Abstract
Bakgrunn
diosgenin, en steroid saponin hentet fra bukkehornkløver (
trigonella foenum graecum
), ble funnet å utøve anti-kreftfremkallende egenskaper, for eksempel å hemme spredning og indusering av apoptose i en rekke tumorceller. Men effekten av diosgenin på kreft metastasering er fortsatt uklart. Målet med studien er å undersøke effekten av diosgenin om migrasjon og invasjon i menneskelig prostata kreft PC-3 celler.
Metoder og hovedfunnene
diosgenin hemmet spredning av PC-3 celler i en doseavhengig måte. Ved behandling med ikke-toksiske doser av diosgenin, ble cellemigrering og invasjon markert undertrykket ved in vitro assay og sårheling Boyden kammer invasjon analysen, respektivt. Videre diosgenin redusert aktiviteter av matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2) og MMP-9 med gelatin zymografi assay. MRNA-nivå av MMP-2, -9, -7 og ekstracellulær induser av matrix-metalloproteinase (EMMPRIN) ble også redusert så lenge vevsinhibitor av metalloproteinase-2 (TIMP-2) ble økt med diosgenin. I tillegg avskaffet diosgenin ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i PC-3-celler og rør dannelse av endotelceller. Våre immunoblotting analyser indikerte at diosgenin potente undertrykt fosforylering av phosphatidylinositide-3 kinase (PI3K), Akt, ekstracellulære signalregulerende kinase (ERK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK). I tillegg diosgenin betydelig redusert atomnivå kjernefysiske faktor kappa B (NF-
κ
B), noe som tyder på at diosgenin hemmet NF-kB aktivitet.
Konklusjon /Betydning
resultatene antydet at diosgenin hemmet migrasjon og invasjon av PC-3 celler ved å redusere MMP uttrykk. Det er også hemmet ERK, JNK og PI3K /Akt signalveier samt NF-
κ
B aktivitet. Disse funnene viser ny terapeutisk potensial for diosgenin i anti-metastatisk behandling
Citation. Chen PS, Shih YW, Huang HC, Cheng HW (2011) diosgenin, en steroid saponin, hemmer migrasjon og invasjon av menneskelige prostatakreft PC-3 celler ved å redusere matriksmetalloproteinaser Expression. PLoS ONE 6 (5): e20164. doi: 10,1371 /journal.pone.0020164
Editor: Robert E. Midler Yale Medical School, USA
mottatt: 1 februar 2011; Godkjent: 14 april 2011; Publisert: 23. mai 2011
Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
diosgenin er et naturlig forekommende steroid saponin til stede i en. utvalg av planter inkludert bukkehornkløver (
trigonella foenum graecum
) og røtter av wild yam (
Dioscorea villosa
) [1]. Diosgenin har vært brukt i tradisjonell medisin som en antihypercholesterolemia, antihypertriacylglycerolemia, antidiabetes og antihyperglycemia middel [1], [2], [3], [4]. Flere rapporter har vist at diosgenin hemmer proliferasjonen og induserer apoptose i et bredt spekter av tumorceller av human tykktarm [5], osteosarkom [6], leukemi [7], erytroleukemi [8], bryst [9], og leveren [10] . Den anti-kreft effekt av diosgenin er blitt demonstrert gjennom cellesyklus-stans [7], [11], aktivering av p53 og caspase-3 [5], [7], [8], [12]. I tillegg hemmer diosgenin NF-kB aktivitet og NF-kB-regulert genekspresjon og deretter redusere proliferasjon, invasjon og osteoclastogenesis [6], [13]. Diosgenin avskaffer også cyklooksygenase-2 [11] og lipoksygenase [14], som er innblandet i karsinogenese og som viktige mål for kreft chemoprevention og terapi. Derfor kan diosgenin ha kreft kjemoterapeutiske potensial og sin aktivitet involverer flere cellulære og molekylære mål.
