Abstract
Genomet er organisert og pakket inn i kjernen gjennom samhandling med kjerne histonproteinene. Emerging bevis tyder på at svulster er svært lydhør overfor epigenetiske forandringer som induserer kromatin-baserte arrangementer og tumor atferd dynamisk. Vi undersøkte kromatin organisasjon i hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) ved hjelp av acetylering nivåer av histon tre som en markør av kromatin komprimering. Sammenlignet med kontroll muntlige keratinocytter, fant vi at HNSCC celler er hypoacetylated og at microenvironmental signaler (f.eks microvasculature endotelceller) indusere tumor acetylering. Videre fant vi at kjemisk hemming av histone deacetylases (HDAC) reduserer antall kreft stamceller (CSC) og hemmer klonogene sfære formasjon. Paradoksalt inhibering av HDAC også induserte epitel-mesenkymale overgang (EMT) i HNSCC-celler, akkumulering av BMI-1, et onkogen assosiert med tumor aggressivitet, og ekspresjon av vimentin mesenchymale markør. Viktigere, observerte vi co-uttrykk for vimentin og acetylert histon 3 ved invasjonen foran menneskelige HNSCC tumorvev. Sammen er disse funnene tyder på at miljø signaler, for eksempel endotelcelle-utskilt faktorer, modulere svulst plastisitet ved å begrense bestanden av CSC og indusere EMT. Derfor kan hemming av HDAC utgjør en roman strategi for å forstyrre befolkningen i CSC i hode og nakke svulster å skape en homogen populasjon av kreftceller med biologisk definerte signaturer og forutsigbar oppførsel
Citation. Giudice FS, Pinto DS Jr, og heller JE, Squarize CH, Castilho RM (2013) Hemming av histondeacetylase Impacts kreftstamceller og induserer epitelial-Mesenchyme Overgang av hode og nakke kreft. PLoS ONE 8 (3): e58672. doi: 10,1371 /journal.pone.0058672
Redaktør: Irene Söderhäll, Uppsala Universitet, Sverige
mottatt: 06.11.2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 20 mars 2013
Copyright: © 2013 Giudice et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (NIH /NCI) P50-CA97248 (University of Michigan Head and Neck SPORE); og ved tilskudd R01-DE21139 fra NIH /NIDCR (JEN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blant ondartede hode og hals svulster, hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) er den vanligste epiteliale neoplasi og er en av de seks vanligste kreftformen i verden [1]. HNSCC er karakterisert ved lesjoner i munnhulen, strupehode, svelg og. Til tross for arbeidet med å utvikle biomarkører for tidlig deteksjon og prognose, har overlevelsen av HNSCC pasienter ikke vesentlig forbedret [2]. Utvikling av nye behandlingsformer som forbedrer overlevelse og livskvalitet for pasienter med HNSCC er stort behov for.
initiering og progresjon av kreft er i hovedsak styrt av genetiske og epigenetiske hendelser som påvirker genekspresjon [3]. Epigenetiske forandringer kan regulere genuttrykket uavhengig av genomisk mutasjoner. Epigenetiske alter blir ofte observert på DNA metylering og histon modifikasjon [4], [5]. Histoner kan modifiseres post-translasjonelt gjennom lysin acetylering og ubiquitinering, serin fosforylering, sumoylation, og metylering av lysiner og arginines [6]. Histone acetyltransferases (HAT) katalyserer overføring av en acetylgruppe fra acetyl-ko-A til e-amino stedet av lysin, som resulterer i kromatin decondensation. I kontrast, histone deacetylases (HDAC) handle i lysinresidier til kompakt kromatin og undertrykke gentranskripsjon [7], [8]. Interessant, er effekten av HDAC på kromatin organisasjon også knyttet til regulering og vedlikehold av stamcelle pluripotency i samarbeid med en rekke signalveier [9], [10]. Imidlertid er kromatin kondensasjon også forbundet med chemoresistance i tumorer [11] – [14]. Dette fenotype er delvis tilskrives spesialiserte celler som reaktiveres stamcelleliknende transkripsjon programmer [15]. Disse kreft stamceller (CSC) er preget av en høy proliferativ hastighet, aggressiv atferd, metastatisk potensiale, og evnen til å fornye seg selv [16] – [25]. CSC er viktige terapeutiske mål for kreft [26], og effekten av behandlingen med direkte rettet mot CSC er under etterforskning. Vi ønsket å finne ut om konflikt med kromatin kondens, kjent for å spille en sentral rolle i opprettholdelsen av normale stamceller [9], [10], vil påvirke svulst atferd og CSC innhold. Vi observerte hypoacetylated kromatin i et panel av HNSCC-avledede cellelinjer og identifisert en distinkt populasjon av CSC i disse cellene. Disse observasjonene bedt oss å spørre om kromatin acetylering tilsier det biologiske oppførsel av svulster og om farmakologiske interferens med HDAC endrer CSC atferd. Vi fant at hemming av HDAC forstyrrer opphopning av CSC og paradoksalt induserer kreftceller til å gjennomgå epitelial-mesenchymale overgang (EMT).
