorceller med MET eller AXL aktivering. Videre undersøkelser av rollen HSP90-hemmere i kreft metastasering er nødvendig.
I sammendraget, utøver AUY922 effektiv kontroll over ondartede fenotyper som er drevet av MET og AXL, inkludert legemiddelresistens, i lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Celler ble behandlet med 0,1 umol /l AUY922 på en tidsavhengig måte.
Forsøk ble utført som beskrevet i fig. 2A og B.
doi: 10,1371 /journal.pone.0119832.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Celler (5 x 10
3) ble utsådd i 24-brønners plater med ferdige media inneholdende 10% FBS
celleantall ble bestemt med en ADAM-MC automatisk celleteller
doi:.. 10,1371 /journal. pone.0119832.s002 product: (TIF)
S3 fig. Tumorvev fra hver gruppe ble homogenisert for fremstilling lysat og analysert ved hjelp av Western blot til evaluert G2 /M rest.
Cyklin B1, p21 og cdc2-antistoffer ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og p-cdc2 ( Tyr15) ble hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0119832.s003 plakater (TIF)