Prostatakreft er en av de mest diagnostisert svulster hos menn og den nest største årsaken til kreftdødelighet i USA [ ,,,0],15]. Selv om prostata kreft på et tidlig stadium kan behandles med kirurgi og androgen-deprivasjonsterapi, det til slutt videre til mer ondartet, metastase, og hormon ildfast prostatakreft (hrpc), for hvilken det ikke finnes noen helbredende terapi [16], [17] . Således, er utvikling av nye terapier for behandling av prostata cancer nødvendig. Fordi avansert prostatakreft celle med svært invasiv potensial resultat i høy sykelighet og dødelighet, kan hemming av invasjon og metastase være en god tilnærming for behandling av prostatakreft.
Kreft metastasering er en svært koordinert trinnvis prosess som omfatter avløsning av celler fra primærtumor, lokal proteolyse av den ekstracellulære matriks (ECM), penetrasjon gjennom basalmembran av kapillært og lymfekar, intravasation, og deretter invasjon inn i nytt vev og vekst [18], [19]. Prosessen med metastase fremmes ved å uttrykke og utskille forskjellige proteolytiske enzymer som kan redusere de fleste ECM-komponenter. Matriks-metalloproteinaser (MMP), en familie av Zn-avhengige endopeptidaser, er de viktigste proteaser som deltar i tumorcellemigrering, spredning, vev invasjon og metastase [20]. Blant de MMP’er, MMP-2 og MMP-9 er viktige enzymer for degraderende type IV kollagen og bidrar til prosessen med metastase [21], [22]. MMP-2 og MMP-9 er også i stand til å spalte type I kollagen [23], [24], den største komponenten danner en gitterstruktur i stroma [25]. Aktiveringen av disse enzymer har blitt assosiert med økende tumormetastase, noe som tyder på en sentral funksjonell rolle for disse proteaser i metastatisk prosessen [26]. Proteolytisk nedbrytning av stromal mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i å fremme invasjon. For å skaffe informasjon om kreftcelle invasjon på stroma, er type I kollagen anvendes i Boyden kammer invasjon analysen i den foreliggende undersøkelse.
I tillegg kan proteolytisk nedbrytning av ECM i tumormetastase reguleres av andre proteiner slike som ekstracellulære induserer matriksmetalloproteinase (EMMPRIN) og vev hemmer av metalloproteinaser (TIMPs). EMMPRIN er en multifunksjonell glykoprotein som kan endre svulsten mikromiljøet ved å aktivere proteinaser, indusere angiogene faktorer i tumor og stromale celler. EMMPRIN er i stand til å regulere MMP og være involvert i invasjonen og metastaseprosesser prostata kreft celler [27]. Virksomheten til de fleste MMP er regulert av TIMPs. Balansen mellom MMP og TIMP nivåer er en viktig determinant av nettet proteolytisk aktivitet [28].
mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) veien har vært kjent for å delta i en rekke signaleringskaskader som spiller viktige roller i regulerings cellevekst, apoptose, differensiering og metastase [29]. De ulike medlemmene MAPK blir aktivert som respons på forskjellige ekstracellulære stimuli og har forskjellige nedstrøms mål, og dermed stimulere cellemigrering, proteinase-induksjon, og angiogenese, hendelser som er essensielle for metastasering [30]. Ekstracellulær signal som regulerer kinase (ERK1 /2) og c-Jun N-terminal kinase (JNK), to store pattedyr-MAP-kinaser har vært implisert i cellemigrering og proteinase-induksjon, hendelser som er essensielle for metastasering [30]. ERK1 /2 og JNK spille en sentral rolle i regulering av uttrykk av MMP [20]. Inhibering av MAPK-reaksjonsveien kan ha potensial til å forhindre angiogenese, spredning, invasjon og metastasering for et bredt spekter av tumorer [31], [32], [33]. Metastasering er også regulert av PI3K /Akt signalveien, som er involvert i mange cellulære prosesser inkludert celle overlevelse, celle adhesjon og metastasering [34], [35]. Inhibering av MAPK og PI3K /Akt veier kan ha potensial til å forebygge kreft-celleformering, invasjon og metastase [31], [33]. I tillegg PI3K /Akt og MAPK signalveier spille en sentral rolle i regulering av ekspresjonen av MMP’er av transkripsjonsfaktorer, inkludert NF-kB [34], [36], [37]. NF-kB er holdt i en inaktiv form i cytoplasma av hemmende proteiner som kalles hemmere av KB (IKB). Som respons på et aktiveringssignal, NF-kB frigjøres fra IκBα og translocates fra cytoplasma til kjernen, hvor det binder til beslektede sekvenser i promoterregionen av et antall målgener og deretter forenkler celleproliferasjon, angiogenese og metastase. Således blokkerer PI3K /Akt og MAPK banene så vel som NF-kB gi potensielle mål for tumor-terapeutiske strategier.
