Abstract
Menneskelig eksponering for bisfenol A (BPA) er allestedsnærværende. Dyrestudier fant at BPA bidrar til utvikling av prostatakreft, men menneskelige data er mangelvare. Vår studie undersøkte sammenhengen mellom urin BPA nivåer og prostata kreft og vurdert effekten av BPA på induksjon av sentrosomen abnormiteter som en underliggende mekanisme fremme prostata kreftutvikling. Studien, som involverer 60 urologiske pasienter, fant høyere nivåer av urin BPA (kreatinin justert) i prostatakreftpasienter (5,74 mikrogram /g [95% CI, 2.63, 12.51]) enn hos ikke-prostatakreftpasienter (1,43 mikrogram /g [95% KI, 0,70, 2,88]) (
p
= 0,012). Forskjellen var enda mer betydelig i pasienter 65 år gammel. En trend mot en negativ sammenheng mellom urin BPA og serum PSA ble observert hos pasienter med prostatakreft, men ikke i ikke-prostatakreftpasienter.
In vitro
studier undersøkte centrosomal abnormiteter, microtubule nucleation og forankringsuavhengig vekst i fire prostatakreft cellelinjer (LNCaP, c4-2, 22Rv1, PC-3) og to udødelig normale prostata epitel cellelinjer (NPrEC og RWPE-1). Eksponering for lave doser (0,01 til 100 nM) av BPA økte prosentandelen av celler med sentrosomen forsterkning to til åtte ganger. Dose svar enten toppet eller nådd platåer med 0,1 nM BPA eksponering. Dette lavdose også fremmet microtubule nucleation og gjenvekst på centrosomes i RWPE-en og forbedret forankringsuavhengig vekst i c4-2. Disse funnene tyder på at urin BPA nivå er en uavhengig prognostisk markør i prostata kreft og at BPA eksponering kan senke serum PSA nivå i prostatakreftpasienter. Videre kan forstyrrelse av sentrosomen duplisering syklus av lavdose BPA bidra til neoplastisk transformasjon av prostata
Citation. Tarapore P, Ying J, Ouyang B, Burke B, Bracken B, Ho SM (2014) eksponering for Bisfenol A korrelerer med tidlig debut av prostatakreft og Fremmer sentrosomen Amplification og Anchorage-Uavhengig Vekst
In vitro
. PLoS ONE 9 (3): e90332. doi: 10,1371 /journal.pone.0090332
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 25 november 2013; Godkjent: 30 januar 2014; Publisert: 03.03.2014
Copyright: © 2014 Tarapore et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Institutes of Health (P30-ES006096, U01-ES019480, U01-ES020988), en Veterans Administration Merit Award (I01-BX000675), en intern finansieringskilde fra University of Cincinnati til SMH og PT og congressionally Regissert Medical Research Program Department of Defense Award (PC094619) til PT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest vanligste kreftformen blant menn i Nord-Amerika. Aldring er en veletablert risikofaktor for PCa [1]. Én av seks menn vil utvikle PCa over livet; Men, er kreft sjelden diagnostisert hos menn 40 år gammel, med nesten to tredjedeler tilfeller rapportert [2], [3] i menn på 65 år fra 2006 til 2010, var median alder ved diagnose var 66 år i henhold til statistikken fra National Cancer Institute overvåkings epidemiologi og sluttresultatet Studies (2013) [4]. Store andre enn alder medvirkende faktorer er rase og slektshistorie [1], mens lite er kjent om effekten av hormonforstyrrende på PCa.
bisfenol A (BPA) er en organisk forbindelse med den kjemiske formelen (CH
3)
2C (C
6 H
4OH)
2. BPA brukes til å lage polykarbonat plast og epoksyharpikser, som er til stede i tusenvis av forbrukerprodukter [5], [6]. I USA, er eksponering for BPA utbredt, over 90% i den generelle befolkningen [7]. Dermal absorpsjon, innånding og svelging fra forurenset mat og vann er de viktigste eksponeringsveier [8]. Som en endokrin disruptor som etterligner østrogen og skjoldbruskkjertel hormon, BPA fungerer også som en metabolsk og immun disruptor. Dermed de negative helseeffekter av BPA er omfattende [9], [10], og høyere nivåer av BPA eksponering korrelerer med økt risiko for hjerte- og karsykdommer, fedme, diabetes, immunsykdommer, og en rekke reproduktive dysfunksjoner [11], [ ,,,0],12], [13]. Videre
in vitro Kjøpe og dyrestudier har vist at BPA eksponering kan øke risikoen for melkekjertlene, hjerne, og prostata cancer [9]. Men menneskelige studier knytter BPA eksponering for økt kreftrisiko er mangelvare. En slik studie i Kina viste at forekomsten av meningeom var 1,6 ganger høyere hos voksne med høyere konsentrasjoner av BPA i urinen enn i de med lavere konsentrasjoner [14]. Lignende studier for PCa har ikke vært tilgjengelig før nå.