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur forhold
Vi brukte HNSCC-cellelinjer generert fra den kirurgiske fjerning av primære tumorer lokalisert i tungen (HN6, HN13 og Cal 27), farynks (HN30), strupehode (Hep2) og avledet fra en tunge svulst som spredning til lymfeknuter (HN12 ) [27], [28]. Normal oral keratinocyte spontant udødeliggjort cellelinje (NOK-SI) ble tidligere etablert og vennlig levert av Dr. Gutkind fra National Institute of Dental og kraniofaciale forskning (NIDCR /NIH) [29]. NIH /3T3 normal fibroblast cellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA) og dyrket ved bruk av DMEM (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) supplert med 10% bovint kalveserum ( Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 250 ng /ml amfotericin B (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Celler ble opprettholdt i en 5% CO2-fuktet inkubator. Primære menneskelige dermal mikrovaskulære endotelceller. (HDMEC; Lonza, Walkers, MD, USA) ble utarbeidet i serumfritt endothelial basal medium (Lonza, Walkers, MD, USA)
Western blotting
tumorceller ble lysert med cellelyseringsbuffer inneholdende proteaseinhibitorer og kort sonikert. Totalt protein ble løst på en 10-15% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en Immobilon-FL polyvinyldifluorid membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranene ble blokkert i 5% fettfri tørrmelk inneholdende 0,1 M Tris (pH 7,5), 0,9% NaCl og 0,05% Tween-20 i 1 time ved romtemperatur. Membraner ble inkubert med vimentin (klone V9, en 500, Dako, Carpinteria, CA, USA), BMI-en (1 500, Millipore, Billerica, MA, USA), acetyl-Histone H3 Lys9 (1 1500, Cell Signaling, Danvers , MA, USA) eller acetyl-Histone H4 Lys 5, 8, 12 og 16 (1 2000, EMD Millipore, Bille, MA, USA) primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Membranene ble deretter inkubert med passende sekundære antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase (Santa Cruz Biotechnology, Sta. Cruz, CA, USA) i 2 timer ved romtemperatur. Signalet ble utviklet ved hjelp av ECL SuperSignal West Pico substrat (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), og proteiner ble visualisert ved hjelp av UVP maskin (BioSpectrum Imaging System). GAPDH fungerte som en lasting kontroll (1:20.000, Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA).
FACS av hode og nakke CSC
hode og nakke kreft stamcelleliknende celler ble identifisert ved celle sortering for ALDH (aldehyd dehydrogenase) aktivitet. Den Aldefluor kit (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner for å identifisere celler med høy ALDH enzymatisk aktivitet. I korthet HN6 og HN13-celler ble behandlet med 300 nM Trichostatin A (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) i 24 timer og suspendert med aktivert Aldefluor substrat (BODIPY-aminoacetat) eller negativ kontroll (diethylaminobenzaldehyde, en spesifikk ALDH-inhibitor) i 45 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble analysert i FACSDiVA Cell Sortering (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA).
