Abstract
Bakgrunn
Endret uttrykk for Mcl-1, en anti-apoptotiske medlem av familien Bcl-2, har blitt knyttet til utviklingen og resultatene av en rekke kreftformer. Vi har tidligere rapportert overekspresjon av Mcl-1 protein i humane orale kreftformer. Denne studien forsøkte å evaluere clinicopathological betydningen av uttrykket av tre kjente Mcl-1 isoformer i muntlig svulster og effekten av målretting Mcl-1L isoform på kjemosensitivitet orale kreftceller.
Metoder
uttrykket av Mcl-en isoforms- Mcl-1L, MCL-1S MCL-1ES ble analysert i 130 sammenkoblede orale svulster og 9 muntlige cellelinjer ved hjelp av kvantitativ real-time PCR protein av western blotting. MCL-1 mRNA nivåer ble korrelert med clinicopathological parametere og utfallet av orale kreftpasienter. Effekten av Mcl-1L shRNA eller Obatoclax (et lite molekyl Mcl-1-hemmer), i kombinasjon med cisplatin på kjemosensitivitet orale kreftceller ble også vurdert.
Resultater
Anti-apoptotiske Mcl -1L ble hovedsakelig uttrykt, over lave eller ikke målbare pro-apoptotiske MCL-1S og Mcl-1ES isoformer. MCL-1L transkripsjoner ble betydelig overuttrykt i alle kreftcellelinjer og i 64% muntlig svulster versus tilstøtende normaler (
P
0,02). I orale kreftpasienter, ble høy Mcl-1L uttrykk signifikant assosiert med node positivitet (
P
= 0,021), avansert tumorstørrelse (
P
= 0,013) og dårlig total overlevelse (
P
= 0,002). Multivariat analyse indikerte Mcl-1L å være en uavhengig prognostisk faktor for oral cancer (
P
= 0,037). MCL-1L shRNA knockdown eller dens hemming av Obatoclax i kombinasjon med cisplatin synergi redusert levedyktighet og vekst av muntlige kreftceller enn hver behandling alene.
Konklusjon
Våre studier tyder på at overekspresjon av MCL-1L er assosiert med dårlig prognose og chemoresistance i oral cancer. MCL-1L er en uavhengig prognostisk faktor og en potensiell terapeutisk mål i oral cancer
Citation. Palve V, Mallick S, Ghaisas G, Kannan S, Teni T (2014) Overuttrykte MCL-1L Splice varianten er assosiert med dårlig prognose og Chemoresistance i oral cancer. PLoS ONE 9 (11): e111927. doi: 10,1371 /journal.pone.0111927
Redaktør: Kithiganahalli N. Balaji, Indian Institute of Science, Bangalore, India
mottatt: 9 juni 2014; Godkjent: 09.10.2014; Publisert: 19.11.2014
Copyright: © 2014 Palve et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral kreft er den vanligste kreftsykdommen blant indiske menn og er hovedsakelig knyttet til tobakk-tygging vane utbredt i landet [1]. Til tross for nylige fremskritt i behandlingsmetoder som kirurgi, strålebehandling /kjemoterapi, har den langsiktige overlevelsen av muntlige kreftpasienter ikke endret seg vesentlig. De faktorer assosiert med dårlig prognose av kreft i munnhulen inkluderer, presentasjon på et avansert klinisk stadium ukontrollert lokoregionalt tilbakefall [2]. Derfor er det viktig å belyse mekanismene som er involvert i utvikling og progresjon av kreft i munnhulen og identifisere molekylære mål for bedre sykdom ledelse.