Selv om diosgenin er implisert som en ny multitarget basert Kjemopreventivt middel mot en rekke kreftceller, rollen av diosgenin mot tumor metastase og angiogenese er fortsatt uklart. Målet med dette arbeidet er å undersøke den hemmende effekter og molekylære mekanismer av diosgenin på metastasering. Siden humane prostata cancer PC-3-celle utstillinger sterkt invasive og metastatisk aktivitet og har vært brukt for å undersøke de biokjemiske forandringer i avanserte prostata- kreft celler og for å vurdere deres respons på kjemoterapeutiske midler [38], ble PC-3-celle som brukes for de foreliggende eksperimenter .
Materialer og metoder
Reagenser og cellekultur
diosgenin, dimetylsulfoksid (DMSO), Tris-HCl, EDTA, SDS, fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), Nonidet P -40, deoksykolsyre og natriumortovanadat, ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Proteinanalysesett ble oppnådd fra Bio-Rad Labs (Hercules, CA). Pulverisert Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) ble kjøpt fra Gibco /BRL (Gaithersburg, MD). Total RNA ekstraksjon og PCR kit kit var fra Viogene (Sunnyvale, CA). Antistoffer mot ERK, JNK, Akt, NF-kB (p65), C23 og fosforylerte proteiner ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer mot PI3K og fosforylert PI3K ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Menneskelige prostata kreft cellelinjer PC-3 og ble hentet fra BCRC (Food Industry Research and Development Institute, Taiwan). Celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt kalveserum, 100 E /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin, og inkubert i en 5% CO
2-fuktet inkubator ved 37 ° C. Human navlevene endotelceller (HUVEC), vennligst tilveiebrakt av Dr. Hua-Lin Wu [39], ble isolert fra humane navlestreng årer som tidligere beskrevet [39], og dyrket i 0,1% gelatin-belagte retter og holdes i M199 medium supplert med 16% FBS, endotelial celleveksttilskudd og heparinsulfat (Upstate Biotechnology). HUVECs mellom passasjer 2 og 6 ble anvendt i alle forsøk. For diosgenin behandling, ble diosgenin oppløst i etanol og fortynnet med dyrkningsmedium (sluttkonsentrasjonen av etanol var mindre enn 0,2%).
celleviabilitet Assay
Assayet ble utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],40]. I korthet ble cellene sådd ut i en 96-brønners plate og behandlet med diosgenin i tre eksemplarer. Etter 24 og 48 timers inkubering ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende 0,5 mg /ml MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid]. Etter 4 timer ble supernatantene fjernet og den resulterende MTT formazan ble oppløst i DMSO og måles spektrofotometrisk ved 570 nm.
Wound Healing Migration Assay
Assayet ble utført som beskrevet tidligere [41] . PC-3-celler ble sådd i en 12-brønns plate og vokste til konfluens. Den enlagskultur ble deretter skrape-såret med en steril mikropipette spissen for å skape en ribbet sone (gap) med konstant bredde. Etter fjerning av cellerester med PBS, ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av diosgenin etter 24 timer. PC-3 celler migrert til de sårede regionen ble observert av Olympus CK-2 invertert mikroskop og fotografert (100 × forstørrelse). Sårområdet ble målt ved hjelp av programmet bilde J (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Prosentandelen av sårheling ble beregnet ved den følgende ligning: lukking av sår% = [1- (sårareal ved T
t /sårareal ved T
0) x 100%, hvor T
t er tid etter såret og T
0 er tiden umiddelbart etter såret.