Cell invasjon analysen
HN6 og HN13 celler (5 × 10
4) var utsådd i 24-brønners plater i løpet av et homogent tynt lag av fibronektin (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) i Millicell Cell Culture Setter (Millipore, Billerica, MA, USA) som inneholdt polykarbonatfiltermembraner med 8 um diameter porer. Vi har fastslått at den optimale tiden for invasjonen HNSCC tumorceller var 8 timer etter såing, som gjenspeiles av betydelig antall celler som invaderte til bunnen av polykarbonatfilter membran (~60-70% av celler /totalt areal) (fig. S1). Tumorceller fra kontrollgruppen ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS og 1% antibiotika, og den HDAC-inhibitoren gruppen fikk 300 nm av Trichostatin A (TSA) fortynnet i media. Det nedre kammer inneholdt DMEM supplert med 20% FBS og 1% antibiotika. Etter plating ble cellene inkubert i 8 timer, basert på optimal invasjon tid (fig. S1), ved 37 ° C i en 5% CO2-fuktet inkubator. Invaderende celler i det nedre kammer ble farget med hematoksylin og eosin (H E). Bilder ble tatt ved hjelp av en QImaging ExiAqua monokrom digital kamera festet til et Nikon Eclipse 80i mikroskop (Nikon, Melville, NY, USA) og visualisert ved hjelp QCapturePro programvare.
IF-parafin embedding, IF-cellelinjer og antistoffer
human pasient biopsier ble innleiret i parafin, og 3-um snitt ble anvendt for immunofluorescens farging. I korthet seksjoner ble inkubert med primære antistoffer, vasket over natten med PBS, og inkubert med et sekundært antistoff konjugert til enten fluorescein (Jackson Immunoresearch Labs 1: 100) eller rhodamin (Jackson Immuno Research Labs 1: 100). Objektglassene ble montert med DAPI-inneholdende monteringsmedium (Vector Laboratories) og inkubert ved 4 ° C over natten med vimentin (klon V9, 1: 500, Dako, Carpinteria, CA, USA) og BMI-1 (1:500, Millipore, Billerica , MA, USA) antistoffer. For immunofluorescens-analyse ble celler sådd på dekkglass og fiksert med metanol i 6 minutter ved -20 ° C. Celler ble behandlet med TSA (300 nM) eller vehikkel i 24 timer hvor annet er angitt og farget for Ki-67 (1:100, Dako, Carpinteria, CA, USA), Cytokeratin 14 (1:1000, Covance, 155P), og rhodamin -phalloidin (1:150, Cytoskjelett, Denver, CO, USA). Celler ble co-farget med Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) for visualisering av DNA innhold. Bilder ble tatt ved hjelp av en QImaging ExiAqua monokrom digital kamera festet til et Nikon Eclipse 80i mikroskop (Nikon, Melville, NY, USA) og visualisert med QCapturePro programvare.
Sphere analysen
For å evaluere evnen av tumorcellelinjer for å vokse i suspensjon som sfærer, HN6 og HN13-celler (10
3) ble dyrket i ultra-lav festeplater (Corning, New York, NY, USA) i 5 dager. Kjøretøy eller TSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til kulturmediet til en sluttkonsentrasjon på 300 nM og nøye overvåket i 24 timer for å bestemme virkningen av hyper-acetylering i vedlikehold av CSC kuler.
Statistisk analyse
Statistisk analyse av invasjon og formeringshastigheten av tumorceller ble analysert ved bruk av en uparet t-test. Sfære formasjon assay kvantifisering ble utført ved enveis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey og Bonferroni multiple sammenligningstester. Vurdering av cellulær morfologi og uttrykk for vimentin ble analysert ved hjelp av GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software, San Diego, California). Stjernene betegne statistisk signifikans (NS, P 0,05; * P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001).