En sentrosomen omfatter et par sylindriske strukturer som kalles
Sentrioler
omgitt av pericentriolar materiale. Centrosomes er involvert i organiseringen av inter microtubule cytoskjelettet, mitosetråder og flimmerhårene. Sentrosomen dysfunksjon (nummer og integritet), et kjennetegn på mange kreftformer, antas å initiere neoplastisk transformasjon og fremme sykdomsutvikling [15], [16]. En unormal antall centrosomes kan resultere i mono- eller multipolar mitose, som fører til økt Aneuploidy [15], [16]. En annen funksjon i centrosomal avbrudd er unormalt i microtubule (MT) nucleation og forankring. Slike forandringer er sett oftere i brystkreftceller enn i normale bryst epitelceller [15], [16]. Også en betydelig antall gener assosiert med øket risiko PCa er i veier som fører til sentrosomen dysfunksjon [17], [18]. Disse observasjonene har bedt oss om å undersøke, i cellebaserte modeller, de negative effektene av BPA på sentrosomen syklusen som en mekanisme som bidrar til prostata kreftutvikling.
Vi brukte en tverrsnitts klinisk studie for å undersøke sammenhengen mellom BPA eksponering og PCa. Vi antok at BPA spiller en rolle i prostata kreftutvikling. Vi fant at pasienter med PCa er mer sannsynlig enn de uten PCa å ha høyere nivåer av BPA i urinen. Vi observerte en trend mot en negativ sammenheng mellom urin BPA og serum PSA nivåer i PCA pasienter. Vi utførte
in vitro
studier for å vurdere virkningene av BPA på sentrosomen nummer, dannelsen av MT asters, og kolonisering i myk agar i to udødelig normale prostata epiteliale cellelinjer (RWPE-1 og NPrEC) og fire PCA -cellelinjer (LNCaP, c4-2, 22Rv1, PC-3). Vi har funnet at prosentandelen av celler med sentrosomen forsterkning (CA) økte i respons til lavdose BPA eksponering og at forholdet var ikke-monoton for de fleste cellelinjer. Videre eksponering for lav-dose BPA promo MT aster organisasjonen i den ikke-kreft RWPE-1 og økt forankrings-uavhengig vekst i androgen-uavhengig c4-2 PCa cellelinje. Samlet er disse funnene avsløre en hittil ukjent sammenheng mellom BPA eksponering og PCa og foreslå en mekanisme underliggende rolle BPA i neoplastisk transformasjon og utvikling av sykdommen.
Materialer og Metoder
Pasienter og innsamling av urinprøver
Pasientene ble rekruttert fra urologisk klinikk ved Universitetet i Cincinnati Medical Center under en protokoll godkjent av University of Cincinnati Institutional Review Board. Tabell 1 viser pasientkarakteristika og diagnostisk informasjon. Etter signering et informert samtykkeskjema, pasienter gjennomgikk en digital rektal undersøkelse og ble bedt om å gi en 20- til 50-ml urinprøve før deres planlagte ultralydveiledet prostata biopsi. Alle prosedyrer i denne studien ble godkjent av University of Cincinnati Institutional Review Board. Urinprøvene ble sentrifugert, ble sedimentet oppsamlet for en PCa biomarkør studie [19], og supernatantene ble lagret i alikvoter ved -80 ° C i BPA analyse. Blant de 60 prøvene som brukes for denne studien, 27 var fra pasienter med PCa (PCA) og 33 var fra pasienter uten PCa (non-PCA).