Boyden Chamber Invasion analysen
Boyden kammer invasjonen analysen ble gjennomført som tidligere [41]. I korthet, den polykarbonatfilter (8 um porestørrelse) ble forhåndsbelagt med type I-kollagen (10 pg /ml). Etter behandling med diosgenin i 24 timer,-celler (1 x 10
4 celler /brønn) ble tilsatt til det øvre kammer i serumfritt medium. Den komplette medium (inneholdende 10% FBS) ble påført på det nedre kammer som kjemotiltrekkende. Kammeret ble inkubert i 6 timer ved 37 ° C. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene i den øvre overflaten av membranen forsiktig fjernet med en bomullsdott, og celler som invaderte til den nedre overflate av membranen ble fiksert med metanol og farget med 5% Giemsa-løsning. Den invaderte celler på den nedre overflate av membranfilteret ble bedømt fra fem tilfeldige felt i henhold til mikroskopi (200 x forstørrelse).
Tube Dannelse Bestemmelse
Røret-analysen ble utført som beskrevet. I korthet ble 15-brønns μ-lysbilder (ibidi, Tyskland) belagt med 10 ul av Matrigel som ble tillatt å stivne ved 37 ° C. For å evaluere effekten av diosgenin, ble PC-3-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer og det kondisjonerte medium ble oppsamlet og underkastet rør formasjon analysen. HUVEC ble sådd på Matrigel og dyrket i kondisjonert medium fra PC-3-celle i 6 timer. De vedlagte nettverk av komplette rør ble talt opp og fotografert under en invertert mikroskop. De rørformede lengder av cellene ble målt ved hjelp av programmet Bilde J.
RNA Utvinning og revers transkripsjon PCR og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstraksjon ved hjelp av total RNA ekstraksjon kit i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (1 pg) fra hver prøve ble utsatt for revers transkripsjon med oligo (dT) primere ved PCR-sett i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. Det syntetiserte cDNA ble anvendt for PCR-amplifikasjon med de følgende primere [41]: MMP-9, 5′-gcacgacgtcttccagtacc-3 «(For), 5′-tcaactcactccgggaactc-3′ (Rev); MMP-2, 5»-ggactatgaccgggataagaaatatg-3 «(For), 5′-gggcaccttctgaatttcca-3′ (Rev); β-actin: 5»-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 «(For), 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3» (Rev). cDNA ble amplifisert for 35 sykluser, og hvert PCR-reaksjonsbetingelser var som følger: fremstillingstrinnet ved 94 ° C i 5 minutter, denaturerende trinn ved 94 ° C i 30 sek, glødetrinn ved 56 ° C i 30 sek, og polymerisasjonstrinn ved 72 ° C i 30 sek. PCR-produktene ble analysert ved agarosegelelektroforese. MRNA uttrykk for MMP-2, -9, -7, EMMPRIN og TIMP-1, -2 ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR, som er utført i StepOne system (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Kort, hver forsterkning blanding (50 pl) inneholder 10 ng cDNA og 25 ul SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 2 minutter, 40 sykluser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 45 sek. Primersekvensene for β-aktin, MMP-2, MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1, TIMP-2 og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ble utledet fra PrimerBank og er oppført i Tabell 1. PCR resultatene var utledet ved hjelp av komparative C
T-metoden.