Resultater og Diskusjon
chromatin acetylering og cellulær oppførsel av HNSCC
for å undersøke hvilken rolle kromatin remodeling i HNSCC atferd, undersøkte vi kromatin acetylering i et panel av 6 HNSCC cellelinjer. En spontant udødeliggjort munnslimhinnen cellelinje (kr-SI) ble anvendt som en kontroll [29]. Histonproteinene spille strukturelle og funksjonelle roller i alle kjerneprosesser og gjennomgår ulike modifikasjoner [30], inkludert acetylering, metylering, fosforylering, ubiquitinering, SUMOylation, og poly-ADP-ribosylering å regulere kromatinstruktur og genuttrykk [31]. Acetylering av histon H3, ofte observert ved Lys9, 14, 18, 23, 27, og 56, spiller en rolle i genaktivitet [32], [33]. Spesielt har funksjonell acetylering av histon-3 ved Lys 9 blitt omfattende studert og er assosiert med histon avsetning, kromatin montering, og genaktivering [34] – [36]. Tumorceller har varierende grad av acetylering histon 3 ved lysin 9, som er en markør av aktive gener [32], [33]. Alle HNSCC cellelinjer vi analysert vises hypoacetylation av kromatin mot NOK-SI kontroller (Fig. 1A), noe som tyder HNSCC har kondensert kromatin henhold basale dyrkningsforhold. Det ble også rapportert redusert acetylering nivåer av histon tre på lysin 9 i tumorer fra lunge og spiserør [37] – [39] og i 3D kulturer av neuroblastom celler og kreft kuler avledet fra melanomceller [40] – [42]. Endringer i kromatin organisasjonen spiller en rolle i mange menneskelige sykdommer, inkludert kreft [43], hvor de blir betraktet som en verdifull prognostisk markør [44].
(A) Western blot analyse som viser global kromatin hypoacetylation av HNSCC, som dokumentert av lave nivåer av acetyl-Histone H3 Lys9 (Ac.H3) sammenlignet med kontrollgruppen normale muntlige keratinocytter (NOK-SI). (B) Representative bilder og søylediagram av invasjonen analyser. HN6 viser en betydelig invasiv kapasitet i forhold til HN13 (*** p 0,001). Invasjon ble bestemt ved telling HNSCC-celler i bunnen av membranen (se Materialer og metoder for detaljer) i flere felt (20X). (C) Western blot analyse som viser høye uttrykk nivåer av endogen vimentin, en kanonisk markør for EMT, i HN6 celler, men ikke i HN13 celler. (D) Evaluering av CSC markør ALDH demonstrerer at HN6 ha et høyt antall ALDH + celler, å summere til mer enn 11% av den totale tumorcellepopulasjon. Omtrent 6% av HN13 cellene er ALDH +. (E) Representant eksempel på holoclones (pil), meroclones (pilspiss) og paraclones (stjerne) dannet under HN6 klonogene analysen. HN13 kreftceller dannes primært udifferensierte holoclones (pil). Kvantifisering av kuler avslører økt evne HN6 celle for å generere kuler i forhold til HN13 (** p 0,01).
Vi neste undersøkte aggressivitet HNSCC celler med lave acetylering nivåer. HN6 tumorceller som er følsom overfor cisplatin (Almeida OA og Castilho RM, upubliserte data), viste forbedret invasivitet (figur 1B, *** p . 