PLoS ONE: Effekter av internalisert gull nanopartikler med hensyn til cytotoksisitet og Invasion Aktiviteten i Lung Cancer Cells

Abstract

Effekten av gull nanopartikler på lungekreft celler er ennå ikke klart. I denne studien undersøkte vi cytotoksisitet og celle invasjon aktivitet av lungekreftceller etter behandling med gull nanopartikler og viste at små gullnanopartikler kan endocytose av lungekreftceller, og at de lette celle invasjon. Vekst av A549-celler ble hemmet etter behandling med 5-nm gull-nanopartikler, men celle invasjon økes. Endocytose gull nanopartikler (størrelse, 10 nm) særlig fremmet invasjonen aktiviteten til 95D celler. Alle disse effekter av gull nanopartikler ble ikke observert etter behandling med større partikler (20 og 40 nm). Den forbedrede invasjon aktivitet kan være forbundet med den økte ekspresjon av matriksmetalloproteinase 9 og intercellulært adhesjonsmolekyl-1. I denne studien, erholdt vi bevis for effekten av gull nanopartikler på lungekreft celle invasjon aktivitet in vitro. Videre matriks-metalloproteinase-9 og intercellulært adhesjonsmolekyl-1, viktige modulatorer av celle invasjon, ble funnet å være regulert av gull nanopartikler. Disse data viser også at svarene på A549 og 95D celler til gull nanopartikler har en bemerkelsesverdig forhold til sine unike størrelse avhengige fysio egenskaper. Derfor denne studien gir et nytt perspektiv for cellebiologi forskning på nanomedisin

Citation. Liu Z, Wu Y, Guo Z, Liu Y, Shen Y, Zhou P, et al. (2014) Effekter av internalisert gull nanopartikler med hensyn til cytotoksisitet og Invasion Aktiviteten i lungekreft celler. PLoS ONE 9 (6): e99175. doi: 10,1371 /journal.pone.0099175

Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA

mottatt: 28 februar 2014; Godkjent: 12 mai 2014; Publisert: 05.06.2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra Science Foundation National of China (No.81270428 og 81300999). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Tidligere studier identifisert som gull nanopartikler (Au-NPS) viser liten cytotoksisitet til tross for deres effektiv opptak i menneskeceller ved endocytose [1], [2], noe som gjør dem egnede kandidater for nanomedisin. I tillegg til deres biokompatibilitet, det faktum at de er lette å syntetisere, karakterisere, og overflaten modifisere bidratt til å tiltrekke seg mye oppmerksomhet i forskjellige biomedisinske anvendelser. Au-NPs har blitt undersøkt som stoffet levering kjøretøy og fototermiske terapi og molekylære tenkelig verktøy for potensielle biodiagnosis [3], [4]. Nanopartikkel-baserte terapeutiske strategier for kreftbehandling er i hovedsak basert på levering av kjemoterapeutika, for å indusere apoptose [5]. De viktigste grunnene for å bruke nanopartikler som bærere for terapeutisk levering er å aktivere multimodale funksjoner, for eksempel bildebehandling eller spesifikk målretting, for å øke vev permeabilitet og stedsspesifikke narkotika opphopning, og for å redusere bivirkninger til friskt vev [6]. Foreløpig er Au-NPs brukes i ulike biomedisinske applikasjoner: Ikke bare kan de brukes som stillas for stadig mer potente kreft narkotika levering, men de kan også tjene som transfeksjon agenter for selektiv genterapi og som iboende antineoplastiske midler [7] – [9] . Dreaden et al. [8] har vist at målrettede Au-NPS er i stand til å endre cellesyklusen, inkludert celledeling, signalisering, og proliferasjon.

