Abstract
microRNAs (mirnas) er rapportert å spille en avgjørende rolle i kreft invasjon og metastasering. Vår tidligere studie viste at MIR-375 ofte nedregulert i magekreft undertrykker celleproliferasjon ved å målrette Janus kinase 2 (JAK2). Her fant vi videre at uttrykket nivået av MIR-375 er betydelig redusert i magekreft med spredning vev sammenlignet med ikke-metastase kontroller. Ektopisk uttrykk for MIR-375 hemmer migrasjon og invasjon av magekreftceller delvis ved å målrette JAK2. Videre er MIR-375 uttrykk negativt regulert av metastase assosiert transkripsjonsfaktor sneglen, som direkte binder seg til den antatte formidler av MIR-375. Dessuten kan overekspresjon av snegle delvis å reversere hemningen av magekreft cellemigrering forårsaket av MIR-375. Samlet utgjør disse data tyder på at Mir-375 kan bli negativt regulert av sneglen og involvert i magekreft celle migrasjon og invasjon potensielt ved å målrette JAK2
Citation. Xu Y, Jin J, Liu Y, Huang Z, Deng Y, Du T, et al. (2014) Snail-regulert MiR-375 hemmer migrasjon og invasjon av Gastric kreftceller ved målretting JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10,1371 /journal.pone.0099516
Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 07.02.2014; Godkjent: 15 mai 2014; Publisert: 23.07.2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Scientific Foundation of China (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 og 31100975), Ministry of Science and Technology i Kina (2013CB945603, 2012CB945004 og (2011CBA01001), Ministry of Education of China (20110101110103 og (20130101120001), naturlig vitenskapelige Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 og Y2100106), 111 Project (B13026), de grunnleggende forskningsmidler for sentral universiteter (2014QNA7015) og Zhejiang Provincial Program for dyrking av høyt nivå Innovative Helse talenter. den funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er de mest forferdelige aspekter av kreft og har vært studert i mer enn 100 år [1], [2]. I magekreft, attributter den høye dødelighet hovedsakelig til forsinket diagnose på grunn av mangelen på spesifikke symptomer i tidlig stadium. Og metastasering er ansvarlig for magekreft relatert dødelighet [3], [4]. Migrasjon og invasjonen av kreftceller er viktige prosesser i løpet av kreft metastatisk prosesjon som består av en rekke beslektede trinn, inkludert spredning, avløsning, sirkulasjon, transport, arrest i organer, tilslutning til åreveggen, bloduttredelse, etablering av en mikromiljøet, og spredning i fjerntliggende organer. I magekreft, celler invasjon inn i det omgivende vev er et avgjørende tidlig trinn [3], [5]. Imidlertid er mekanismene for magekreftceller migrasjon, invasjon og metastase er ikke fullt ut forstått.
I de senere år, diverse molekyler, for eksempel, vekstfaktorer, cytokiner, ekstracellulære matriks-remodeling molekyler, og noen av transkripsjonsfaktorer slik som sneglen, Twist og ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], har blitt avslørt for å drive utviklingen av kreftceller migrasjon, invasjon og metastasering. I det siste har det blitt klart at i tillegg til avvik i protein-kodende gener, endringer i ikke-kodende gener kan også bidra til kreftceller migrasjon, invasjon og metastaser, for eksempel mirnas, som er en klasse av små enkelt-trådet ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer genekspresjon med stort potensial, og har vært implisert i regulering av kreftceller migrasjon, invasjon og metastase som aktivatorer eller suppressorer [12], [13], [14], [15], [16] . Hittil har en rekke mirnas blitt studert for å bli innblandet i magekreft metastaser progresjon, for eksempel, MIR-218, MIR-9, MIR-7, og MIR-146a [6], [17], [18], [19]. Vi har studert sammenhengen mellom spesifikke feilregulert miRNA og bestemt metastase skritt av magekreft, som vil gi innsikt i mulige mekanismer for magekreftceller migrasjon, invasjon og metastasering.