0,001) og høy ekspresjon av endogen vimentin, et mellomliggende filament ofte funnet i aggressive ondartet epiteliale tumorer som er under epitelial-mesenchyme overgang (EMT) [45] – [47] (figur 1C.). Deretter forsøkte vi å karakterisere tilstedeværelsen av en subpopulasjon av CSC kjent for å bekrefte til startfasen, vekst og metastase [16] – [25] og er forbundet med utviklingen av EMT [48] – [50]. Selv om flere markører har blitt foreslått for å identifisere CSC befolkningen innenfor hode og nakke kreft, er aktivitetsnivået av enzymet aldehyd dehydrogenase (ALDH) anses å være en svært selektiv markør for CSC og en stamcelle biomarkør for ulike normale og kreftstamceller [51] – [54]. Invasive HN6 har en presentert en høyt antall ALDH-positive (ALDH +) celler, summere til mer enn som tilsvarte over 11% av den totale befolkningen (Fig. 1D_HN6). I motsetning til HN6 celler, HN13-celler ikke uttrykker vimentin, viste redusert invasivitet, og bare 6% av deres totale cellepopulasjon var sammensatt av ALDH + -celler Interessant, HN13 tumorceller oppførte seg forskjellig i forhold til HN6 celler som presenterer en populasjon på 6% av ALDH + celler, fravær av vimentin uttrykk, og redusert invasiv kapasitet (fig. 1B, C og D_HN13). I en klonogene analyse, HN6 og HN13 celler dannet 3 forskjellige kule mønstre, identifisert som holoclones, meroclones og paraclones, som er direkte forbundet med «stemness» Etter, klonogene analysen av hode og nakke tumorcellelinjer som vises dannelsen av 3 forskjellige kule mønstre direkte knyttet til «stemness» oppførsel, de holoclones, meroclones og paraclones [55] – [57]. Holoclones er preget av godt avgrensede kanter og har det største vekstpotensialet, og dermed trolig være sammensatt av udifferensierte stamceller. Paraclones er preget av rask vekst, ennå, men begrenset cellular levedyktighet. Meroclones ligge mellom de to andre kule mønstre og er preget av de to foregående beskrevet CSC kuler mønstre, ved å presentere kolonier med krøllete utkant og forbedret cellulær levedyktighet i forhold til paraclones [55]. Vi observerte at invasive HN6 kreftceller generert flere kloner forhold til HN13. Spesielt, kule dannende celler fra HN6 var en blanding av holoclones (Fig. 1E_arrow), meroclones (Fig. 1E_arrow hode) og paraclones (Fig. 1E_asterisk). Men HN13 sfærer inneholdt bare store holoclones og ingen meroclones eller paraclones (Fig. 1E_arrow), noe som tyder på en homogen befolkning på CSC.
Samlet våre resultater tyder på at hode- og nakkekreftceller konsekvent opprettholde hypoacetylated kromatin til tross for sin aggressive oppførsel. Økt kromatin kondensasjon er korrelert til tumorresistens til kjemoterapier [11] – [14], sannsynligvis på grunn av en forstyrret strøm av DNA-reparasjons molekyler til kjernen og svekket apoptose [58]. Faktisk er kromatin decondensation nødvendig for DNA-reparasjon [59] – [62], hvorved medlemmer av DNA-reparasjon av veier spille en rolle i kromatin omstilling fra storskala kromatin utfolding [59], [63]. Tilstedeværelsen av CSC, som detektert av ALDH enzymatisk aktivitet i humane hode- og nakkekreft cellelinjer er interessant, og viser evnen av tumorceller for å opprettholde en heterogen populasjon. Spesielt, har vi funnet at aggressive kreftceller er sammensatt av en heterogen populasjon av kule-dannende celler består av holoclones, meroclones, og paraclones og et samlet stort antall sfærer (figur 1E, ** p . 0,01). Den heterogene CSC mønsteret ble ikke observert i lat hode og hals kreftceller. Disse funnene tyder sameksistens av tumorceller med varierende grad av «stemness» som står for både deres CSC befolkning og invasivitet.