Til tross for den utbredte anvendelse av Au-NPS, en klar forståelse av hvordan biologiske systemer reagere til nanopartikler er viktig, og karakterisering av de unike størrelsesavhengige fysiokjemiske egenskaper av Au-NPS er en kritisk komponent. En tidligere studie viste at overflaten størrelsen av Au-NPS spiller en stor rolle i deres terapeutiske effekt [10]. Au-NPs av meget liten diameter (mindre enn 2 nm) kan trenge inn i celler og cellulære avdelinger slik som kjernen og være ekstremt toksiske [11]. For eksempel, ble det funnet at sfæriske Au-NPS med en diameter på 1,4 nm induserer nekrose og mitokondriell skade i forskjellige cellelinjer via oksidativt stress-mekanismer, som kan være forbundet med deres velkjente katalytiske aktivitet ved at størrelsen [12]. En fersk studie av Connor et al. [1] rapporterte at betydelige mengder av større Au-NPS (for eksempel 18 nm i diameter) trenge inn i cellene, men at disse Au-NPS er ikke i seg selv giftig for menneskeceller. Chithrani et al. [13] studert forholdet mellom Au-NPS og HeLa-celler, og foreslo at Au-NPS angitt i cellene via reseptor-mediert endocytose ved en terskel størrelse på ca 50 nm. Siden det ikke er noen sikkerhetsforskrifter ennå, effekten av Au-NPs på celler fortsatt krever videre studier.

invasjon og metastasering er viktige patologiske trekk ved kreftceller. Invasive kapasitet er den viktigste egenskap som skiller godartet fra maligne lesjoner [14]. Faktisk kan invasive kreftceller flykte kirurgisk reseksjon og være ansvarlig for svulst tilbakefall. Til tross for fremskritt innen kirurgi, kjemoterapi og radioterapi, er tilbakefall nesten uunngåelig i nærvær av en aggressiv metastatisk spredning [15], [16]. Prosessen med invasjon og metastase omfatter celleproliferasjon, dissosiasjon fra de primære lesjoner, degradering, og gjennomtrengning inn i den ekstracellulære matriks (ECM), migrasjon i blod eller lymfe strøm, adhesjon og vekst i et sekundært organ [17]. Tidligere rapporter har beskrevet det intercellulære adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og matriks-metalloproteinase-9 (MMP-9) som er involvert i kreft celleadhesjon, invasjon, migrering og, som bidrar til kreftmetastase [18]. Disse faktorene har vært ansett som prognostiske biomarkører for lungekreft progresjon [19]. Videre studier på effekten av Au-NPs på uttrykket av disse proteinene er nødvendige.

Siden cytotoksisitet ikke kan være den eneste effekten at nanopartikler kan indusere, i denne studien, har vi fokusert på celleproliferasjon, invasjon aktivitet, og proteinekspresjon, som alle kan påvirkes av nærværet av Au-NPs. For å undersøke betydningen av partikkelstørrelse i nanomedisin, valgte vi fire forskjellige Au-NPS størrelser (dvs. 5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm) for en grundig analyse av dette systemet.

Til slutt valgte vi å studere disse effektene på to humane lungekreftcellelinjer (dvs. A549 og 95D) fordi lungekreft er en stor ondartet svulst i Kina og har økende forekomst i de fleste byer. I 2010 var det ca 600 000 nye tilfeller av lungekreft i Kina [20]. Satsene for sykelighet fortsette å stige raskt på grunn av den alvorlige luftforurensning [21]; imidlertid, er kunnskapen om de biologiske interaksjoner og responser fra Au-NPS med humane lungekreftceller svært begrenset. Videre, for å få en grunnleggende forståelse av prosessene som er involvert, følte vi at det var viktig å først fokusere på effekter av nanopartikler på enkeltkreftceller, i stedet for på hele organer, der andre faktorer kan komplisere tolkningen av resultatene. Derfor er målet med denne forskningen var å gi et viktig grunnlag for å søke Au-NPs i lungekreft terapi.

Metoder

Utarbeidelse og karakterisering av Citrate-capped Au-NPs

Au-NPS (5 nm og 10 nm) ble syntetisert ved anvendelse av et garvesyre /citrat-oppløsning, hvori garvesyre spiller rollen som et reduksjonsmiddel og citrat virker som et stabiliseringsmiddel [22]. For hver syntese, ble de første to løsninger er nødvendige for: (a) 1 ml 1% (w /v) HAuCl

4-løsning, som ble tilsatt til 79 ml vann; og (b) en blanding bestående av 4 ml 1% (w /v) citrat-oppløsning, 0,7 ml eller 0,1 ml 1% garvesyre, og vann (for å oppnå et sluttvolum på 20 ml). Både (a) og (b) oppløsningene ble oppvarmet til 60 ° C i vannbad og deretter ble oppløsning (b) ble tilsatt til (a) under konstant omrøring. Den resulterende Au-NPS ble avkjølt til romtemperatur (RT) for etterfølgende eksperimenter.