I vår forrige undersøkelse, MIR-375 var signifikant nedregulert i magekreft og hemmet mage kreftceller spredning ved å målrette JAK2 [20]. Det er interessant i denne studien, har vi funnet videre at ekspresjonsnivået av MIR-375 var enda lavere i magecancerprøver fra metastase-positive pasienter compaired med det fra metastase fri pasienter. Derfor foreslo vi at MIR-375 kan ha en kausal rolle i magekreft metastaser. Våre undersøkelser avdekket at ektopisk uttrykk for MIR-375 hemmet migrasjon og invasjon av magekreftceller også delvis ved å målrette JAK2. Vi videre bedt om å finne ut hvordan Mir-375 uttrykk ble regulert i magekreft. Resultatene indikerte at MIR-375 var et mål for den metastase tilhørende transkripsjonsfaktor sneglen og dens ekspresjon ble inverst korrelert med snegle i magekreft. Overekspresjon av Snail kan delvis reversere hemming av magekreft cellevandring forårsaket av MIR-375. Dermed våre funn viser at MIR-375 hemmer magekreftceller migrasjon og invasjon gjennom Snail /MIR-375 /JAK2 regulering sti.
Materialer og metoder
Kliniske prøver (Etikk Statement) og celle linjer
Kliniske magekreft prøver og deres pair-matchet ikke-maligne mage prøver fra 39 pasienter som gjennomgår magekreft reseksjon ble gitt av Sir Run Run Shaw Hospital (Hangzhou, Kina). Alle prøvene ble samlet inn med skriftlig samtykke fra pasientene som beskrevet tidligere [20]. Begge mage tumorvev og tilstøtende nontumorous mage vev som er samlet etter operasjonen var og delt inn i to deler. En ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart for videre bruk, ble en annen del som er lagret i formalin for patologi analyse. De som er involvert i vår studie ble pasientene delt inn i metastase-fri og metastase positiv grupper (9/30). Ventrikkelkreftstudien cellelinjer (AGS og MGC-803) og en ikke-ondartet mage epithelial cellelinje (GES-1) ble beskrevet tidligere [20].
RNA ekstraksjon
Total RNA fra mageprøver og cellelinjer ble ekstrahert med Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, TX, USA) etter produksjon protokoll.
kvantitativ real-time PCR-analyse
uttrykk for MIR-375 ble analysert ved hjelp av Taqman mikroRNA Analyser (Applied Biosystems, CA, USA) med spesifikke primere (P /N: 4373151, Applied Biosystems). Revers transkripsjonsreaksjon ble utført fra 10 ng av total-RNA ved hjelp av de løkke primere. Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført ved bruk av standard TAQMAN mikroRNA Analyser protokollen på ABI7500 Real-Time PCR Detection System. Den ΔΔCt fremgangsmåte for relativ kvantisering ble anvendt for å bestemme miRNA uttrykk. Den Ct er den fraksjonelle syklus nummer ved hvilken fluorescens av hver prøve passerer den faste terskel. Den ΔCt ble beregnet ved å trekke Ct av snRNA U6 (RNU6B, P /N: 4373381, Applied Biosystems) fra Ct av miRNA av interesse. Den ΔΔCt ble beregnet ved å subtrahere ΔCt av referanseprøven (paret ikke-ondartet vev etter kirurgiske prøver, normale vev og GES-1 celle for gastrisk kreft-cellelinjer) fra ΔCt av hver prøve. Brett endringen ble bestemt som to
-ΔΔCt.
Migrasjon og invasjon analysen
Celler ble transfektert med 20 nM pre-MIR-375 eller negativ kontroll ved hjelp Transfeksjon Agent (Ambion, TX, USA) ved å følge fremstilling protokoll i 24-brønners plater. 24 timer etter transfeksjon, ble Transwell migrasjon analysen og Matrigel invasjonen assay utført separat ved 24-brønnen Transwell inserts med 8 mikrometer porestørrelse (Corning Costar Corp). For Transwell migrasjon analysen, 2 × 10
4 AGS eller 3 × 10
4 MGC-803 celler suspendert i 100 ul tilsvarende kulturmedium uten bovint fosterserum (FBS) ble lastet inn i toppen kammer av transwell innsats med ikke belagte membran. For Matrigel invasjon assay, 5 x 10
4 AGS eller MGC-803-celler ble sådd ut i 100 ul serumfritt medium i det øvre Matrigel-belagte kammer i stedet. I begge analyser, ble den nederste kammer inneholdende 600 ul medium med 20% FBS. Cellene ble deretter tillatt å migreres eller invaderte i 12 timer ved 37 ° C. Cellene som migrerte eller invaderte inn i bunnkammeret ble fiksert, farget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:1000), visualisert under fasekontrastmikroskop og fotografert. Totalt antall migrerte eller invaderte celler ble talt av IPP (Bilde-Pro Plus 6.0) programvare. Alle forsøk ble uavhengig gjentas minst tre ganger.