Måling av BPA i urinprøver
BPA nivåer i prøvene ble bestemt i laboratoriet for organisk analytisk kjemi fra Wadsworth Center, New York State Department of Health, (Albany, New York). Væskekromatografi (HPLC) som er forbundet med elektro trippel-kvadrupol massespektrometer (ESI-MS /MS) ble benyttet for å kvantifisere BPA, en teknikk lik den som er beskrevet tidligere, med noen modifikasjoner [20], [21]. I korte trekk, ble 500 ul av hver urinprøve blandet med 1 ml av glukuronidase (2 pl /ml) for fordøyelse og utvinning. For kvalitetskontroll, 5 ng
13C
12-BPA ble tilsatt til hver blanding. Ekstrakter ble tilført en Agilent 1100-serien HPLC tilkobles med en Applied Biosystems API 2000 elektro MS /MS (Applied Biosystems, Foster City, CA) for kvantitativ av BPA. Data ble ervervet ved hjelp av multippel-reaksjon overvåking for overgangene 227 212 for BPA, og 239 224 for
13C
12-BPA. Minstedeteksjonsgrensen (MDL) av BPA i denne protokollen var 0,05 ng /ml. For konsentrasjoner under MDL, ble en verdi lik MDL dividert med kvadratroten av 2 anvendt i statistiske analyser [22]. Rapporterte konsentrasjoner ble korrigert for inngang på surrogat standard (isotopisk fortynning metoden). Den BPA standard piggete til utvalgte prøve matriser og gått gjennom hele analysemetoden ga en bedring på 88% ± 8% (gjennomsnitt ± SD). En ekstern kalibreringskurve ble fremstilt ved å injisere 10 pl 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50 og 100 ng /ml standard, og regresjonen koeffisienten var 0,99.
Normalisering av urin BPA
urin~~POS=TRUNC kreatinin nivåer ble brukt til å justere for variasjon i fortynning og for å avgjøre gyldigheten av en spot urinprøve for å vurdere kjemisk eksponering [23]. En kreatinin (urin) assay kit fra Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI) ble brukt i henhold til produsentens protokoll for å måle urin kreatinin nivåer. De kreatinin nivåer ble brukt til å justere urinkonsentrasjonen av BPA målt ved HPLC-ESI-MS /MS for å få de «kreatinin justert» BPA nivåer (BPA nivåer) i mikrogram /g.
Cells
PCA-cellelinjer PC-3, LNCaP, c4-2, og 22Rv1 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i henhold til standard anbefalte, forhold. En beskrivelse av opprinnelsen til udødelig normal prostata epitel NPrEC cellelinje har blitt publisert [24]; den andre immortalisert normal prostata epitel cellelinje, RWPE-en, ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia) og ble dyrket i Definert keratinocyte-SFM medium (Invitrogen, Carlsbad, California) med vekstfremmende supplement. Cellekulturer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2 atmosfære.
BPA behandlinger
Celler fra hver cellelinje ble sådd inn i seks-brønns plater med glassdeksel slips på 25.000 celler /brønn. Etter 24 timer ble mediet forandret til fenolrødt-fritt media med 10% trekull-strippet serum i ytterligere 24 timer, på hvilket tidspunkt BPA ble tilsatt for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM eller 100 nM. Forsøket ble gjentatt fem ganger for å generere en total på fem prøver per cellelinje pr BPA konsentrasjon.
Indirekte immunfluorescens
For farging av centrosomes ble cellene fiksert med metanol i 5 minutter ved -20 ° C og deretter behandlet for γ-tubulin (klon GTU88 antistoff, Sigma immunokjemiske), α-tubulin (klon DM1A, Sigma immunokjemiske), og centrin (SC-50452, Santacruz Biotechnology) farging som tidligere beskrevet [25]. I korte trekk ble cellene ekstrahert i 1% NP-40 i PBS i 10 min. Celler ble probet med primære antistoffer, og de antistoff-antigen-kompleksene ble detektert med Alexa fluor 488 eller 594-konjugerte antistoffer (Molecular Probes). Celler ble også farget for DNA med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Invitrogen). Immunostained celler ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi.
microtubule (MT) aster formasjon analysen
Effekten av BPA på mikrotubulidynamikk ble bestemt ved en analyse av MT aster formasjon beskrevet tidligere [25]. I korte trekk ble celler behandlet med nocodazol (1,5 ug /ml) i 40 minutter på is for å depolymerisere inter MTS, vasket med PBS for å fjerne nocodazol, og inkubert i friskt varmt medium i 10 minutter ved 37 ° C for å tillate MT gjenvekst .