Oral kreft har gjentatte ganger blitt assosiert med apoptotisk feilregulering [3]. Pro og anti-apoptotiske medlemmer av BCL-2-familien er de viktigste regulatorer av celle apoptose og spiller en avgjørende rolle i å regulere celleoverlevelse [4]. MCL-1 (myelogen leukemi celle-1) er en viktig anti-apoptotiske medlem av Bcl-2-genfamilien, essensielt for utvikling, differensiering og proliferasjon [5]. Cellulær ekspresjon av Mcl-1 er strengt regulert gjennom flere transkripsjonelle og post-transkripsjonelle mekanismer [6]. Økt Mcl-1-ekspresjonen kan produsere moderat kortvarig levedyktighet forbedring i et bredt spekter av celletyper. MCL-en kan fremme celle overlevelse ved å undertrykke utgivelsen av cytokrom-c fra mitokondriene via heterodimerisation og nøytralisering av effektor pro-apoptotiske BH3-bare proteiner som Bak og Noxa [7]. Overekspresjon av Mcl-1 er blitt rapportert i en rekke forskjellige maligniteter, inkludert hematopoetisk, lymfoid og faste tumorer [8], [9]. Overekspresjon av Mcl-1 har vært forbundet med aggressive tumor egenskaper, motstand mot behandling og dårlig prognose i bryst, mage, ovarie livmorhalskreft [10] – [13]
Selv om Mcl-1 genet har blitt studert mye i multippel myelom og leukemi, er det sjeldne rapporter om Mcl-en analyse i hode- og halskreft.. Nyere studier fra vårt laboratorium har vist betydelig overekspresjon av Mcl-1 protein i orale kreftcellelinjer, premaligne lesjoner (OSF) og muntlig svulster ved immunhistokjemi [14]. Vi har også vist høy PCNA og Mcl-1-protein ekspresjon for å være assosiert med dårlig prognose i orale kreftpasienter behandlet med definitiv strålebehandling [15]. Imidlertid er situasjonen komplisert på grunn av eksistensen av tre distinkte MCL-1 isoformer med kontrasterende funksjoner, nemlig anti-apoptotiske Mcl-1L og pro-apoptotiske Mcl-1S Dr Rheinwald, Harvard Medical School, Boston [ ,,,0],24]); UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040 UPCI: SCC074 (Fra Dr. S Gollin, University of Pittsburgh, Pennsylvania) [25]; AW8507 AW13516 [26] ble brukt i studien. I tillegg en udødelig Fetal munnslimhinnen (FBM) [27] og en dysplastisk Oral keratinocyte (DOK) (fra Dr. Ken Parkinson, Queen Mary School of Medicine Dentistry, UK) [28] cellelinjer ble også brukt i studien. Cellene ble opprettholdt i MEM eller IMDM supplert med 10% FBS 1% standard antibiotikablandingen i 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C som tidligere beskrevet [17], [23], [29].
orale vev
Denne studien var godkjent av Institutional Review Board of Tata Memorial Centre og Sharad Pawar Dental College, India. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne. Behandling naive primære muntlige tumorprøver og deres tilstøtende normalt vev ble oppnådd fra 130 pasienter som gjennomgår kirurgi på hode og nakke Unit og fra ICMR National svulstvev Repository, Tata Memorial Centre, Mumbai, India. Betente orale vev (n = 20) ble hentet som sunne normalt vev fra pasienter som gjennomgår mindre dental kirurgisk prosedyre ved Institutt for oral patologi, Sharad Pawar Dental College, Wardha, India. Alle vev ble frosset umiddelbart i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil analyse. De clinicopathological karakteristikker av kohorten er illustrert i tabell 1.
RNA isolering og Real-time PCR
RNA fra cellepellets og vev ble hentet ved hjelp av TRI reagens (Sigma, USA) henhold til produsentens protokoll. RNA ble oppløst i DEPC-behandlet vann og forurensende DNA ble fjernet ved behandling DNaseI (Sigma, USA). RNA integritet ble analysert ved elektroforese og prøver ble konservert ved -80 ° C inntil analyse som tidligere beskrevet [17]. cDNA ble syntetisert med 500 ng total-RNA ved anvendelse av en First Strand cDNA syntese kit (MBI Fermentas, Canada) i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA ble deretter utsatt for kvantitativ real-time PCR ved hjelp Taqman universell PCR mester mix (ABI, 4.304.437) og MCL-1 isoform bestemt genuttrykk sonder (ABI,
Mcl-1L
: Hs00172036_m1;
Mcl -1S
: Hs00766187_m1
Mcl-1ES
: 4331348). Amplifikasjonen ble utført på ABI-7900HT sanntid PCR-system (Applied Biosystems, USA). GAPDH (ABI, Hs99999905_m1) ble benyttet som intern kontroll for å normalisere inter prøven variasjon i RNA-inngang forsterkning effektivitet. Alle amplifikasjonsreaksjoner ble utført in triplo, ved hjelp av DEPC behandlet vann som negative kontroller. Analyse av genekspresjon data ble utført ved hjelp av sammenlignings C
T fremgangsmåte for relative mengde [30].