Ripe sårheling assay
Celler ble transfektert som beskrevet tidligere og fikk vokse til konfluens. Cellene ble deretter dyrket i samme medium uten FBS i 12 timer og deretter skrapet med en pipettespiss. Wound områder ble merket og fotografert ved 0 h, 12 timer, 24 timer og 36 timer hhv. Frekvensen av celler migrasjon ble evaluert av både fotografering og kvantifisering migrert avstand av celler flyttet fra såret kanten mot midten ved å bruke IPP 6.0 system. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
konstruerer
For å produsere pGL3-375pro plasmid DNA-sekvensen som inneholder pri-MIR-375 (primær MIR-375) promoter ble forsterket ved RT-PCR hjelp primerne 5′-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3 «og 5′-AAGCTT ATCG ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3′, og deretter klonet inn i pGL3-basisvektor (Promega). For å konstruere plasmidet som uttrykker snegle i celler, ble den åpne leseramme (ORF) sekvens av snegle klonet i pattedyr-ekspresjonsvektoren pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) ved å bruke primerne 5»-ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 «og 5′-ATCG GGA TCC TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3». For ektopisk uttrykk for FLAG-merket JAK2 ble menneske JAK2 med kodende region klonet inn pCMV-Tag 2C vektor. For å konstruere plasmidet som uttrykker MIR-375 i pattedyrceller, sammenkoblede oligonukleotider basert på den primære sekvens av has-MIR-375 og dets flankerende regioner ble klonet i pattedyr-ekspresjonsvektoren pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA). Alle konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensering.
Luciferase-analyse
Førti tusen celler ble sådd i 24-brønners plater i 24 timer før transfeksjon. -Celler ble transfektert med enten pGL3-375pro eller pGL3-Basic vektor. PRL-TK vektor (Promega, WI, USA) som inneholder
Renilla
luciferase ble også kotransfektert som referanse kontroll. Firefly og
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid Assay (Promega) 24 timer etter transfeksjon. Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferaseaktivitet.
Statistiske analyser
Data er representert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE) av tre uavhengige eksperimenter. Relasjoner mellom uttrykket av MIR-375 og uttrykk for Snail mRNA ble utforsket av
Pearsons
korrelasjonskoeffisient, som ble beskrevet tidligere [20]. Elevens
t
-test og
X
2-testen ble utført for å bestemme statistisk signifikans.
P
0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
MiR-375 er dramatisk nedregulert i mage kreft celler og vev fra metastase-positive pasienter
.
for å finne ut om MIR-375 er forbundet med magekreft metastaser, må vi først oppdaget uttrykket nivået av MIR-375 i grunnskolen mage kreft vev fra metastase positiv og metastasefrie pasienter. Sammenlignet med prøver fra metastasefrie pasienter, uttrykket nivået av MIR-375 var nesten todelt reduksjon i vev fra metastase-positive pasienter (
P
0,05) (figur 1A). I tråd med dette resultatet var ekspresjonsnivået av MIR-375 i gastriske cellelinjer negativt forbundet med evnene til cellene migrering og invasjon. De metastatiske egenskaper mage epiteliale cellelinjer (GES-1, MGC-803, AGS) ble karakterisert. Som vist i figur 1C og 1D, migrering og invasjon evner av AGS-cellelinjen var større enn den for MGC-803 og GES-1-cellelinjer (
P
0,01). Omvendt, MIR-375-ekspresjon i AGS-celler var lavere enn for MGC-803 og GES-1-celler (
P
0,01) (figur 1B). I et ord, er MIR-375 nedregulert i mage kreft vev fra metastase-positive pasienter og mage kreft celler med større migrasjon og invasjon evner. Denne sammenhengen indikerer at MIR-375 kan ha en kausal rolle i magekreft metastaser.
uttrykk for MIR-375 ble undersøkt ved QRT-PCR. (A) Relative fold endringer (svulstvev /normalt vev, T /N) mellom magekreft prøver fra metastase fri eller -positive pasienter og deres tilstøtende ikke-maligne vev. Uttrykket nivået av MIR-375 var nesten todelt reduksjon i vev fra 30 metastase-positive pasienter enn det fra 9 metastasefrie pasienter,
* P
0,05. (B) Ekspresjonsnivået av MIR-375 i tre humane gastriske epitel-cellelinjer med forskjellige migrasjons og invasjons evner. Ekspresjonsnivået av MIR-375 i AGS-celler var lavere enn for MGC-803 og GES-1 celler.