Målinger
antall centrosomes per celle ble scoret av fluorescens mikroskopi. Minst 150 celler ble undersøkt per behandling, og prosentandelen av celler med et unormalt antall centrosomes beregnet fra det totale antall celler som ble undersøkt ble anvendt som effektparameter for analysen. En stor abnormitet i CA ble definert som en celle med flere enn to centrosomes.
forankrings-uavhengig vekst assay
Celler ble analysert med hensyn på forankrings-uavhengig vekst ved å måle effektiviteten av kolonidannelse i halvfast medium som beskrevet [26]. I korte trekk ble celler dyrket under betingelser som er beskrevet ovenfor, i nærvær eller fravær av 0,1 nM BPA, for ~ 10 passasjer. Vi valgte 0,1 nM fordi denne konsentrasjonen indusert den høyeste andelen av celler med CA for de fleste cellelinjer (se resultater). Omtrent 2500 celler /brønn 35-mm ble lagt i bløt agar. Celler ble matet to ganger i uken med friskt medium med og uten BPA. Etter 2-3 uker ble kolonier tellet under et mikroskop. Forsøk ble utført in triplo og gjentatt to ganger. Koloni-dannende effektivitet er antallet kolonier erholdt dividert med det totale antall celler belagt, multiplisert med 100.
Statistisk analyse
Det primære endepunktet i den kliniske analyse var en kontinuerlig variabel av urin BPA nivå etter normalisering eller justering for urin kreatinin nivå. Innledende inspeksjon av fordelingen viste at denne variabelen var svært skjev til høyre. Derfor ble det log-transformert variabel (LnBPA) brukt som avhengig variabel i de statistiske modellene. Den viktigste statistiske modellen var en fast effekt modell for å vurdere sammenhengen mellom LnBPA og PCa status (1 = ja, 0 = nei). Vi søkte både ujustert og justert metoder til våre fast effekt modell. I den ujusterte metoden, PCA status var den eneste uavhengige variabelen. I den justerte metoden, vi inkludert alder (stratifisert som alder ≥65 g 65 år) og serum PSA nivå som kontrollerende kovariater. Vi utførte
post hoc
sammenligninger av midler mellom PCa og ikke-PCA pasienter og en lignende sammenligninger i undergrupper av pasienter stratifisert etter alder. Wilcoxon Rank Sum tester ble brukt til å validere funnene fra de fast-effekt modeller for å sikre at alle deres funn var robuste (data ikke vist). For urin BPA og andre tall uavhengige variabler som serum PSA nivå, ble forholdene vurdert med lineære regresjonsmodeller og /eller korrelasjonskoeffisienter.
I
in vitro
analyser for hver cellelinje, vi brukte fast effekt modellen for å vurdere sammenslutning av prosentandelen av celler med CA til BPA-konsentrasjonen som brukes til å behandle cellene og
post hoc
analyser justert for multiple sammenligninger med en Bonferroni test. Forankringsuavhengig vekst analysedataene ble analysert etter to-utvalg
t
-UNDERSØKELSER. Alle statistiske tester ble utført med et SAS 9.3-programvare (SAS, Cary, NC) pakke.
P
-verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Urin BPA nivå er assosiert med PCa og kan ha prognostisk verdi
Vi studerte 60 urologiske pasienter, 27 med PCa og 33 uten PCa. Gjennomsnittlig alder (± standardavvik [SD]) fra PCA pasienter var 69,7 ± 10,3 år (minst 56 år, maks. 87 år); de var eldre enn ikke-PCA pasienter, som var 62,8 ± 7,15 år (minst 46 år,.. max 77 år;
p
= 0,003). Serum PSA nivåer av PCa og ikke-PCA pasientene var ikke annerledes. Gleason score på 71% av PCA-pasientene var 6, og 7 i de andre. Deres baseline er oppsummert i tabell 1.