Western blotting
Proteiner ble ekstrahert fra cellepelletene og tumorvev som beskrevet tidligere [14]. Kort fortalt ble 30 mg av frossen vev pulverisert i dødelig stampe med flytende nitrogen, oppløst i kjølt ProteoJET pattedyrcelle lysereagensen inneholder ProteoBlock proteasehemmer Cocktail (Fermentas, USA) og ultralydbehandlet på is. Vev eller cellelysatene ble fjernet ved sentrifugering ved 14 000 rpm ved 4 ° C. Proteinet estimering ble utført ved Bradford-metoden. De vev /cellelysatene (30-50 ug) ble løst i 12% SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner (Millipore, USA). Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i TBS i 2 timer. og inkubert over natten ved 4 ° C med muse-monoklonalt antistoff mot Mcl-1L (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Membranene ble strippet og reprobed med kanin polyklonale antistoff mot SS-aktin (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, USA) som lasting kontroll. Sekundære antistoffer som ble anvendt var Pepperrotperoksidase konjugert IgG (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Proteinene ble visualisert med forbedret chemiluminescence kit (GE Healthcare, US). Densitometry analyse av utviklet X-ray film ble utført ved hjelp av ImageJ programvare (NIH, Bethesda, MD).
Mcl-1L knockdown
uttrykk for Mcl-1L ble nedregulert ved kloning Mcl-1L shRNA kassett i pTRIPZ lentiviral systemet som per produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, USA). En ikke-målsøkende oligonukleotid-sekvens ble klonet som kontroll. De viruspartikler ble generert av co-trans rekombinante Mcl-1LshRNA-pTRIPZ konstruerer og emballasje plasmider i HEK293FT celler. Videre tre muntlige kreftcellelinjer nemlig AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040 ble omformet og stabil utvalget ble gjort ved hjelp puromycin seleksjonsmarkør. Uttrykket for shRNA ble indusert av doksycyklin og legge 72 timer. behandling, ble nivåene av Mcl-1L vurdert av QRT-PCR og Western blotting. Den spesifikke stanse av Mcl-1L ble bekreftet i tre uavhengige eksperimenter.
Celledød av PI-farging
PI (propidium jodid, Santa Cruz Biotechnology, California) farging ble utført for påvisning av celle død i de tre muntlige kreftcellelinjer (AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040) etter ulike behandlingskombinasjoner. I korthet ble cellene oppsamlet ved trypsinering, legge inn forskjellige behandlinger som beskrevet tidligere. Cellene ble vasket med PBS og 10 ul PI ble tilsatt. Cellene ble deretter inkubert i 2 minutter i mørket og analysert ved 488 nm, på et strømningscytometer (FACS kaliber, BD, USA).