** P
0,01. (C, D) Migrerings og invasjons evner av de tre gastriske epitel-cellelinjer ble målt med Transwell kamre. Bilder er representative felt av migrerte (C) eller (D) invaderende celler på membranen. Stolpediagrammer som representerer det gjennomsnittlige antall celler på undersiden av membranen ± SE. **
P
0,01 sammenlignet med ikke-maligne mage epiteliale cellelinje GES-en
Overuttrykte MIR-375 hemmer magekreftceller migrasjon og invasjon
.
for å undersøke hvilken rolle MIR-375 i magekreft metastaser, undersøkte vi effekten av MIR-375 overekspresjon på migrasjon og invasjon av AGS og MGC-803 mage kreft celler med lav endougenous uttrykk for MIR-375. Cellene ble transfektert med enten MIR-375 forløper (MIR-375) eller precursor-negative kontroll oligonukleotider (negativ) eller ingen av de ovennevnte (Mock). Den Transwell migrasjon analysen viste at overekspresjon av MIR-375 sterkt hemmet migrering av AGS (figur 2A, 2B) og MGC-803-celler (figur S1A, S1B). I samsvar med disse resultatene, scratch-sårtilheling analysen også avdekket at hastighetene av AGS (figur 2C, 2D) og MGC-803 celler (figur S1C, S1D) migrasjon mot såret området ble betydelig redusert etter at overekspresjon av MIR-375 . Vi videre ansatt Matrigel invasjonen analysen og funnet ut at overekspresjon av MIR-375 førte til en mer enn to-fold reduksjon i invasive egenskapene til AGS (figur 3A, 3B) og MGC-803 celler (figur 3C, 3D). Samlet indikerer disse resultater at overekspresjon av mir-375 er tilstrekkelig til å inhibere både overførings- og invasjonen evnene til mage kreftceller.
AGS-celler transfektert med MIR-375-forløper (MIR-375), negativ kontroll (negativ ) eller ingen av de ovennevnte (Mock) ble underkastet Transwell migrasjonsanalysen (A) og ripe sårheling analyse (C). (A) Representative felt av migrerte cellene på undersiden av membranen som ble fiksert og farget med DAPI. (B) Totalt antall migrerte celler på undersiden av membranen ble tellet ved IPP 6,0 programvare. (C) Et-cellemigrering til det sårede område ble fotografert ved mikroskopi ved 0 timer, 12 timer, 24 timer og 36 timer etter såret. De stiplede linjer angir de områder uten celler. (D) Graden av migrering ble undersøkt ved å måle avstanden fra cellene flyttet fra såret kanten mot senteret i 36 timer etter riper. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. Barer, 50 mikrometer. **
P
. 0,01
AGS og MGC-803 celler transfektert med pre-MIR-375 (MIR-375), negativ kontroll (negativ) eller ingen av ovenfor (Mock) var underlagt Matrigel invasjonen analyse. (A, C) Representative felt av cellene på den nederste kammer ved 12 timer etter invasjon ble vist. Skala barer, 50 mikrometer. (B, D) Det totale antall av fremmede celler på undersiden av membranen ble tellet ved IPP 6,0. Data er vist som gjennomsnitt ± SE fra tre uavhengige eksperimenter. **
P
. 0,01
MiR-375-regulerte JAK2 er involvert i reguleringen av magekreftceller migrasjon og invasjon
Vår tidligere studie har identifisert JAK2 som et nedstrøms mål av MIR-375 [20]. Her er vi interessert i å studere om JAK2 er involvert i reguleringen av magekreftceller migrasjon og invasjon. Vi ansatt vektorbasert RNAi teknikk for å utarme endogene JAK2 og fant at migrasjon og invasjon aktiviteter AGS (figur 4) og MGC-803 celler (Figur S2) ble begge hemmet sterkt. Samtidig studerte vi om JAK2 kunne motvirke hemming effekten av magekreftceller migrasjon og invasjon forårsaket av MIR-375. Celler ble ko-transfektert med MIR-375 forløper og enten JAK2 overekspresjon vektor (MIR-375 + JAK2) eller kontrollere tom vektor (MIR-375 + Vec). Overekspresjon av JAK2 uten tvil fremmet celler migrering og invasjon som vist i figur 4 og S2. Derfor, i tråd med vår hypotese, kan MIR-375 hemmer migrasjon og invasjon av magekreftceller delvis ved å målrette JAK2. Vi har fastslått at ytterligere JAK2 overekspresjon ikke har noen effekt på ekspresjonsnivået av MIR-375 som vist i figur S3. Men vi kan ikke utelukke at den feilregulering av MIR-375 forstyrrer andre mål som kreves for magekreftceller migrasjon og invasjon.