I alle fag (PCA og ikke-PCA) ble nivåene av urin BPA ikke assosiert med alder og serum PSA og korrelerte ikke med Gleason score på kreft og kreft -relaterte egenskaper i PCA fag (tabell 2). Pasienter med PCa hadde høyere nivåer av urin BPA (kreatin justert), med et geometrisk gjennomsnitt av 5,74 [95% CI; 2.63, 12.51] ug /g (gjennomsnitt ± SD av LnBPA på 1,75 ± 1,97), mens urin BPA nivåer av ikke-PCA pasientene hadde en geometrisk gjennomsnitt på 1,43 [95% KI; 0,70, 2,88] ug /g (gjennomsnitt ± SD av LnBPA på 0,35 ± 2,14;
p
= 0,012, fig 1A . 1D). Stratifiserte analyser viste at positiv sammenheng var signifikant bare blant de 30 urologiske pasienter yngre enn 65 (gjennomsnitt og median alder = 58 år, minimum alder = 46 år). I de yngre pasienter ( 65 år), den geometriske gjennomsnittet av urin BPA nivåer blant PCA pasienter var 8,08 [95% KI; 2.40, 27.15] ug /g (gjennomsnitt ± SD av LnBPA av 2,09 ± 1,71) kontra en geometrisk gjennomsnitt på 0,90 [95% KI; 0,36, 2,25] ug /g (gjennomsnitt ± SD av LnBPA av -0,11 ± 2,09) blant ikke-PCA pasienter (
p
= 0,006, Fig. 1B 1D). Videre analyser lineær regresjon av denne yngre gruppen viste en tendens mot en negativ sammenheng mellom urin BPA nivåer og serum PSA-konsentrasjonen i PCA pasienter (n = 10, r = -0,52,
p
= 0,10), men ingen slik trend i ikke-PCA pasienter (fig. 1C). Korrelasjonen nådde ikke signifikans på 5% nivå på grunn av den lille størrelsen på utvalget.
Urin BPA nivåer er assosiert med PCa. Log-transformerte BPA er referert til som LnBPA. Verdier i grafen er gjennomsnitt ± SD av LnBPA. (A) Urin BPA nivåene er høyere i PCA pasienter enn hos ikke-PCA pasienter. Midler for LnBPA = 1.75 ± 1.97 ved PCA (blå, n = 27) vs. 0,35 ± 2,14 i ikke-PCA (rød, n = 33),
p
= 0,012. (B) LnBPA ved PCA vs. LnBPA i ikke-PCA, stratifisert etter alder = 65. Urin BPA nivåene er signifikant høyere hos unge PCA pasienter enn i de respektive ikke-PCA pasienter kun i aldersgruppen 65 år gammel;
p
= 0,006. (C) Lineær regresjonsanalyse av serum PSA vs. LnBPA hos pasienter 65 år gammel bare (n = 30). Blå hele firkanter representerer PCA pasienter; røde invers-sirkler representerer ikke-PCA pasienter. Blå og røde heltrukne linjer representerer deres regresjonslinjer, henholdsvis. (D) Sammenligning av det geometriske gjennomsnittet av BPA i PCa og ikke-PCA-grupper. Det geometriske gjennomsnittet (Geo) er definert som den eksponentielle av gjennomsnittet av LnBPA. Verdier er geometrisk gjennomsnitt (95% KI) av BPA i enhet av mikrogram /g kreatinin.