MTT-analysen
Celler ble sådd ut ved 2000 celler per brønn i 96-brønners plater inneholdende DMEM med 10% FBS. Etter 24 timer ble cellene enten ubehandlet eller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin (0,025 til 10,0 ug /ml) (MP Biomedicals, India) eller Obatoclax (0, 1,0 til 10,0 nM) (Selleck chem USA). Den 50% inhiberende konsentrasjon (IC50) for Cisplatin og Obatoclax ble beregnet ut fra overlevelseskurver for alle cellelinjer. DMSO inneholdende medium tjente som den respektive styre. Etter inkubasjon av cellene med Obatoclax og /eller cisplatin i 72 timer ble cellevekst vurdert ved MTT-analysen, i henhold til produsentens instruksjoner (Sigma, USA). I korte trekk ble det brukte mediet fjernet og 50 ul av MTT-løsning (1 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 4 timer ved 37 ° C i CO
2 inkubator og formazankrystaller i levedyktige celler ble oppløst ved hjelp av dimetylsulfoksid (DMSO, 100 ul per brønn). Platen ble ristet på en orbital-rystemaskin i 10 minutter, og absorbansen ble målt ved 540 nm ved hjelp av referansebølgelengde på 690 nm på mikroplateleser (Spectramax, USA). Fem brønner ble brukt for hver medikamentkonsentrasjon, og forsøket ble gjentatt tre ganger. I et annet eksperiment, for å evaluere hvorvidt kombinasjon av behandlinger ville oppnå høyere veksthemming enn individuell behandling, ble orale kreftceller behandlet med doksycyklin til knockdown Mcl-1-ekspresjon eller Obatoclax (5 nM) til å inhibere Mcl-1-aktivitet, etterfulgt av Cisplatin ved en konsentrasjon lavere enn IC50 dose. Alle eksperimentene ble utført i tre paralleller
Trypan blå analyse Konfokalmikroskopi
Celler ble sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
4 per brønn. MCL-1-ekspresjon ble målrettet enten ved Doxycycline eller Obatoclax behandlinger, eller i kombinasjon med Cisplatin som beskrevet ovenfor. Celler ble trypsinzed etter 48 timer. for behandling og trypan blått (0,4%) farging ble utført. Antall levedyktige celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer og sammenlignet med ubehandlet kontroll. Dataene er vist fra tre uavhengige eksperimenter. Den avbildning av celler etter forskjellige behandlinger ble utført ved hjelp av en invertert mikroskop med LSM Image Browser 4.2-programvaren (Carl Zeiss, USA).
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av en lisensiert versjon av SPSS programvarepakken 15,0. Til statistisk korrelerer ekspresjon av Mcl-1-isoformer med clinicopathological parametere, ble dataene dikotomisert i to grupper nemlig: den Mcl-en isoform høye og lave expressers expressers. Til sammenligning mener uttrykket av Mcl-1 isoformer i friske normale og histologisk normale tilstøtende vev ble benyttet. Korrelasjonen mellom clinicopathological parametre (kjønn, alder, språk, vaner, størrelse, node, metastase, gjentakelse) ble gjort ved hjelp av Chi Square test (χ
2). Kaplan Meier-kurver ble anvendt for å vurdere total overlevelse og forskjellen i gruppene ble beregnet med Log Rank test av betydning. De prediktive parametre i univariate analysen ble innlemmet i multivariat analyse ved hjelp av Cox proporsjonal hazard test for å identifisere hvilke faktorer som var uavhengige prediktorer for overlevelse. Den Graphpad Prism5 programmet ble brukt til å plotte grafer og data for to lignende ulike grupper ble statistisk analysert ved Student-t-test Mann Whitney test. Variasjonen mellom gruppe middel ble analysert ved en-veis analyse av varians (ANOVA) test. Dataene er angitt som middelverdi ± SD. Den p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk for Mcl-1 isoformer i muntlig cellelinjer
QRT-PCR-analyse avdekket, dominerende høy uttrykk for. anti-apoptotisk Mcl-1L isoform over svak eller ikke målbare pro-apoptotiske MCL-1S og Mcl-1ES uttrykk i alle de muntlige cellelinjer (Figure1a). Mcl-1L ble funnet å være betydelig overuttrykt ved både mRNA protein nivå i alle de sju orale kreftcellelinjer (SCC25, UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040, UPCI: SCC074, QLL1, AW8507 og AW13516) sammenlignet med udødelig normal FBM dysplastiske DOK cellelinje (figur 1)
(a) Uttrykk for Mcl-1L MCL-1S mRNA i muntlig cellelinjer; MCL-1 ES nivåene var umulig å oppdage (* P≤0.03) (b) MCL-1L protein uttrykk i muntlige cellelinjer.