Analyse av MMP-2 og MMP-9 aktiviteter ved Gelatin zymografi
aktivitetene MMP-2 og MMP-9 ble analysert ved zymografi gelatin som tidligere beskrevet [41]. Kort sagt ble subsammenflytende PC-3-celler inkubert med serumfritt medium med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer. Det kondisjonerte medium ble deretter høstet og konsentrert ved ultrafiltrering sentrifugering. Prøven (20 ug) ble blandet med ladningsbuffer og utsatt for 10% SDS-polyakrylamid-gel inneholdende 0,1% gelatin. Elektroforese ble utført ved 100 V i 3 timer ved 4 ° C. Gelene ble så vasket med vaskebuffer (2,5% Triton X-100 dd H
2o) ved romtemperatur for å fjerne SDS, etterfulgt av inkubering ved 37 ° C i reaksjonsbuffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM CaCl
2, 0,02% NaN
3). Etter 16 timer ble gelene farget med Comassie blue R-250 (0,125% Comassie blue R-250, 50% metanol, 10% eddiksyre) i 1 time og avfarget med avfarging-løsning (20% metanol, 10% eddiksyre, 70% DDH
2o) til de klare båndene ble visualisert.
Nuclear Protein Extraction
de kjerneproteiner ble fremstilt som tidligere beskrevet [41]. I korthet ble cellene vasket med iskald PBS, sentrifugert og resuspendert i hypotonisk buffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl
2, 10 mM KCl, 0,05% NP-40, 0,5 mM DTT og 0,5 mM PMSF). Kjernene ble sentrifugert i 10 minutter ved 3000 rpm ved 4 ° C. Pelleten ble deretter resuspendert i kjerneekstrakt-buffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl
2, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF og 25% glycerol), og inkubert i 30 minutter på is. Etter en annen sentrifugering ved 14.000 rpm i 10 minutter, ble supernatanten inneholdende kjernefysiske proteinet overført til en forhåndsavkjølt mikrosentrifugerør. Ekstraktene ble lagret ved -80 ° C.
Western Blot
Etter å ha blitt behandlet med diosgenin, PC-3-celler ble vasket to ganger med PBS og behandlet med ekstraksjonsbuffer (50 mM Tris-Cl , pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, og 0,5% deoksykolsyre). Celle ekstraksjoner ble oppsamlet og sentrifugert ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatantene ble samlet opp som cellelysater. Cellelysatene ble underkastet SDS-PAGE, og overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, Bedford, MA). Membranene ble blokkert med 5% (vekt /volum) fettfri melk i PBS inneholdende 0,1% Tween-20, og deretter blottet med primært antistoff. Deretter ble membranene inkubert med et passende sekundært antistoff (pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-mus eller anti-kanin-IgG). De immuno-detektert proteiner ble deretter avdekket ved forbedret kjemiluminescens.
Statistical Analysis
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistisk signifikans ble analysert ved en-veis ANOVA. Dersom ble observert betydningen ble Dunnett post-hoc test brukes til å bestemme forskjellen mellom behandlingsgruppene og ubehandlet gruppe, med verdier på
p
. 0,05 anses statistisk signifikant
Resultater
cytotoksisk effekt av diosgenin i PC-3 celler
Vi først belyst den cytotoksiske effekten av diosgenin på prostatakreftceller PC-3 (fig. 1). Vi demonstrerte at behandling av diosgenin ved konsentrasjoner under 20 um i 24 eller 48 timer, påvirket ikke levedyktigheten av PC-3-celle betydelig. Levedyktigheten til PC-tre celle ble betydelig redusert med diosgenin 30 mikrometer. Dataene indikerte at behandling med diosgenin i doser på ikke mer enn 20 uM i 24 og 48 timer førte ikke til cytotoksisitet av PC-3-celler.
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer og 48 timer . Cellelevedyktighet er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av fire uavhengige eksperimenter.