Syntese av 20-nm og 40 nm-Au-NPS stabilisert ved citrat-ioner ble utført ved bruk av den klassiske citrat reduksjonsmetoden [23] . For hver syntese, 100 ml 0,01% HAuCl

4 løsning ble oppvarmet til koking. Valgte volumer (4,5 ml eller 1,0 ml) av 1% citrat-løsning ble tilsatt, og koking ble fortsatt inntil fargen på oppløsningen ble til rubinrød. Den citrate-capped Au-NPs Løsningen ble avkjølt naturlig til RT

morfologi av Au-NPs ble observert ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. (TEM, JEM-2100EX, JEOL, Tokyo, Japan) ved akselererende spenning på 200 kV. Ultraviolet-synlig (UV-Vis) spektra ble kjøpt med en Shimadzu UV-3600 spektrofotometer i størrelsesorden 300-1100 nm.

Cell Culture

A549 og 95D celler (Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alt fra GIBCO, Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO

2. -Celler ble for-dyrket i medium over natten og deretter behandlet enten med eller uten 50 ug /ml Au-NPS løsning i ytterligere 48 timer. Cellene ble høstet ved trypsin-ethylenediamintetraacetic syre (EDTA; GIBCO, Invitrogen) løsgjøring ved den logaritmiske vekstfase og sentrifugert. Cellene ble deretter resuspendert i DMEM med 10% FBS for subkultur eller andre anvendelser.

opptak og TEM Studies

Opptaket av Au-NPS ble også undersøkt ved hjelp av TEM. Før eksponering for Au-NPS ble A549 celler og 95D-celler sådd ut i en konsentrasjon på 1 x 10

6 celler pr tallerken på en 100 mm kulturskål (Corning, USA) inneholdende vekstmedium og inkubert ved 37 ° C med 5% CO

2 i 24 timer. AU-NPs ble deretter tilsatt. Etter eksponering for Au-NPS i 48 timer ble cellene fiksert i 3,7% (v /v) paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 20 minutter ved RT. Deretter celler ble fremstilt for TEM-analyse som følger: cellene ble fiksert i 1% (w /v) osmiumtetroksid i 2 timer, dehydrert i en gradert serie av 30%, 50%, 70%, 80% og 90% etanol og behandlet tre ganger med 100% etanol i 15 minutter hver. Prøvene ble deretter innleiret i en blanding av harpiks i propylenoksyd polymerisert ved 80 ° C. Ultratynne seksjoner for TEM ble fremstilt ved anvendelse av en diamantkniv, og prøvene ble analysert ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop.

celleviabilitet Assay

A549 og 95D-celler ble sådd ut i 96-brønners plater på et lavt konfluens (2000 celler /brønn), fikk feste seg natten over, og behandlet med Au-NPS (kontroll, 5 nm, 10 nm, 20 nm og 40 nm). Etter 24 timer, 48 timer og 72 timer, en cellelevedyktighet assayreagens (Celletelling kit-8, Kaiji, Nanjing) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1, 2, 3 og 4 timer, henholdsvis. Absorbans verdier ved 450 nm ble registrert ved anvendelse av en mikroplateleser (BioRad) og cellelevedyktigheten uttrykt som en prosent av den ubehandlede kontroll (100% av cellenes levedyktighet). Virkningen av Au-NPS med forskjellige størrelser på levedyktigheten av cellene ble målt i tre eksemplarer, og forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.

Apoptose Påvisning av Annexin V /propidium jodid (PI) Beising

celler i logaritmisk fase ble sådd ut på en 6-brønners kulturplate i en tetthet på 1 x 10

5-celler per brønn, inkubert ved 37 ° C i en CO

2 inkubator, og tillates å feste natten. Etter behandling med Au-NPs (kontroll, 5 nm, 10 nm, 20 nm, og 40 nm) i 48 timer, apoptose og nekrose ble analysert med Annexin V-PI (BD Biosciences) apoptose deteksjon kit følge produsentens instruksjoner. Prøvene ble analysert ved hjelp av en BD FACS CantoII instrument (BD Biosciences).