Uttrykk av MCL-1 isoformer i orale vev
QRT-PCR-analyse viste signifikant (p≤0.02) høy ekspresjon av Mcl-1L mRNA i 64% (84/130) av orale tumorer med forskjellige sekundære områder sammenlignet med normalt vev (figur 2a). Videre ble det observert noen signifikant forskjell mellom Mcl-1L uttrykk fra svulster i forskjellige sekundære områder. Den relative uttrykk for Mcl-1L isoform ble ~ 5 ganger høyere enn MCL-1S og -10 ganger høyere for å Mcl-1ES isoform i orale svulster (data ikke vist). Tilsvarende western blot analyse viste høy Mcl-1L protein uttrykk i muntlige tumorer versus tilstøtende normalt vev (figur 2b).
(a) Uttrykk for Mcl-1L mRNA i normale kontra muntlig svulster i forskjellige undersider (* P≤0.02); (B) Mcl-1L protein uttrykk i tilstøtende normalt versus svulster
Korrelasjonen av Mcl-1 uttrykk med clinicopathological parametere og amp.; Utfallet
Univariat analyse viste signifikant sammenheng med høy Mcl-1L uttrykk med node positivitet (p = 0,021) og avanserte svulster (p = 0,013). Imidlertid ble ikke observert noen signifikant sammenheng mellom uttrykk for Mcl-1 isoformer og kjønn, alder, tobakk /alkoholvaner, primære stedet differensiering av muntlige kreftpasienter (tabell 2). Spesielt lav uttrykk for pro-apoptotiske MCL-1S isoform viste en trend mot positiv betydning med dårlig differensierte svulster (p = 0,053).
Korrelasjonen av Mcl-1 uttrykk med total overlevelse
Kaplan-Meier overlevelseskurver av lave og høye expressers av Mcl-1L viste en statistisk signifikant forskjell (p = 0,002). Pasienter som uttrykker høy anti-apoptotiske Mcl-1L utstilt dårlig total overlevelse versus de som uttrykker lav Mcl-1L (figur 3a). Omvendt, pasienter som uttrykker høye pro-apoptotiske MCL-1S viste signifikant bedre total overlevelse (p = 0,051) sammenlignet med de som har lave MCL-1S (figur 3b). Spesielt den relative forholdet mellom Mcl-1L /MCL-1S viste også en positiv korrelasjon (p = 0,006) med de fattige total overlevelse av orale kreftpasienter (figur 3c). I tillegg er univariate analysen også avdekket dårlig total overlevelse i node positiv versus node negative orale kreftpasienter (p = 0,003). De andre parametere som alder, tobakk /alkoholvaner og differensiering ikke signifikant påvirke total overlevelse av disse pasientene.