Lave doser av BPA fremmet sentrosomen forsterkning (CA)
CA er ofte observert i humane svulster og er en viktig faktor som bidrar til kromosom ustabilitet [15], [27]. Avhengig av om cellen er i G1 eller S /G2 /M-fasen av cellesyklusen, normale celler viser en eller to centrosomes, respektivt. Vi har fastslått hvorvidt behandling av celler med BPA endret antall centrosomes, ved behandling av cellekulturer med økende konsentrasjoner av BPA (0,01 til 100 nM) (fig. 2 og 3). Ubehandlede celler som tjente som kontroller viste en forventet normal sentrosomen profil, i hvilken de fleste av cellene (mer enn 90%) inneholdt enten en eller to centrosomes (fig 3-I, panelene A, C, E, G, I, K. ). Den ubehandlede NPrEC hadde færrest celler med centrosomal forstyrrelser (1,7%), etterfulgt av c4-2 (2,9%), LNCaP (3,5%), 22Rv1 (4,9%), RWPE-1 (7,3%), og PC-3 ( 10,4%) (fig.2). I motsetning til dette alle cellelinjer som ble behandlet med BPA viste en økning (to til åtte ganger, tabell 3) i antall celler med tre eller flere centrosomes (fig. 2, fig. 3-I paneler B, D, F, H, J, L). Dose-respons-kurver for de to ikke-cancerøse cellelinjer, NPrEC og RWPE-en, og to PCA-cellelinjer, LnCap og 22Rv1, avslører en ikke-monoton (bifasisk) responsforhold, med den maksimale respons med 0,1 nM BPA ( fig. 2). På den annen side, de to andre PCA linjer, c4-2 og PC-3, viste en økende dose-responskurve som platåer ved den samme lave konsentrasjon av BPA (0,1 nM) (fig. 2). De udødelig ikke-kreft prostata epitelcellelinje NPrEC-1, viste den høyeste ganger endring (gjennomsnitt ± SD, 8,1 ± 2,4) i sentrosomen profil (tabell 3), noe som tyder på at dens sentrosomen duplisering syklus kan være mest følsomme for virkningene av lav -dose BPA på markedsføring av CA.
celle~~POS=TRUNC linjene~~POS=HEADCOMP NPrEC, RWPE1, LNCaP, c4-2, 22Rv1, og PC3 ble behandlet med medium som inneholdt 10% CSS pluss 0, 0,01 nM, 0,1 nM, en nM, 10 nM og 100 nM BPA i 72 timer. Celler ble fiksert med 100% kald metanol og immunofarget for centrosomes og kjerner. Antallet centrosomes per celle ble scoret av fluorescens mikroskopi. Resultatene er vist som et gjennomsnitt bestemmes fra fem separate eksperimenter. Den spredningsplott ble generert av prosentandelen av celler med unormalt antall centrosomes i respons til BPA. Analyser ble utført ved anvendelse av en fast effekt modell for hver cellelinje.
Post hoc
sammenligninger av midler ble justert ved hjelp av Bonferroni tester. Flippen endringen er prosentandelen av celler med unormale centrosomes på 0,1 nM BPA /andelen av celler med unormale centrosomes på 0 nM BPA.
(I) En økning i sentrosomen tall. Cellelinjene NPrEC, RWPE1, LnCap, c4-2, 22Rv1 og PC3 ble behandlet med medium inneholdende 10% CSS pluss 0 eller 0,1 nM BPA i 72 timer. Celler ble fiksert med 100% kald metanol og immunofarget for centrosomes (anti-γ-tubulin, rød) og kjerne (DAPI, blå). Cellene ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi. Piler peker på posisjonene til centrosomes og paneler til høyre viser forstørrede bilder av de angitte områdene. Scale bar, 10 mikrometer. (II) sentrosomen amplifikasjon i nærvær av BPA ikke skyldes centriole separasjon. RWPE-1-celler ble behandlet med 0,1 nM BPA i 3 dager. Celler ble fikset og immunostained for centrosomes (anti-γ-tubulin, rød), Sentrioler (anti-centrin, grønn), og kjernen (DAPI, blå). Piler peker på posisjonene til centrosomes. Paneler på høyre viser forstørret bilder av de angitte områder. Scale bar, gjorde 10 mikrometer.
Low-dose BPA ikke påvirke centriole splitting
Strukturelt den sentrosomen består av et par sylindriske strukturer kalt Sentrioler som fungerer som duplisere enheter. For å verifisere integriteten til centrosomes, immunostained vi celler for centrin, en viktig bestanddel av centriole sylinderen, slik visualisering av centriole paret i sentrosomen. Fig. 3 viser representative bilder for RWPE-1 celler. Hvert punkt detektert av antistoffet til y-tubulin (fig 3-II;. Panelene A og D) ble løst i et par prikker (som representerer en centriole par) åpenbart av antistoff mot centrin ved en høyere forstørrelse (Fig 3-II.; panelene B og E, paneler a, a «, d «, d»). Disse data indikerer således at centrosomes er intakte, inneholdende et par av Sentrioler. De sentrosomen profilene bestemmes ved å telle centrin signal var lik de som ble bestemt ved telling av γ-tubulin-signal (fig. 2). Resultater for LNCaP, c4-2, 22Rv1, og NPrEC cellene var lik. Derfor BPA hadde ingen effekt på sentrosomen separasjon eller centriole splitting.