*** p
. 0.001 sammenlignet med ubehandlet kontroll
diosgenin hemmer migrasjon i PC-3 celler
Fordi en høyere konsentrasjon av diosgenin var giftig vi undersøker den hemmende effekten av diosgenin om migrasjon og invasjon av PC-3 celler ved hjelp av ikke-giftige doser. Etter inkubasjon med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer, diosgenin trykkes migrering av PC-3-celler til ribbet sone på en doseavhengig måte (fig. 2, A og B). Disse resultatene viste at diosgenin hemmet motiliteten av PC-3-celler i betydelig grad.
cellemonolag ble skrapet med en steril mikropipette spissen og cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer. (A) Celler migrert til de sårede regionen ble fotografert (100 × forstørrelse). (B) Den sårområdet av cellekulturer ble kvantifisert i fire felt i hver behandling og data ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Data er presentert som middelverdi ± S.D. som av tre uavhengige eksperimenter.
* p
0,05,
** p
. 0,01, sammenlignet med ubehandlet kontroll
diosgenin hemmer Invasion i PC-3 celler
for å belyse den hemmende effekten av diosgenin på invasjonen av PC-3 celler over hele ekstracellulære matrise, cellene som invaderte gjennom den type-i kollagen-belagt polykarbonat filter i Boyden kammeret ble analysert. Resultatene viste at diosgenin trykkes invasjon av PC-3-celler på tvers av type-I kollagen-belagt filter på en doseavhengig måte. Behandling med diosgenin av 10 og 20 uM inhiberte 22% og 40% av celle invasjon, henholdsvis (fig. 3, A og B). Resultatene indikerte at diosgenin markert inhibert invasjon av PC-3-celler.
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer og celle invasjon Analysen ble utført. (A) De invaderte celler ble fotografert (200 × forstørrelse). (B) den invaderte PC-3-celler ble tellet i fem tilfeldige felt i hver behandling og data ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
* p
0,05,
** p
. 0,01, sammenlignet med ubehandlet kontroll
diosgenin hemmer aktivering og uttrykk av MMP-2 og MMP-9 i PC-3-celler
Siden aktivering av MMP er avgjørende for ECM degradering, noe som er nødvendig for celle invasjon, effekten av diosgenin på aktivering av MMP ble undersøkt. Etter PC-3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer i serumfritt medium, ble kondisjonert medium oppsamlet, konsentrert og analysert for MMP-aktivitet av gelatin zymografi. Resultatene viste at MMP-9 og MMP-2 aktiviteter ble betydelig redusert med 20 uM av diosgenin (Fig. 4A). Vi har videre demonstrert at diosgenin undertrykket ekspresjon av MMP-9 og MMP-2-mRNA og protein bestemt ved RT-PCR og Western blotting, henholdsvis (fig. 4, B og C). Resultatene indikerte at begge enzymaktiviteter og uttrykk for MMP-9 og MMP-2 ble inhibert av diosgenin.
(A) PC-3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av diosgenin i 24 timer og aktivitetene til MMP -9 og MMP-2 ble bestemt av gelatin zymografi. Uttrykk for MMP-9 og MMP-2-mRNA (B) og protein (C) ble analysert ved RT-PCR og Western blotting, respektivt. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (D) Nivåene av MMP-2, -9, -7, EMMPRIN og TIMP-1, -2 mRNA ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
* p
0,05,
** p
. 0,01, sammenlignet med ubehandlet kontroll
diosgenin hemmer mRNA uttrykk av MMP-2, MMP -9, MMP-7 og ekstracellulære induserer matriksmetalloproteinase (EMMPRIN) mens induserer TIMP-2 Expression
for å belyse effekten av diosgenin på uttrykket av gener som er involvert i ECM degradering, mRNA nivåer av MMP-2 , MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1 og TIMP-2 ble analysert ved kvantitativ real-time PCR. Resultatene viste at diosgenin hemmet mRNA-ekspresjon av MMP-2, MMP-9, MMP-7 og EMMPRIN på en doseavhengig måte. Diosgenin også forhøyet ekspresjon av TIMP-2, som er kjent for å blokkere den proteolytiske potensialet av MMP’er (fig. 4D). Resultatene antydet at diosgenin kan påvirke uttrykket av gener involvert i proteolytisk aktivering.