(ac) Kaplan-Meier-estimatene for total overlevelse av orale kreftpasienter med lav eller høy uttrykk for Mcl- 1 isoformer; (D) multivariat analyse av muntlige kreftpasienter
Multivariatanalyse
Blant de to isoformer (Mcl-1L MCL-1S). Analysert, theMcl-1L uttrykk påvirket den generelle overlevelse av orale kreftpasienter. MCL-1L variabel, som hadde dukket opp betydelig i univariate analysen, ble undersøkt ved hjelp av Cox regresjonsmodellen i multivariat analyse (Figure3d). Pasienter som uttrykker høy Mcl-1L utstilt kortere total overlevelse og 3.2 tids høyere risiko for dårlig overlevelse sammenlignet med de som uttrykker lav Mcl-1L (p = 0,037). Dette innebærer at Mcl-1L er en uavhengig prognostisk faktor for kreft i munnhulen
shRNA mediert nedregulering av Mcl-1L
I de tre muntlige kreftcellelinjer (AW8507, UPCI. SCC040 UPCI: SCC029B) transduced med Mcl-1L shRNA-pTRIPZ lentiviral partikler, MCL-1L uttrykk ble vellykket downregulated post doksycyklin behandling. Kontrollbrønnene representerer celler uten doksycyklin behandling. Den kvantitative sanntid PCR og western blot-analyse bekreftet at nedregulering av Mcl-1L både mRNA og proteinnivåer, i alle de tre cancercellelinjer (figur 4). Men nivåene av Mcl-1S MCL-1ES forble uforandret (data ikke vist)
(a b). ShRNA mediert nedregulering av MCL-1L mRNA protein i AW8507, UPCI: SCC040 SCCC29B oral kreftceller sammenlignet med kontroll
Effekt av Mcl-1L knockdown . /Eller cisplatin i celledød
induksjon av celledød ble analysert ved farging etterfulgt PI ved FACS-analyse i de tre muntlige kreftcellelinjer (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) etter forskjellige behandlinger som beskrevet tidligere. Den shRNA mediert knockdown av rikelig uttrykt Mcl-1L isoform eller Cisplatin behandling avslørte induksjon av celledød i alle cellelinjer. Den celledød indusert i AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC29B, post Mcl-1L knockdown var 31% (SD 2,5), 27% (SD 1.5) og 24% (SD 3.5) eller post Cisplatin behandling var 50% (SD 2,1), 42% (SD 2.7), og henholdsvis 46% (SD 3,1). Videre shRNA-mediert Mcl-1L knockdown, etterfulgt av behandling med cisplatin viste sammen 78% (SD 1,2), 71% (SD 1,8) og 82% (SD 2,0) av celledød respektivt. De kombinerte behandlinger av Mcl-1L knockdown og Cisplatin viste en statistisk signifikant (p 0,05) forskjell i induksjon av celledød i forhold til enten behandlinger alene (figur 5b), for derved, noe som tyder på en synergistisk effekt av de kombinerte behandlinger på celledød.
Effekt av BH3 mimetiske Obatoclax og /eller Cisplatin på celle levedyktighet og vekst
Figur 6a illustrerer representative konfokal mikroskopi bilder av AW8507 celler behandlet med cisplatin og /eller Obatoclax. Interessant den kombinerte behandlinger av Obatoclax Cisplatin viste økt celledød i forhold til de enkelte behandlinger. I tillegg ble det trypan blått fargestoff utelukkelse analyse utføres for å bestemme den virkning på cellelevedyktighet i orale kreftcellelinjer (AW8507, UPCI: SCC040 Cisplatin viste en 3-7 gangers reduksjon i celleviabilitet i forhold til de individuelle behandlinger (figur 6b). Videre er MTT proliferasjonsanalyse også viste en signifikant (p 0,05) reduksjon i cellevekst (2-4 ganger) etter at kombinert behandling med cisplatin og Obatoclax i forhold til enten behandlinger alene (figur 6C) derved, noe som tyder på en synergistisk effekt av . kombinert behandling på celle levedyktighet og vekst av muntlige kreftceller
(a) Confocal mikroskopiske representative bilder av AW8507 celler poste forskjellige behandlinger; (B) Vurdering av prosent cellelevedyktigheten av muntlige kreftceller poste ulike behandlinger av trypan blått fargestoff utelukkelse analysen (* P 0,05, kontra individuelle behandlinger); (C) Analyse av proliferasjon av oral cancer-celler etter forskjellige behandlinger av MTT-analysen. (* P 0,05, kontra individuelle behandlinger).