Low-dose BPA forbedret MT aster formasjon
forankringen av MTS og deres påfølgende forlengelse for å danne radielle MT arrays (asters) er kritiske hendelser under interfase og også føre til dannelsen av den mitotiske spindel forbundet med normal funksjon sentrosomen [28]. RWPE-en prostata celler analysert for MT aster dannelse (Fig. 4). Cellene ble først behandlet med nocodazol på is helt depolimerisering interfase MTS; nocodazol ble deretter fjernet, og cellene ble inkubert i frisk varm medium for MT gjenvekst. Evnen som centrosomes til nucleate, anker, og langstrakte mts ble bestemt ved ko-farging for centrosomes (anti-γ-tubulin) og MTS (anti-α-tubulin). MT aster forming aktivitet av centrosomes ble vurdert i henhold til den tidligere etablerte protokollen [25]. Ubehandlede RWPE-1 celler viste ubetydelig aster formasjon. Etter akutt 2-h behandling med 0,1 nM BPA, ble korte asters sett 56% av cellene. Tre dager etter behandling med BPA (kronisk eksponering), ~37% celler viste asters (fig. 4A, 4B paneler g-i). Våre data indikerer således at BPA forbedrer MT aster formasjon.
microtubule aster-analysen ble utført to-immunostained for centrosomes (anti-γ-tubulin, rød) og MTS (anti-α-tubulin, grønn). Den centrosomal aster formasjon ble vurdert som positivt hvis centrosomes hadde en MT aster med mer enn 15 meter. Resultatene vist i (A) er gjennomsnittet ± standardfeil (SE) fra tre eksperimenter. For hvert eksperiment, 200 celler ble undersøkt. Betydning ble beregnet ved hjelp av t-test vs. 24:00. *
p
≤0.00002.
Kronisk BPA eksponering fremmer forankringsuavhengig vekst i c4-2 celler
Evnen til kronisk BPA eksponering for å transformere eller fremme ondartet vekst av NPrEC, RWPE-1, LNCaP og c4-2-celler ble bestemt ved en soft-agar-kolonidannelsesbestemmelsen. Cellene ble dyrket i medium med eller uten 0,1 nM BPA for 10-14 passasjer før de ble sådd på bløt agar. Kolonidannelse for NPrEC, RWPE-1, og LNCaP var mindre enn 2%, og eksponering for 0,1 nM BPA ikke endre effektiviteten av kolonidannelse. Imidlertid BPA-eksponerte c4-2-celler som produseres i det vesentlige mer, større og raskere voksende soft-agar kolonier (tabell 4, fig. 5). Den prosent effektivitet av kolonidannelse (gjennomsnitt ± SD) økte til 19,25 ± 7,05% med BPA behandling sammenlignet med 2,03 ± 0,40% i ueksponerte kontroller (
p
0,001). Kolonien diameter var 50-400 mikrometer i kontroller vs. 100-1,200 mikrometer i BPA-behandlede c4-2 celler.
Representative bilder av kolonier etter 2 uker med inkubasjon i agar. C4-2-celler i nærvær av 0,1 nM BPA dannes større kolonier (B, B «, 100-1200 um diameter) sammenlignet med de som var dyrket i fravær av BPA (A, A», 50 til 400 um diameter).