Flowcytometri analyse av cellesyklusen

Cellene ble høstet ved bruk av 0,25% trypsin med 1 mM EDTA løsning og feste for 12 timer i 70% etanol ved 4 ° C. De fikserte celler ble deretter sentrifugert ved 3000 opm i 15 minutter for å fjerne etanolen grundig. Cellene ble deretter vasket to ganger med 3 ml PBS, resuspendert i 1 ml PI farging løsning, og inkubert i 15 min ved RT. Den fargeløsning som bestod av 20 pg /ml PI og 0,2 mg /ml RNase A i PBS. Prøvene ble deretter analysert ved hjelp av en BD FACS CantoII instrument (BD Biosciences). Tjue tusen hendelser ble samlet inn fra hver prøve. Prosentene av celler i G0 /G1, S og G2 /M faser av cellesyklusen ble bestemt ved hjelp av ModFit programvare (BD Biosciences).

Invasion analysen

For invasjonen assay , hengende celledyrkningsinnsatser (8,0 um porestørrelse) ble forhåndsbelagt med 50 ug /ml Matrigel (BD Biosciences) på den øvre overflaten. -Celler ble for-dyrket i medium over natten og deretter behandlet enten med eller uten 50 ug /ml Au-NPS løsning for ytterligere 48 timer, deretter ble cellene høstet og 2,5 x 10

5-celler ble sådd ut i 200 ul DMEM supplert med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i toppen av kammeret. Bunnen av brønnen ble tilsatt med 750 ul DMEM inneholdende 5% FBS. Invasjonen Analysen ble utført i 48 timer i en cellekulturinkubator.

Cellene ble fiksert ved å erstatte kulturmediet i bunnen og toppen av kammeret sammen med 4% formaldehyd oppløst i PBS. Etter fiksering i 15 min ved RT, ble kamrene skylt i PBS og farget med 0,2% krystallfiolett i 10 min. Etter vasking av kamrene fem ganger ved å dyppe dem i et stort begerglass fylt med dH

2o, ble cellene (nå blå i farge) på toppen av Matrigel membranen fjernet ved hjelp av flere Q-tips. Celler ble fjernet inntil det ikke mer blått fargestoff kunne fjernes med Q-tips. Deretter ble cellene som var igjen var de som hadde invadert og hadde nådd bunnen av membranen.

Vi har også kvantifisert invasjons celler ved hjelp av QCM ™ 24-brønners celle Invasion fluorometrisk analyse (Millipore) med ECMatrix-belagte setter inn, i henhold til produsentens instruksjoner. Denne analyse gir et effektivt system for kvantitativ evaluering av invasjon av tumorceller gjennom en basalmembran modell. A549 og 95D-celler ble dyrket i 2 dager i fullstendig medium, enten i fravær (kontroll) eller i nærvær av Au-NPS (5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm). Ved slutten av behandlingen, ble cellene suspendert i serumfritt medium og utsådd (2,5 x 10

5 celler /250 pl) på hver pakning av et multiwall plate kammer. Serum (10%) ble tilsatt til serumfritt medium i det nedre kammer som kjemotiltrekkende. Etter en 48-timers inkubasjonsperiode ved 37 ° C, ble ikke-invaderende celler fjernet fra toppen av innsatsene. Deretter ble innsatser plassert i en ren brønn inneholdende et forvarmet celle løsgjøring løsning og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Innsatsene ble fjernet fra brønnene, og lyseringsbuffer /farvestoff-løsningen ble tilsatt til mediet som inneholder de frittliggende cellene i 15 minutter ved RT. Blandingene ble deretter lese med en fluorescens plateleser (Bio-Tek, Synergy HT) med en 480/520 nm filter sett. Fluorescens målingene ble rapportert som relativ fluorescens enhet (RFU) verdier.