Diskusjoner
I denne studien, vurderte vi uttrykk for Mcl-1 isoformer (Mcl-1L, MCL-1S Mcl-1ES) i orale svulster versus normalt vev, for å avgjøre om de ville være nyttig som prognostiske markører i orale kreftpasienter. Så langt er begrenset informasjon om rollen Mcl-1 isoformer i patogenesen av kreft i munnhulen. Så vidt vi vet, er dette den første studien som korrelerer uttrykket av de tre Mcl-1 isoformer med clinicopathological parametere av muntlige kreftpasienter. Vår studie viser betydelig høy uttrykk for anti-apoptotisk Mcl-1L i flertallet av munnhulekreft cellelinjer og svulster (64%) sammenlignet med tilsvarende normale. Vi viser også at høy Mcl-1L uttrykk var signifikant assosiert med dårlig resultat av orale kreftpasienter. Videre, målretting Mcl-1L av shRNA eller Obatoclax i kombinasjon med cisplatin kan synergi indusere celledød i orale kreftceller. Derfor kan overekspresjon av Mcl-1L er en viktig mekanisme for å bidra til munnhulekreft celle overlevelse, og dermed bidra i utvikling og progresjon av kreft i munnhulen.
Den feilregulering av apoptose regulere gener har blitt rapportert å spille en nøkkel rolle i utvikling og progresjon av flere menneskelige kreftformer. Den anti-apoptotiske Mcl-1 er et viktig medlem av apoptose regulere Bcl-2-familien og har vist seg å være overuttrykt i mange krefttyper inkludert, cervical, eggstokk, bukspyttkjertel, hepatocellulær, ikke-småcellet lungekarsinom, testikkelkreft bakterie cellekreft og melanomer [8]. Spesielt denne undersøkelsen for første gang demonstrerer overekspresjon av Mcl-1L spleisevariant i orale kreftcellelinjer og amp; Flertallet av orale svulster versus normalt vev. Det er bare en eneste rapport som analyserer Mcl-1 isoformer amp; deres kliniske betydning så langt i klare cellenyre karsinom [31]. I motsetning til våre resultater, denne studien er imidlertid påvist en sammenheng med lav Mcl-1L uttrykk med aggressive fenotyper i klare cellenyre karsinomer. Dessuten er det ingen informasjon tilgjengelig på uttrykk for Mcl-1 isoformer i orale kreftformer. I denne studien, korrelasjonen av Mcl-1 isoformer og clinicopathological parametere av muntlige kreftpasienter, viste signifikant sammenheng med Mcl-1L spleisevariant med avansert tumorstørrelse (p = 0,013) og lymfeknute positivitet (p = 0,021). Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av lav versus høy expressers av Mcl-1L mRNA viste at høy Mcl-1L uttrykk var signifikant assosiert med dårlig total overlevelse (p = 0,002). Som observert i denne studien for Mcl-1 isoformer, har høy Mcl-1 protein uttrykk og sin tilknytning til dårlig prognose blitt demonstrert i cervical, mage, lunge og eggstokkreft [11] – [13], [32]. Men en tidligere studie fra vår lab kunne ikke finne den ovenfor forening ved Mcl-1 protein nivå [14]. Denne studien ble gjennomført for å belyse uttrykket profilen til Mcl-1 isoformer i muntlig cellelinjer og en stor kohort av svulster, som viste foreningen av anti-apoptotisk Mcl-1L uttrykk med prognosen i oral cancer. Dette er den første undersøkelsen, som viser korrelasjonen av Mcl-1L spleisevariant med utfallet av orale kreftpasienter og Mcl-1L som en uavhengig prognostisk markør for oral cancer.