celler transfektert med de angitte vektorer eller oligonukleotider ble utsatt med Transwell migrasjon (A) eller Matrigel invasjon assay (C). Rednings eksperimenter for MIR-375 overekspresjon ble utført ved ektopisk uttrykk for JAK2 uten 3′-UTR i MIR-375-behandlede celler. (A, C) Representative felt av cellene på den nederste kammer ved 12 timer etter overføringen eller invasjon ble vist. Skala barer, 50 mikrometer. (B, D) Det totale antall migrerte eller invasive celler fra ni tilfeldig utvalgte felt ble tellet ved IPP 6.0. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Snail nedregulerer Mir-375 uttrykk
Resultatene ovenfor indikerer at MIR-375 kan bli målrettet ved visse transkripsjonsfaktorer som er assosiert med kreftinvasjon og metastase prosess. Naturligvis har vi fokus på hvordan Mir-375 uttrykk er regulert. Vi først funnet ut en samtalte DNA region oppstrøms for pri-MIR-375-genet, som ble rapportert å inneholde pri-MIR-375-genet promoter [21]. Vi deretter utført Consite program (https://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) og fant ut at det var seks bindingssteder av transkripsjonsfaktor Snail i DNA-regionen (figur 5A). DNA-region ble klonet inn pGL3-basisvektor (Promega) (pGL3-375pro) for å måle den promoter-aktivitet. I samsvar med dataene fra Walker gruppe [21], resultatene viste at denne DNA-regionen inneholder den pri-MIR-375-genpromoteren og er i stand til å dirigere ekspresjon luciferase (figur 5B). Luciferase aktivitet ble effektivt undertrykt når pGL3-375pro vektor ble ko-transfektert med Snail uttrykk vektor (Snail), men ikke ved samtidig transfektert med tom kontroll vektor (Mock) (figur 5C). Videre kan Snail overekspresjon redusere uttrykket nivået av MIR-375 med 46% (figur 5D). For å bestemme den kliniske relevansen av disse resultatene, vi videre korrelert uttrykket nivået av MIR-375 med sneglen mRNA nivå i de samme magekreftpasienter. Som vist på figur 5E, ble en tydelig invers korrelasjon funnet mellom ekspresjonsnivået av MIR-375 og sneglen mRNA (
P
0,05, r = -0,6). Derfor er disse observasjonene viser at sneglen er en potensiell oppstrøms regulator av Mir-375 uttrykk.