Kvantitativ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR) Analyser

Total RNA ble isolert fra ubehandlet og Au-NPs behandlet A549 og 95D celler ved hjelp Trizol Reagens (Invitrogen Livet Technology). Revers transkripsjon (RT) Reaksjonen ble utført ved anvendelse av 1 pg av total RNA, som ble reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av oligo dT-primer, og deretter qRT- PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn Mix (Applied Bio-systems). Primersekvensene som benyttes for PCR var som følger: ICAM-1, forover ACACTAGGCCACGCATCTGAT, revers AGCATACCCAATAGGCAGCAA; MMP-9, fremover GGCTACGTGACCTATGACATCCT, reverse TCCTCCCTTTCCTCCAGAACA; glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), frem GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC, omvendt GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT. PCR ble utført ved 95 ° C i 30 s, ved 60 ° C i 30 s, og 1 min ved 70 ° C i 35 sykluser. Den komparative Ct-metoden ble brukt for å beregne den relative overflod av mRNA og resultatene for mål-gen-ekspresjon ble sammenlignet med dem for GAPDH ekspresjon. Resultatene ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter.

Protein kvantitative bestemmelser

MMP9 protein ekspresjon i supernatanten og cellelysatet ble målt ved bruk av en MMP panel 2 på magnetiske kuler kit basert på den Luminex teknologi. Kort fortalt ble MMP9 fange antistoffer (Millipore) konjugert til Luminex perler (perler region 33). MMP9 gjenkjenning antistoffer (Millipore) ble konjugert til biotin gjennom tilpasset tjeneste levert av Millipore. Celler ble lysert i lyseringsbuffer MILLIPLEX MAP (Millipore) og fortynnet med tilsvarende volum av MAP MILLIPLEX celleanalysebuffer (Millipore). MMP9 fange antistoffkuler ble fortynnet i 25 ul MILLIPLEX MAP celleanalysebuffer og tilsatt til en magnetisk plate (Millipore). Deretter ble 25 ul av den fortynnede cellelysat eller cellekultur-supernatant overført til hver brønn i den faste plate og inkubert i 2 timer ved romtemperatur med risting. Etter inkuberingen, ble kulene vasket to ganger med vaskebuffer, og 25 ul av deteksjon-antistoffer ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1 time ved romtemperatur med risting. Etter dette ble 25 ul av MILLIPLEX MAP streptavidin-fykoerytrin (Millipore) tilsatt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med risting. Til slutt ble slire væske tilsatt etter vask, og signalet ble lest ved hjelp av en Luminex FLEXMAP 3D ™.

Western Blot analyse

For western blot analyse, A549 og 95D celler ble sådd ut på kulturflasker og behandlet med Au-NPs (kontroll, 5 nm, 10 nm, 20 nm, og 40 nm). Etter 48 timer, 5-10 x 10

6-celler ble høstet og lysert med iskald lyseringsbuffer. Like mengder protein ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og elektroforetisk overført på polyvinyliden-fluorid-membraner. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk i 2 timer og inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-MMP-9-antistoffet (1:1000, Abcam), kanin-anti-ICAM-1-antistoff (1:500, Cell Signaling), eller mus anti-GAPDH antistoff (1:10000, Abmart). GAPDH ble brukt som husholdningsgenet kontroll og uttrykket nivåer av MMP9 og ICAM-1 ble normalisert i forhold til GAPDH. Proteinene ble påvist med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus sekundære antistoffer og visualisert med Chemiluminescence reagenser som følger med ECL-kit (BioRad, USA). Immunreaktive bånd ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens og kvantifisert ved hjelp av en ChemiDoc XRS molekylær imager (BioRad).

Statistical Analysis

GraphPad Prism 5 statistisk analyse programvare ble brukt i alle statistiske analyser utført i denne studien ( GraphPad Prism versjon 5.00 for Windows, GraphPad Software, San Diego California, USA). Alle resultater har blitt presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistiske sammenligninger ble utført ved anvendelse av enveis variansanalyse (ANOVA), fulgt av Dunnetts

t

-test for sammenligning med kontrollgruppen. Forskjeller ble betraktet som signifikant ved P . 0,05

Resultater

Syntese og karakterisering av Au-NPs

Au-NPs syntetisert med citrate reduksjon metoden uten ytterligere modifikasjon ble brukt for alle studiene og blir her referert til som ikke-modifiserte nanopartikler. For å bestemme forholdet mellom størrelsen og den biologiske funksjon av nanopartikler, anvendte vi Au-NPS av fire forskjellige størrelser (5, 10, 20, eller 40 nm) og karakterisert dem med TEM og UV-Vis-spekteret (figur 1). Partiklene ble vist å være alle kuler med smale størrelsesfordelinger. De høye elektron tettheter av Au-NPS såvel som homogeniteten av deres form og størrelse gjort dem meget tydelig under transmisjons-elektronmikroskop.

Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder av Au-NPS med diameter på (A ) 5 nm, (B) 10 nm, (C) 20 nm, eller (D) 40 nm. De innfellinger viser bilder med høy oppløsning. Skala barer, 20 nm og 100 nm (som merket). E: UV-vis spektra av Au-NPs med 5-nm, 10 nm, 20 nm, og 40-nm diameter

internalisering av Au-NPs

. for å undersøke hvorvidt Au-NPS med ulike størrelser krysset cellemembranen og hvor de befinner seg, ble A549 og 95D-celler inkubert i 48 timer i nærvær av Au-NPS (5, 10, 20, og 40 nm) i fullstendig cellekulturmedium . Figur 2 viser intern av forskjellig størrelse Au-NPs. Mesteparten av partiklene ble funnet i membranbundne vesikler eller i det perinukleære region i cellene.

TEM-bilder ved 200-nm forstørrelse som viser internalisering av 25 ug /ml Au-NPS med ulike størrelser (5 nm , 10 nm, 20 nm og 40 nm) til (A) og A549 (B) 95D celler etter 48 timers behandling.

Måling av Cytotoksisitet av Au-NPS

Neste, søkte vi å bestemme effekten av disse Au-NPS på proliferasjonen av to forskjellige lungecancercellelinjer, A549 og 95D celler. Den cytotoksiske effekt på fire Au-NPS med forskjellige diametre ble testet ved samme konsentrasjon. Våre funn viste at 5-nm Au-NPS spille en sentral rolle i å hemme proliferasjon av både A549 og 95D-celler ved 48 timer og 72 timer (figur 3A og B). Au-NPs med diameter på 20 nm og 40 nm utviste bemerkelsesverdig effekt ved 24 timer og utover for å fremme proliferasjonen av A549-celler, mens ingen fremming ble observert i 95D celler (figur 3A og B). Au-NPs med en diameter på 10 nm hadde ingen virkning på proliferasjonen av begge A549 og 95D celler. Inhibering av celleproliferasjon, økt celle apoptose, og arrestere celler i G0 /G1 syklus manifestert cytotoksisiteten av 5-nm Au-NPs. Det var ingen signifikant forskjell (P 0,05) i apoptose og cellesyklusfordeling for 10-nm, 20 nm og 40 nm-AuNP-behandlede grupper (fig 3C-H). Disse resultatene indikerer at små Au-NPs kan være cytotoksisk og at diameteren er ikke den eneste faktoren som påvirker celleproliferasjon og samspillet mellom Au-NPs, som er en svært kompleks prosess som garanterer videre etterforskning.

Celle linjer A549 (A) og 95D (B) i den logaritmiske vekstfase ble utsatt for Au-NPS i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Cellelevedyktigheten ble beregnet som prosentandel av levedyktige celler sammenlignet med ubehandlede kontroller. Hvert resultat representerer den midlere levedyktighet ± standard avvik (SD) av tre uavhengige eksperimenter. Apoptose (C-D) og cellesyklus (E-H) analyser av A549 og 95D celler behandlet med forskjellig størrelse Au-NPs. Feilfelt angir SD verdier fra fire uavhengige forsøk. * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001

Invasion analysen

En basalmembran modellen ble brukt for å vurdere invasjonen aktiviteten til cellene. Resultatene er presentert i figur 4. Resultatene indikerte at celle invasjon ble fremmet signifikant etter behandling av A549 med 5-nm Au-NPS og av 95D-celler med 10 nm-Au-NPS (P 0,05). I motsetning til dette ble cellene internalis med 20 nm eller 40 nm-Au-NPS ikke signifikant påvirket av invasjon aktivitet (figur 4). Disse resultatene klart antydet at inntrengningseffekter var partikkel-størrelse-og celletype-avhengig.