diosgenin hemmet PC-tre celle indusert Menneskelig navleveneendotel Cell (HUVEC) tube dannelse
Tube dannelse av endotelceller er en av de viktige trinnene i angiogenese er forbundet med progresjon av kreft og metastasering. For å undersøke den hemmende effekten av diosgenin på PC-3-celle-indusert angiogenese, vi utført in vitro rør dannelsen av HUVEC med kondisjonert medium fra PC-3-celler. HUVEC dyrket på Matrigel ble behandlet med aircondition media fra PC-3 celler behandlet med diosgenin i 24 timer, og rør dannelse ble evaluert. Resultatene viste kondisjonert medium fra PC-3-celler indusert rør dannelse av HUVEC, og kondisjonert medium fra celler eksponert for diosgenin trykt rør dannelse av HUVEC i en doseavhengig måte (fig. 5, A og B). Resultatene antydet at diosgenin kan undertrykke PC-3-celle-indusert angiogenese in vitro. Fordi PC-3 celler indusere angiogenese gjennom å uttrykke angiogene faktorer som VEGF, vurderer vi om diosgenin hemmer uttrykk for VEGF i PC-3 celler. Resultatene viste at mRNA-ekspresjon av VEGF i PC-3-celler ble merkbart redusert ved diosgenin på en doseavhengig måte (fig. 5C). Våre data antydet at diosgenin sperre PC-3-celle-indusert angiogenese ved å undertrykke VEGF-ekspresjon.
(A) HUVECs ble sådd ut på Matrigel og inkubert med kondisjonert medium fra PC-3-celler behandlet med diosgenin i 24 timer. Etter 6 timer ble de vedlagte nettverk av komplette rør fotografert (100 x forstørrelse). (B) De rørformede lengder av cellene ble målt ved hjelp av Image J programvare. (C) Et mRNA-ekspresjon av VEGF ble bestemt og presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
* p
0,05,
** p
. 0,01, sammenlignet med ubehandlet kontroll
diosgenin Hemmer fosforylering av PI3K, Akt, ERK og JNK
Flere studier har indikert at de signaliseringsproteiner, inkludert PI3K, Akt og MAPK medlemmer er involvert i ekspresjonen av MMP’er og indusering av metastase [30], [34], [35]. Effektene av diosgenin på den fosforylerte status av PI3K, Akt, ERK1 /2, JNK1 /2 og p38 i PC-3-celler ble undersøkt. Data viste at diosgenin redusert fosforylering av PI3K og Akt i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 6, A og B). I tillegg diosgenin trykkes fosforyleringen av ERK1 /2 og JNK1 /2 i en dose- og tidsavhengig måte, mens det ikke endre fosforylering av p38 (fig. 7, A og B).
PC-3-celler ble behandlet med forskjellige doser av diosgenin i 24 timer (A), eller 20 uM av diosgenin for 3, 6, 12, 18 og 24 timer (B). Fosforyleringen av PI3K og Akt ble bestemt ved hjelp av SDS-PAGE og Western blotting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
PC-3-celler ble behandlet med forskjellige doser av diosgenin i 24 timer (A), eller 20 uM av diosgenin for 3, 6, 12, 18 og 24 timer (B). Fosforyleringen av ERK1 /2, JNK1 /2 og p38 ble bestemt ved hjelp av SDS-PAGE og Western blotting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
For ytterligere å undersøke hvorvidt inhibering av celleinvasjon og MMP-2/9 ekspresjon var via hemming av ERK1 /2, JNK1 /2 og PI3K signale pathways, PC-3-celler ble behandlet med et PI3K-inhibitor (LY294002, 20 uM), ERK-inhibitor (U0126; 20 pM) og JNK-inhibitor (SP600125; 20 uM) i 24 timer. Resultatene viste at behandling av LY294002, U0126 og SP600125 redusert celle invasjon og MMP-2/9 ekspresjon signifikant (fig. 8, A og B), noe som tyder på at hemming av celleinvasjon og MMP-2/9 ekspresjon av diosgenin kan delvis forekomme gjennom å undertrykke PI3K, ERK og JNK veier.