svulstens mikromiljø og HDAC hemmer modulerer kromatin acetylering og CSC innhold
Etter vår tidligere observasjoner at kreftceller er funnet hypoacetylated, bestemte vi oss for å søke etter miljømessige signaler som kan påvirke kromatin acetylering under tumorinvasjon. Vi valgte arginin rike histoner H3 og H4 som markører for kromatin acetylering basert på deres evne til å organisere DNA i nucleosomes. Acetylert histoner H3 og H4 utgivelsen supercoil DNA fra nukleosomer å gjøre genene mer tilgjengelig [64]. I tillegg acetylering av histoner H3 og H4 påvirker høy ordre kromatin strukturer og gjør DNA-bindingsseter tilgjengelig for transvirkende faktorer [65], [66]. Vi behandlet tumorceller med kondisjonert medium (CM) avledet fra fibroblaster og endotelceller, to hovedkomponenter i svulsten mikromiljøet [67] – [69]. Selv om fibroblaster utgjør det viktigste cellulære komponent i dermis og sub-mukosa, CM fra disse cellene ikke klarte å indusere endringer i acetylering av histoner H3 (Ac. H3) og H4 (Ac. H4) (fig. 2A_Fibroblast CM). Men CM fra endotelceller hadde en tydelig effekt på organiseringen av svulsten kromatin (Fig 2A_Endothelial CM -.. Ac H3 og H4 Ac.). Interessant, i respons til CM fra endotelceller, vises HN6 celler acetylert kromatin og økt ekspresjon av vimentin, som hovedsakelig er observert under EMT [45] – [47]. BMI-1, et medlem av den polycomb repressoren komplekset 1 som er involvert i kromatin remodellering og høyt uttrykt i kreftceller [70] – [72], ble oppregulert i HN6 i respons til endotele CM (fig 2A_ Endothelial CM_HN6.). Overraskende, endotelial CM indusert kromatin komprimering i HN13-celler (fig. 2A_ Endothelial CM_HN13) på en måte som ligner på den aktuelle to-trinns prosess med transkripsjonen undertrykkelse mediert av polycomb gruppe familie av gener (PCG). Denne prosessen påvirker DNA tilgjengelighet negativt av transkripsjons og ombygging faktorer, som resulterer i kromatin komprimering (gjennomgått av Sparmann A,
et al
. [73]). Deacetylering av HN13 celler endret ikke BMI-en og vimentin uttrykk (Fig. 2_Endothelial CM). Avvik mellom tumor oppførsel og kromatin respons på miljømessige endringer kan skyldes mutasjoner i PCG familiemedlemmer som forårsaker den aggressive oppførsel observert i HN6 tumorer-celler (Fig. 1 B og C).
(A) Western blot-analyse viser at fibroblast-kondisjonert medium (FCM-venstre panel) ikke modulerer kromatin acetylering (Apg. H3 og H4 Ac.), BMI-1 eller vimentin nivåer i tumorcellelinjer. Endothelial-avledet kondisjonert medium (ECM høyre panel) påvirker svulst acetylering som avbildet ved forhøyet Ac. H3 og Ac. H4 nivåer i HN6 celler og ablasjon av AC. H3 og Ac. H4 nivåer i HN13 celler. Merk at sammen med Ac. H3 og Ac. H4, HN6 cellene vise mindre økninger i BMI-1 og vimentin nivåer. (B) Tumor spredning vurderes av Ki67 demonstrerer redusert spredning etter administrering av HDACi TSA (300 nM) i 24 timer. (C) Administrasjon av TSA (300 nM) i 24 timer reduserer den totale befolkningen i CSC i HN6 og HN13 celler, noe som gjenspeiles av tilstedeværelsen av ALDH + celler. (D) HDACi (TSA) forstyrrer svulst holoclones som avbildet i representative bilder av kreftkuler og ved kvantifisering av kuler (HN6 ** p 0,01, HN13 * p 0,05).
neste avgjøres om kromatin acetylering alene påvirkninger hode og nakke tumor atferd. Vi brukte Trichostatin A (TSA) HDAC-inhibitor for kjemisk å indusere kromatin acetylering. TSA hemmer selektivt HDAC klassene I og II, som besitter epigenetisk aktivitet. I det siste, TSA har også blitt vist å hemme ikke-histon transcriptional faktorer og co-regulatorer, inkludert p53, STAT, og NFkB [74], [75]. Etter å bestemme den optimale konsentrasjonen av TSA (300 nM) i stand til å indusere hode og nakkekreft celle acetylering (Fig S2.) [76] – [82], har vi funnet at inhibering av HDACs direkte nedsatt spredning av HNSCC-celler (Fig 2B. , HN6 * p 0,05, HN13 *** p 0,001). Vi observerte også en uventet reduksjon i andelen CSC ved behandling med TSA (fig. 2C_TSA), med en 7% reduksjon i ALDH + celler isolert fra HN6 og en omtrentlig 6% reduksjon i ALDH + -celler fra HN13 (fig. 1D_Vehicle). Som et funksjonelt assay, vurderte vi påvirkning av TSA på den klonogene dannelsen av CSC kuler. Ved hjelp av ultra-lave vedheft plater, dyrket vi tumorceller ved lav samløpet i 5 dager og observert før dannelsen av veldefinerte kuler. Etter sfære dannelse, ble administrert TSA, og kulene ble nøye overvåket. Overraskende, induksjon av kromatin acetylering resulterte i en rask og progressiv ødeleggelse av kuler (figur 2D, HN6 ** p . 