Bildene som representerer A549-celler (A) og 95D celler (B) som har krysset porene av Matrigel invasjon kammeret og tilhørende fluorescens intensitet resultater. * P 0,05. Feilfelt angir SD verdier fra tre uavhengige eksperimenter.

Effekter av Au-NPs på uttrykk for MMP9 og ICAM-1 i lungekreftceller

For å få en dypere forståelse av dette fenomen, QRT-PCR ble utført for å måle mRNA-nivåene av MMP9 og ICAM-1 etter behandling med Au-NPs. Resultatene viste at 5 nm og 10 nm-Au-NPS særlig lette mRNA-ekspresjonen av ICAM-1 i begge cellelinjene (figurene 5B og D, P 0,05). MRNA-ekspresjon av MMP9 økt i 5 nm-Au-NPS-behandlede A549-celler og 10 nm-Au-NPS-behandlede 95D-celler, men forskjellene var ikke statistisk signifikant (figur 5A og C). Vi utførte deretter en Luminex basert eksperiment i nærvær av MMP9 magnetiske kuler for å kvantifisere protein ekspresjon av MMP9 både i cellelysatet og kultursupernatant. Våre resultater viste at behandling med 5-nm Au-NPs markert økte nivåer av MMP9 i lysat av A549 celler, mens MMP9 ble særlig oppregulert i lysat av 95D celler ved behandling med 10 nm-Au-NPS (figur 6 A- B). Sammenligningene med nivået av MMP9 i supernatanten viste at det var ingen signifikant forskjell (P 0,05). Mellom Au-NP-behandlet og Au-NP-ubehandlet A549 og 95D (figur 6 C-D)

Resultater av QRT-PCR for (A-B) og A549 (C-D) 95D celler etter 48 timer inkubasjon med 5-nm, 10 nm, 20 nm eller 40 nm-Au-NPs. * P 0,05, *** P 0,001 vs. kontroll. Feilstolper indikerer SD-verdier fra tre uavhengige eksperimenter.

Kvantifisering av ekspresjonen av MMP9 i cellelysatet (A-B), og supernatanten (C-D) av A549 og 95D-celler, henholdsvis

ble utført ved hjelp av Luminex teknologi. * P 0,05. Feilfelt angir SD verdier fra tre uavhengige eksperimenter.

Videre har vi undersøkt protein uttrykk ved hjelp av western blotting. Resultatene viste at MMP9 og ICAM-1 ble oppregulert i lysatene av A549 og 95D-celler etter behandling med 5 nm og 10 nm-Au-NPS, henholdsvis (figur 7); i motsetning til dette ble MMP9 og ICAM-1 nedregulert ved behandling med 40-nm Au-NPS, noe som tyder på at Au-NPS partikkelstørrelse spiller en viktig rolle i reguleringen av disse proteinene. Disse resultatene gitt bevis for at MMP9 og ICAM-1, viktige modulatorer av celle invasjon, kan reguleres ved Au-NPs.

Representative resultater som viser effekten av Au-NPS behandling på ekspresjon av MMP9 og ICAM- 1 i A549 (A) og 95D (B) celler. Relativ tetthet bånd av MMP9 og ICAM-1 til middelverdien for kontrollgruppen (C-H). Verdier er uttrykt som relativ intensitet normalisert til GAPDH intensitet og er gitt som middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001 vs. kontroll