(A) Cellene ble behandlet med LY294002, U0126 og SP600125 i 24 timer, og cellen invasive evner ble utført av Boyden kammer invasjon analysen. (B) Ekspresjon av MMP-2, ble -9 mRNA bestemt og uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
** p
0,01,
*** p
0,001, sammenlignet med ubehandlet kontroll
diosgenin nedregulerer Nuclear innhold NF-. kB i PC-3-celler
for å undersøke den hemmende virkningen av diosgenin på aktiviteten av NF-kB, mengden av IκBα i de cytosoliske ekstraktene og NF-kB i celle nukleære ekstrakter ble målt ved Western blotting. Data viste at diosgenin-behandlede PC-3-celler viste en økning i cytosol-protein nivået av IκBα og en reduksjon i kjerneproteinnivået av NF-kB (fig. 9). Resultatene implisert som diosgenin vesentlig hemmet NF-kB aktivitet.
PC-3-celler ble behandlet med forskjellige doser av diosgenin i 24 timer. (A) De cytosoliske og nukleære ekstrakter ble preparert og analysert for IκBα degradering og NF-kB p65 translokasjon. β-aktin og C23 ble benyttet som en cytosolisk og kjerneprotein lasting kontroll, respektivt. (B) bestemt nivå av IκBα og NF-kB ble kvantifisert ved densitometrisk analyse. De densitometriske Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
* p
0,05,
** p
0,01,
*** p
. 0,001, sammenlignet med ubehandlet kontroll
diskusjon
diosgenin har vist seg å ha anti-kreftfremkallende potensialer, slik som inhibering av cellevekst og indusere apoptose av forskjellige kreftcellelinjer [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. I denne studien har vi gitt bevis på at diosgenin var i stand til å hemme metastase
in vitro
, slik som migrasjon og invasjon i menneskelige prostata kreft PC-3 celler, noe som tyder på at diosgenin kan ha anti-metastatisk potensial.
Vi demonstrerte at diosgenin trykkes spredning av PC-3-celler i betydelig grad ved en konsentrasjon på 30 uM. Når PC-3 celler ble behandlet med diosgenin på ikke-toksiske doser (under 20 mm), ble migrasjon og invasjon hemmet. Disse resultatene underforstått at de hemmende effekter av diosgenin på PC-tre celle migrasjon og invasjon var ikke på grunn av sin cytotoksiske effekt.
Kreft metastase krever migrering av kreftceller. Under cellemigrasjon, er pericellulær proteolyse av ECM viktig for celle utvekst. Den proteolytiske nedbrytning av ECM-mediert av ekstracellulære proteaser, slik som MMPs, er nødvendig for prostatakreft celle migrering og invasjon. Blant dem, MMP-2, MMP-9 og MMP-7 spiller en viktig rolle i progresjon av prostata kreft. Ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 er forbundet med prostatakreft progresjon [42], [43]. Inhibering av MMP-2 og MMP-9 uttrykk undertrykke metastatisk potensial av prostatakreft [32], [44]. MMP-7 besitter proteolytisk aktivitet mot et spekter av ECM-substrater, inkludert kollagen, proteoglykaner, elastin, laminin, fibronektin og kasein. MMP-7 fremstilles også ved flere ondartede tumorceller, inkludert prostata, mage, hode og nakke, lunge, hepatocellulær, og kolorektal karsinom [45], [46]. Overekspresjon MMP-7 fremmer invasjon av prostatakreftceller [47]. I tillegg er EMMPRIN stand til å regulere MMP og være involvert i invasjonen og metastaseprosesser prostata kreft celler [27]. Hemming av EMMPRIN uttrykk reduserer tumorcelle invasjon i menneskelig prostata kreft celle [48]. TIMPs, regulator av MMP’er, er også involvert i tumorprogresjon, invasjon, metastase og angiogenese [49], [50]. I denne studien, viste vi at diosgenin hemmet migrasjon og invasjon av PC-3 celler.