0,01, HN13 * p 0,05). Forstyrrelse av tumor kuler antyder at kromatin acetylering indusert av HDAC hemming forstyrrer de fysiologiske kravene til CSC vedlikehold. Faktisk har kromatin acetylering lenge vært kjent for å indusere cellulær differensiering og begrense cellulær transformasjon [83], [84]. Derfor kan HDAC hemmere (HDACi) være en roman terapeutisk strategi for å svekke de skadelige effektene av CSC. Disse resultatene tyder på en dynamisk prosess der hode og nakke kreft celler er svært utsatt for miljø drevet epigenetiske forandringer, støtter forestillingen om at epigenetisk målretting kan være en effektiv og verdifull tilnærming for kjemoterapi og chemoprevention av kreft [4]. HDAC-inhibitorer (HDACi) er stoffer som er rettet mot spesifikke enzymer som er involvert i epigenetisk regulering av genekspresjon og er potensielt en ny klasse av anticancermidler [4], [5], [7], [12], [85]. Selv HDACi er vellykket i behandling av hematologisk kreftsykdom, deres bruk i solide tumorer er fortsatt kontroversielt [86], [87].
Kjemisk indusert kromatin acetylering fremmer EMT i HNSCC celler
Effekten av HDACi på CSC bedt oss å avgjøre om behandling med TSA vil endre flere kjennetegn ved hode- og halskreft. Ondartede svulster avledet fra epitelceller (karsinom) gjennomgår en utsøkt prosess som kalles EMT som går forut for invasjonen og progresjon av kreftceller [46], [88] – [91]. EMT er preget av tap av celle adhesjon, økt bevegelighet, aggressiv atferd, og anskaffelse av en langstrakt fibroblastoid morfologi og uttrykk for vimentin, en kanonisk markør for EMT [45] – [47]. Spesielt aggressive HN6 cellene hadde konstituerende uttrykk for vimentin (Fig. 1C) og en overveiende brostein utseende (Fig. 3A_Vehicle_HN6). Farmakologisk hemming av HDAC forårsaket celler til hurtig endre sin morfologi i en spindel form og for å øke vimentin ekspresjon (Fig. 3A_ TSA_HN6). Videre administrasjon av TSA indusert spindel morfologi og vimentin uttrykk i HN13 celler (Fig. 3A_ TSA_HN13) som ikke vanligvis uttrykker dette mellomfilament (Fig. 1C_HN13_Vimentin). Vi observerte ikke TSA-indusert morfologiske endringer eller vimentin uttrykk i normale celler (Fig. 3A_NOK-SI), noe som tyder på at hyperacetylation av kromatin forskjellig modulerer normale og neoplastiske celler. Selv om det totale antall HN6 celler som uttrykker vimentin bare marginalt økt som følge av TSA (Fig 3B_HN6, * p. 0,05), tumorceller viser fibroblastoid morfologi var stort sett positive for vimentin (Fig 3C_HN6, *** p. 0,001). Kombinasjonen av vimentin uttrykk og fibroblastoid morfologi ble også observert i HN13 celler etter kromatin acetylering (Fig 3B og C_HN13 *** p. 0,001). Disse resultatene tyder på en sterk rolle for kromatin decondensation under oppkjøpet av en EMT fenotype i HNSCC celler.
Hemming av histondeacetylase induserer vimentin uttrykk i HNSCC celler og oppkjøp av spindelformede morfologi. (A) Representative eksempler på morfologiske endringer og ekspresjon av cytokeratin 14 (CK14) epitelcelle-markør og vimentin mesenchymale markør. Legg merke til at normale keratinocyter uttrykker CK14 i nærvær av kjøretøyet eller TSA og cellemorfologi er kontinuerlig epithelioid (brostein eller skiveformet utseende). Både HN6 og HN13 celler uttrykker CK14 og en epithelioid form (A, kjøretøy). Etter TSA behandling, HN6 og HN13 uttrykke vimentin og bli spindel formet. (B) Graphics representerer prosentandelen av celler som var positive for vimentin følgende TSA eller kjøretøy behandling. TSA-indusert kromatin acetylering resultater i økt vimentin uttrykk i HN6 og HN13 celler (* p 0,05 og *** p 0,001). (C) Grafisk representerer vimentin uttrykk i spindelformede celler (kreftceller med EMT-lignende morfologi). HN6 og HN13 celler viser betydelige økninger i vimentin uttrykk etter TSA behandling (*** p 0,001).