Diskusjoner

Den lave produksjonskostnader og forholdsvis lett å syntetisere Au-NPs gjøre dem mulig for fremtidige biomedisinske applikasjoner. Men med overgangen av Au-NPs fra stasjonære maskiner til klinikken, er mye mer kunnskap om de grunnleggende interaksjoner mellom nanoskala materialer og biologiske systemer. Biosikkerhet og biokompatibilitet av Au-NPs er viktige spørsmål som skal demonstreres før slike materialer er brukt til biologiske systemer. I likhet med mange andre rapporter [24], [25], i denne studien, Au-NPS ble lett tatt opp av A549 og 95D-celler via ikke-spesifikk endocytose og lokalisert innenfor cytoplasmatiske vesikler. I denne studien demonstrerte vi at små Au-NPS med en diameter på 5 nm oppviser høy effektivitet ved inhibering av proliferasjon, fremme apoptose, og stanse cellesyklus ved G0 /G1 fase i to kreftcellelinjer lunge. I kontrast, ble ingen åpenbar cytotoksisitet observert i 10 nm, 20 nm, og 40 nm Au-NP-behandlede celler, som er i overensstemmelse med resultatene fra andre forskningsmiljøer. Tidligere studier har vist at overflatestørrelsen og ikke overflateladning, spiller en stor rolle i den terapeutiske effekten av Au-NPS [26]. Vanligvis Au-NPs for levering av legemidler og fototermiske behandlingsprogrammer har dimensjoner som er større enn 10 nm, noe som er tilstrekkelig til å senke overflate reaktivitet og dermed gjøre gull kjerner godartet. En størrelse større enn 6-8 nm er også optimal for utelukker renal utskillelse og dermed svekke sirkulasjonshalveringstiden [27]. Uventet, Våre resultater viste at proliferasjonen av A549-celler ble fremmet etter 24-timers behandling med Au-NPS på 20 nm eller 40 nm i diameter. Dette fenomenet ble ikke observert i 95D celler. Videre har 5-nm Au-NPS og 10 nm betydelig fremmet invasjonen av A549 og 95D-celler, henholdsvis, mens den invasive egenskaper ikke ble påvirket i nærvær av partikler med en størrelse større enn 20 nm. Disse resultatene støtter det syn at AU-NPs ikke universelt målrette alle celletyper [28]. Coulter et al. fant at gjenlevende brøkdel for Au-NPs-behandlede celler viste en sterk avhengighet av celletype sammenlignet med ubehandlede celler i forhold til bestrålingssensibilisering potensiell [24].

I vår studie, den forbedrede invasjonen muligheten var ledsaget av en bemerkelsesverdig oppregulering av ICAM-1 og MMP-9 uttrykk. Invasion gjennom ECM er et viktig skritt i tumormetastaser. Kreftceller innlede invasjonen ved å følge og spre langs karveggen. Matriks-metalloproteinaser er endopeptidaser som er i stand til å degradere ECM komponenter, noe som gjør at kreftceller for å få tilgang til vaskulaturen og lymfatiske systemer [29] – [31]. MMP-9 har tiltrukket seg mye oppmerksomhet for sin evne til å nedbryte type IV kollagen, den grunnleggende komponent av basalmembran [32]. Øket ekspresjon av MMP-9 i pasienter med ikke-småcellet lungecancer har blitt rapportert [33], [34]; Derfor midler undertrykker ekspresjon av MMP’er kunne hemme kreftcellemigrering og invasjon [35]. ICAM-1 er en representativ adhesjonsmolekyl som er involvert i interaksjonen mellom tumorceller, endotel og ECM. Høy uttrykk for ICAM-1 i humane lungekreftprøver ble korrelert med en større risiko for avansert kreft (trinn III og IV). A549 /ICAM-1 celler ble vist å indusere in vitro celle invasjon og in vivo tumormetastase [36]. Denissenko et al. observerte at ICAM-1 nedregulering på mRNA og proteinnivåer førte til sterk undertrykkelse av human bryst celle invasjon gjennom en Matrigel matrisen [37]. Vi fant at 5-nm og 10 nm Au-NPs effektivt fremmet uttrykk for ICAM-1 og MMP9 i A549 og 95D celler, henholdsvis som delvis forklarte forsterket virkningen av partikler på kreftcelle invasjon.

siden oppregulering virkningene av Au-NPS for MMP-9 og ICAM-1-ekspresjonen i A549 og 95D celle foreslo at små partikler kan ha evnen til å lette invasjonen av lungekreftceller, ytterligere in vivo studier er nødvendig for å bekrefte mekanismene. I sammendrag, behandling med 5-nm Au-NPS effektivt hemmet celler proliferasjon og apoptose fremmet, men det også oppregulert ekspresjonen av ICAM-1 og MMP9, samt økt invasjon av A549-celler. I motsetning til dette, Mukherjee et al. rapporterte at Au-NPS (5 nm i diameter) utviste anti-angiogene egenskaper (dvs. hemmet tumorigen vekst av nye blodkar) både in vitro og in vivo [38].

Legg att eit svar