Diskusjoner
Bevis for at BPA eksponering bidrar til PCa ble hentet fra dyrestudier [29], [30], [31], [32] eller cellebasert [33 ], [34], [35], [36] modeller. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som gir foreløpige bevis for en sammenslutning av BPA eksponering med PCa i en klinisk setting. Våre funn i 60 urologiske pasienter viser at urin BPA nivå er en uavhengig prognostisk biomarkør av PCA som høyere urin BPA nivåer ble påvist i 27 PCA pasienter (geometrisk gjennomsnitt, 5,74 [95% CI, 2.63, 12.51] mikrogram /g kreatinin) sammenlignet med de i de 33 ikke-PCA pasienter (geometrisk middelverdi, 1,43 [95% CI; 0,70, 2,88] pg /g kreatinin) (
p
= 0,012). Deteksjonsgrensen for denne undersøkelsen var 0,05 ng /ml. Flere befolkningsstudier har nå etablert BPA som en allestedsnærværende miljø forurensning påvises i urin hos de fleste individer i amerikanske befolkninger. I den første store tverrsnittsstudie i USA involverer 2517 deltakerne i 2003-2004 National Health and Nutrition Examination Survey (nhanes) [7], ble BPA påvist i 93% av befolkningen på et geometrisk gjennomsnitt og en 95
persentil konsentrasjon på 2,6 ug /g og 11,2 ug /g henholdsvis,; deteksjonsgrensen var 0,4 ng /ml vs. 0,05 ng /ml i vår studie. En senere studie av 2,747 voksne deltakere i 2003-2006 nhanes [37] rapporterte et geometrisk gjennomsnitt på 2,05 mg /g kreatinin (25
th persentil: 01:18, 75
th persentil: 3,33); den nedre grensen for deteksjon var 0,36 ng /ml. Dermed geometrisk gjennomsnitt av urin BPA nivåer i PCA pasientene i studien var ~2-2.5 ganger høyere enn de geometriske hjelp av de i store amerikanske tverrsnittsstudier. I motsetning til den geometriske middelverdi i de ikke-PCA pasientene i denne studien var ~ 50% lavere enn den geometriske middel av de to populasjonsstudier.
A styrken av denne studien er vår bruk av fremgangsmåten anbefalt av Centers for Disease Control and Prevention involverer fast-fase ekstraksjon kombinert med isotopfortynning-HPLC-MS /MS for å måle total urin BPA i et referanselaboratorium. Videre har vi korrigert for variasjoner som skyldes faktorer som påvirker urin utvanning ved å uttrykke vår data i forhold til urin kreatinin. Til slutt hadde alle pasientene bekreftet ved biopsi, i stedet for selvrapportert, PCA. En potensiell begrensning av vår studie var at total urin BPA i våre pasienter ble målt bare en gang. Men ifølge dagens litteratur, total urin BPA konsentrasjoner (gratis pluss konjugerte) i spot prøver (måling engangs) er en pålitelig metode for å vurdere baseline eksponering fra alle kilder på tvers av tid når størrelsen på utvalget er tilstrekkelig stor [38]. Selv toksikokinetiske studier har vist at BPA og hovedmetabolitten, BPA-glukuronid, har heller kort halveringstid (~2.5 h) i blodet, og at de er raskt skilles ut med urinen [39], [40], tverrsnitts befolkningen studier har antydet vesentlig lengre halveringstider på grunn av næringsmidler eksponering, bioakkumulering i kroppsvev så som fett, og leverfunksjon, særlig de som er knyttet til glukuronisering av BPA [12], [39]. Tilstedeværelsen av høye BPA konsentrasjoner i urinen kan tyde på at livsstilsvaner disse pasientene kan tåle høyere nivåer av eksponering. I denne forbindelse, i en klinisk studie, BPA nivåer i urinprøver samlet inn på samme dag fra mannlige og kvinnelige partnere korrelert [41], som støtter den forutsetningen at lignende livsstilsvalg kan bestemme nivået av BPA eksponering. Videre er en fersk studie viste høyere innenfor person variasjon (mer enn 1-3 år) i BPA nivåer sammenlignet med den totale variasjonen i 80 kvinner [42]. Kollektivt, disse studiene fremheve betydningen av våre funn at en engangs prøvetaking av urin BPA korrelerer med PCa.
stratifisert analysene viste at sammenhengen mellom urin BPA nivåer og PCa er svært signifikant (
p
= 0.006) blant de 30 pasientene 65 år gammel (gjennomsnitt og median alder = 58, minimum alder = 46), men at denne foreningen ikke når signifikans mellom halvparten av pasientene 65 år (fig 1).. Disse funnene er spennende, men forvirrende. Tatt til pålydende, foreslår de at høyere BPA eksponering er assosiert med tidligere utbruddet av PCa. Imidlertid, på bakgrunn av teorien om utviklings omprogrammering av kreftrisiko [43], våre funn øke muligheten for tidlig-life omprogrammering av PCa hos mennesker. I rottestudier, nyfødte matet miljømessig relevante nivåer av BPA hadde en økt risiko for å utvikle prostatakreft svulster [29], [44].