Chromatin hyperacetylation forbedrer invasjon og uttrykk av BMI-en i hode og nakke kreft
BMI-en
genet er oppregulert i en rekke kreftformer og forbundet med økt tumor aggressivitet og dårlig overlevelse [71], [92] – [97]. Den oncogene effekt av BMI-en er i hovedsak mediert ved å undertrykke p16
ink4 tumorsuppressorgen, som fører til aktivering av pRB og p53-signalering [98], [99]. Vi fant at TSA-behandlede tumorer viste økt ekspresjon av BMI-1 (fig. 4A) lokalisert i kjernen (fig. 4B), utvikling av en spindel formet fenotype, og polarisering av F-aktin filamenter (fig. 4B). Interessant, polarisering av aktin filamenter ble bare observert i tumorceller behandlet med TSA. Normale humane epitelceller endret ikke deres morfologi i respons til kromatin decondensation, noe som tyder på en selektiv effekt av HDACi i tumorceller (Fig. S3_NOK-SI). Oppregulering av BMI-en var også assosiert med økt invasivitet av HN6 og HN13 celler (fig 4C, HN6 * p. 0,05 og HN13 *** p 0,001). Kollektivt, har vi funnet at uavhengig av det opprinnelige invasiv kapasitet av HN6 og HN13-celler (fig. 1B og C), kjemisk-indusert kromatin acetylering forårsaket HNSCC å gjennomgå EMT (fig. 3) og oppregulere BMI-1 (fig. 4A og B ). Paradoksalt nok, hemming av HDACs også svekket CSC befolkningen (Fig. 2C). Disse funnene tyder på at acetylering av HNSCC kromatin svekker direkte undergruppe ALDH + kreftceller, og dermed velge for en homogen undergruppe fratatt multipotency egenskaper [16] – [25]. Videre er klinisk anvendelse av HDACi svært vellykket ved behandling av hematologiske ondartede sykdommer som ofte opptrer som homogene sykdommer. Dermed kan epigenetiske faktorer som modulerer kromatin acetylering være ansvarlig for å utløse endringer i HNSCC atferd ved å alternere tumorceller mellom et stillestående og «stemness» scenen som motstår kjemoterapi til en mer aggressiv og krenkende atferd som fremmer tumormetastaser. Denne mekanismen er i tråd med den nye tumorigenitet modell av mobilnettet «plastisitet», og kan representere en viktig mekanisme som brukes av HNSCC samtidig skaffe seg en invasiv atferd og chemoresistance. Den opprinnelige bruken av HDACi kan gi et molekylært definert vindu av muligheter for pasienter med hode og nakke kreft ved kjemisk ablating svulst «plastisitet» før administrering av gentoksisk kjemoterapi.
(A) Western blot analyse som viser økt BMI -1 uttrykk i HNSCC celler etter TSA behandling. (B) Representative bilder av kjernefysisk BMI-1 (FITC /grønn) og polariseringen av de F-aktin filamenter (TRITC /rød) i tumorceller som gjennomgår EMT etter TSA behandling. (C) Representative eksempler på øket tumorcelle-invasjon etter behandling med HDAC-inhibitorer. Legg merke til den betydelige økningen i invasivitet av HN6 og HN13 celler (* p 0,05 og *** p 0,001 henholdsvis). (D) Representative eksempler på humane prøver av normal munnslimhinnen og HNSCC (H E farget). Merk acetylerte tumorceller (Apg. H3-FITC) som co-express høye nivåer av vimentin (trict /grønn) ved invasjonen foran HNSCC.