Mcl-1 er strengt regulert på transkripsjons, starte transkripsjons og translasjonsforskning nivåer [6] og den eksakte mekanismen for Mcl-en overekspresjon i orale kreftformer er ikke kjent. Den pro-apoptotiske Mcl-1S MCL-1ES isoformene ble uttrykt ved lave eller ikke målbare nivåer sammenlignet med overveiende uttrykt MCL-1L og korrelerte ikke med clinicopathological parametre av muntlige kreftpasienter. Spesielt de korte pro-apoptotiske MCL-1S binder bare å Mcl-1L muligens nøytralisere sin anti-apoptotisk funksjon [33]. Videre kan den nylig identifiserte pro-apoptotiske Mcl-1ES isoform også binde og nøytralisere anti-apoptotiske funksjon av full lengde Mcl-1L isoform, selv om det er uttrykt ved svært lave eller upåvisbare nivåer. Vi analyserte derfor de relative prosenter av MCL-1L /MCL-1S isoformer, som viste en signifikant positiv korrelasjon med de fattige total overlevelse av pasienter, noe som tyder på at den lave uttrykk for MCL-1S MCL-1ES i orale kreftformer er muligens ikke tilstrekkelig til å fullstendig nøytralisere den høye uttrykk for anti-apoptotisk MCL-1L isoform. Så langt vi kjenner til er dette den første studien kvantifisere uttrykk for de tre Mcl-1 isoformer og deres korrelasjon med clinicopathological parametere og amp; Utfallet av orale kreftpasienter. Våre funn støttes også av de tidligere rapportene i mage og livmorhalskreft som viser sammenhengen mellom høy Mcl-1 protein uttrykk med tumor størrelse, histologisk grad, spredning til lymfeknuter, metastaser dårlig klinisk utfall [11], [34]. Videre har prognostisk signifikans av høy Mcl-1-protein ekspresjon også blitt demonstrert i bryst, ovarie, ikke-småcellet lungekreft og flere hematologiske maligniteter [10], [13], [35].
MCL -1 er overuttrykt i en rekke humane maligniteter og foreslått å være et potensielt terapeutisk mål [8]. MCL-en overekspresjon synes også å være en viktig faktor i motstanden av ulike krefttyper til konvensjonelle behandlinger, inkludert stråling og kjemoterapi. Den nedregulering av Mcl-1 har vist seg å sensibilisere neuroblastom-celler til cytotoksisk kjemoterapi og motstandsdyktig melanomceller til Fas-mediert apoptose [36], [37]. Videre, i vår nåværende studie, shRNA mediert nedregulering av Mcl-1L har vist seg å chemosensitize orale kreftceller (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) til Cisplatin indikerer en avgjørende rolle for Mcl-en i behandlingsresistens i muntlig kreft . Studier rettet mot Mcl-en via antisense terapi har også vist seg å chemosensitize leverkreft celler
in vitro product: [38], [39]. Selv om vår studie indikerer utarming av Mcl-1L uttrykk fra 90% til 20% av shRNA (Fig.4A) en minimal celledød (25%) ble observert. Dette tyder på at i tillegg Mcl-en kan det være andre faktorer som bidrar i overlevelse av celler legge Cisplatin behandling. Flere andre studier har også rapportert proteiner som Survivin [40], Oct4 Nanog [41], MUC4 [42], sekretær Kin17 [43], etc. spiller en viktig rolle i chemoresistance av muntlige plateepitel karsinom celler. Men dette er den første studien korrelere sammenslutning av Mcl-1L spleise variant med chemoresistance av kreft i munnhulen.
Nyere studier fra vårt laboratorium har vist en rolle for Mcl-1L isoform i radioresistance av muntlige plateepitel karsinom celler og som en prognostisk faktor i forutsigelse av sykdomsfri overlevelse av orale kreftpasienter behandlet med definitiv strålebehandling. [15], [17]. Derfor synes utarming av Mcl-en for å være en forutsetning for radio /chemo bevisstkreftceller som overuttrykker Mcl-1 protein, for å fremme apoptose. Flere forsøk er blitt gjort for å målrette anti-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner, inkludert Mcl-1 i tumorer ved hjelp av et stort antall inhibitorer. Blant disse har den mest lovende hemmer, en BH3 mimetiske ABT-737 ikke klarte å overvinne motstand på grunn av Mcl-1 overekspresjon. Videre studier indikerer at Mcl-en nedregulering alene kan potensere ABT-737 dødelighet i leukemiceller [44]. I foreliggende studie et pan Bcl-2 små-molekyl-inhibitor, Obatoclax (GX15-070) som er kjent for å antagonisere Mcl-1 og overvinne Mcl-1 mediert resistens mot apoptose ble anvendt [21]. Obatoclax har vist seg å beslaglegge anti-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner og oppregulerer ekspresjonen av Puma, Noxa Bim som ytterligere indusert apoptose i neoplastiske mastceller [45].