(A) Bioinformatikk analyse bruker Consite programmet avslørte potensielle bindingssteder, og fant at det var seks bindingssteder av transkripsjonsfaktor Snail i DNA regionen som inneholder pri-MIR-375 genet promoter. (B) Det antatte promotor-regionen til mir-375-genet ble ligert oppstrøms for ildflue luciferase reporter-genet i den promoter-mindre pGL3-basisvektor (pGL3-375pro), noe som resulterer i en 20-gangers økning i luciferaseaktivitet. (C) Luciferase-aktivitet av pGL3-375pro i celler transdusert med snegle-vektoren. Luciferaseaktivitet ble effektivt undertrykt når pGL3-375pro vektor ble ko-transfektert med sneglen ekspresjonsvektor. (D) Uttrykket nivået av MIR-375 i celler transduced av Snail overekspresjon vektor. Snail overekspresjon kan redusere uttrykket nivået av MIR-375 med 46%. (E) Inverse sammenheng mellom Mir-375 uttrykk og Snail mRNA nivå i grunnskolen mage kreft vev. En statistisk signifikant korrelasjon mellom MIR-375 og sneglen ble observert av
Pearsons
metoden med en korrelasjonskoeffisient på -0,6. **
P
. 0,01
Snail er involvert i reguleringen av magekreftceller migrasjon ved å målrette MIR-375
For ytterligere å belyse sammenhengen av MIR-375 og Snail, studerte vi om sneglen er involvert i reguleringen av magekreftceller migrasjon ved å målrette MIR-375. Vi ansatt vektorbasert teknikk for å oppregulere Snail uttrykk nivå og fant at migrasjon aktivitet av AGS celler (figur 6) ble forfremmet sterkt. Samtidig studerte vi om Snail kunne motvirke hemming effekten av magekreftceller migrasjon forårsaket av MIR-375. Celler ble ko-transfektert med MIR-375 overekspresjon vektor og Snail overekspresjon vektor (Snail + MIR-375). Overekspresjon av snegle uten tvil fremmet-cellemigrering og kan delvis motvirke inhiberingen effekt av magecancerceller forårsaket av migrering MIR-375 som vist i figur 6. Således, i samsvar med vår hypotese, kan snegle hemme migreringen av magekreftceller delvis ved å målrette MIR-375.
celler transfektert med de angitte vektorer ble utsatt med Transwell migrasjon analysen. (A) ble vist Representative felt av cellene på den nederste kammer ved 12 timer etter overføringen. Skala barer, 50 mikrometer. (B) Den gjennomsnittlige antallet migrerte celler fra ni tilfeldig utvalgte felt ble tellet ved IPP 6.0. **
P
. 0,01
Diskusjoner
mirnas har blitt rapportert å regulere tumor migrasjon, invasjon og metastase inkludert magekreft [6], [22 ]. MiR-375 ble tidligere demonstrert å spille en viktig rolle i magekreftceller proliferasjon [20], [23]. Men de regulatoriske mekanismer fortsatt uklare. I denne studien har vi ytterligere utforsket funksjon og potensielle mekanismer for MIR-375 i migrasjon og invasjon av mage kreftceller. Vi fant at overekspresjon av MIR-375 hemmet spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller delvis ved å målrette JAK2. Det har vært over et tiår siden JAK2 først ble klonet [24]. JAK2 blir uttrykt i nesten alle vev og forbundet med mange patologiske skrider frem. Selv om det er åpenbart at JAK2 fungerer som et onkogen i begge myeloproliferative sykdommer og noen faste tumorer [25], [26], [27], ingen direkte involvering av JAK2 i kreft migrasjon, har invasjon eller metastase blitt rapportert. Spennende, vår studie første vist at å banke ned JAK2 av RNAi hemmet migrasjons og invasjonen aktiviteter av magekreftceller lik som overekspresjon av MIR-375. Dessuten overekspresjon av JAK2 kan fremme migrasjon og invasjon av mage kreftceller. Således antok vi at JAK2 kan motvirke den hemmende effekt på celler migrering og invasjon forårsaket av MIR-375. Gitt den kritiske rollen MIR-375 og JAK2 som mester regulatorer i magekreftceller spredning, migrasjon og invasjon, både av dem har terapeutisk potensiale i magekreft behandling. Derfor gjenstår det å bli undersøkt om det er andre mål delta i MIR-375 mediert magemetastaser.
Av spesiell interesse, vi videre studert hvordan MIR-375 involvert i magekreftutvikling. Selv om det er et klart at DNA metylering og histon deacetylering er de mulige mekanismene som er involvert i nedregulering av MIR-375 i magekreft [23]. Mekanismene bak MIR-375 feilregulering i magekreft metastaser er fortsatt dårlig forstått. Det er mulighet for en transkripsjons blokkering av MIR-375-genekspresjon i denne prosessen. Her viser vi at den metastase assosiert transkripsjonsfaktor sneglen er en potensiell oppstrøms regulator av Mir-375 uttrykk. Sneglen er et DNA-bindende zink finger-protein, og er rapportert som transcriptional repressor [28]. Samle seg bevis viser at sneglen binder seg til E-bokser i formidler av E-cadherin og undertrykker sin transkripsjon å regulere tumorinvasjon utvikling [29]. Videre overekspresjon av snegle i krefttyper ble funnet å være assosiert med lymfeknutemetastase, tumor tilbakefall og prognose [30], [31], [32], [33], [34], [35]. I samsvar med andre rapporter, vår studie fant at sneglen mRNA er overuttrykt i mage kreft vev sammenlignet med sine tilstøtende ikke-maligne vev. Som promotor aktiviteten av MIR-375 kan bli undertrykket av sneglen og overekspresjon av snegle kunne redusere MIR-375 ekspresjonsnivået betydelig, har vi videre funnet en distinkt invers korrelasjon mellom ekspresjonsnivået av MIR-375 og nivået av sneglen mRNA i magekreft prøver. Snail er også funnet å være involvert i reguleringen av magekreftceller migrasjon ved å målrette MIR-375.
I konklusjonen, vi har identifisert at MIR-375 ble abnormt uttrykt i mage kreft vev fra metastase-positive pasienter eller magekreftceller med større migrering og invasjon aktiviteter sammenlignet med vev fra metastase fri pasienter eller ikke-invasiv gastrisk epitelcellelinje GES-1 henholdsvis. Overekspresjon av MIR-375 redusert magekreftceller migrasjon og invasjon aktiviteter i det minste delvis ved å målrette JAK2. Videre kan Snail være en oppstrøms regulator av MIR-375 som negativt regulerer uttrykket av MIR-375 og var involvert i reguleringen av magekreftceller migrasjon ved å målrette MIR-375. Sammen våre resultater tilveiebringe et ubeskrevet vei, i hvilken en transkripsjonsfaktor snegle regulerer ekspresjonen av MIR-375, som undertrykker den direkte mål JAK2, som fører til å inhibere migrering og invasjon av magekreftceller. Våre data tyder på at restaureringen av MIR-375 eller hemming av Snail eller JAK2 kan være nyttige terapeutiske strategier for magekreft behandling. Det vil sikkert være svært interessant å utforske videre potensialet effektiviteten av disse molekylene rettet mot MIR-375, JAK2 eller Snail i behandling av magekreft. Et annet interessant tema for fremtidig forskning vil være å identifisere andre mulige mål av MIR-375, og mer spesifikt, den mulige involvering av JAK2 i magekreft metastaser.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Ektopisk uttrykk for MIR-375 undertrykker migrasjon av MGC-803 celler. MGC-803-celler transfektert med MIR-375-forløper (MIR-375), negativ kontroll (negativ), eller ingen av de ovennevnte (Mock) ble underkastet Transwell migrasjonsanalysen (A) og ripe sårheling analyse (C). (A) Representative felt av invasive cellene på undersiden av membranen som ble fiksert og farget med DAPI. (B) Totalt antall migrerte celler på undersiden av membranen ble tellet ved IPP 6,0 programvare. (C) Et-cellemigrering til det sårede område ble fotografert ved mikroskopi ved 0 timer, 12 timer, 24 timer og 36 timer etter såret. De stiplede linjer angir de områder uten celler. (D) Graden av migrering ble undersøkt ved å måle avstanden fra cellene flyttet fra såret kanten mot senteret i 36 timer etter riper. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. Barer, 50 mikrometer. *
P
0,05, **
P
0,01
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099516.s001 plakater (TIF)
Figur S2 .
Overuttrykte JAK2 reverserer MIR-375 indusert hemming av MGC-803 celler migrasjon og invasjon. De celler transfektert med de angitte vektorer eller oligonukleotider ble underkastet med Transwell migrasjon (A) eller Matrigel invasjon assay (C). Rednings eksperimenter for MIR-375 overekspresjon ble utført ved ektopisk uttrykk for JAK2 uten 3′-UTR i MIR-375-behandlede celler. (A, C) Representative felt av cellene på den nederste kammer ved 12 timer etter overføringen eller invasjon ble vist. Skala barer, 50 mikrometer. (B, D) Det totale antall migrerte eller invasive celler fra ni tilfeldig utvalgte felt ble tellet ved IPP 6.0. *
P
0,05, **
P
0,01
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099516.s002 plakater (TIF)
Figur S3 .
JAK2 har ingen effekt på Mir-375 uttrykk. AGS og MGC-803-celler ble transfektert med vektor JAK2 overekspresjon eller kontroll vektor og utsatt for RT-PCR-analyse for ekspresjon nivået av MIR-375. Nivået av RNA U6 ble brukt som kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099516.s003 plakater (TIF)
