Abstract
Trombose er vanlig i eggstokkreft. Men samspillet av blodplater med eggstokkreft celler er ikke kritisk undersøkt. For å løse dette, undersøkte vi plate interaksjoner i en rekke av eggstokkreft cellelinjer med ulike metastatiske potensialer [HiO-80, 59m, SK-OV-3, A2780, A2780cis]. Blodplater festet til eggstokkreft celler med den mest signifikante adhesjon til 59M cellelinje. Eggstokkreft celler indusert blodplateaktivering [P-selektin ekspresjon] på en doseavhengig måte, med den mest signifikante aktiverings sett i respons til 59M cellelinjen. Blodplate antagonister [cangrelor, MRS2179, og apyrase] hemmet 59M celle indusert aktivering foreslå en P2Y12 og P2Y1 reseptor mediert mekanisme av plateaktivering avhengig utgivelsen av ADP ved 59m celler. A2780 og 59m-celler forsterkes PAR-1, PAR-4, og TXA2-receptor-mediert blodplateaktivering, men hadde ingen virkning på ADP, epinefrin, kollagen eller indusert aktivering. Analyse av genuttrykk endringer i eggstokkreft celler etter behandling med vaskede blodplater eller blodplate releasate viste en subtil, men gyldig oppregulering av anti-apoptotiske, anti-autofagi pro-angiogene, pro-cellesyklus og metabolske gener. Dermed eggstokkreft celler med ulike metastatisk potensial holde og aktivere blodplater forskjellig mens både blodplater og plate releasate megle pro-overlevelse og pro-angiogene signaler i eggstokkreft celler
Citation. Egan K, Crowley D, Smyth P , O’Toole S, Spillane C, Martin C, et al. (2011) blodplateadhesjon og degranulation Frem Pro-Overlevelse og Pro-angiogen Signale i eggstokkreft celler. PLoS ONE 6 (10): e26125. doi: 10,1371 /journal.pone.0026125
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
mottatt: Mai 10, 2011; Godkjent: 20 september 2011; Publisert: 12 oktober 2011
Copyright: © 2011 Egan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra Science Foundation Irland [SFI] som en del av Biomedical Diagnostics Institute [BDI-2 senter for naturfag Excellence and Technology (CSET)]. KE er støttet gjennom National biophotonics og Imaging Platform, Irland, og finansiert av den irske regjeringens Program for forskning i den tredje nivå Institusjoner, Cycle 4, National Development Plan 2007-2013. DC er støttet av helseforsknings Board (Irland) Scholars Program: Molekylærmedisin – fra gener til å fungere. BF og LMcE støttes av Emer Casey Foundation, Irland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den femte største årsaken til kreft dødsfall hos kvinner [1]. Det er den vanligste gynekologisk kreft og har den høyeste dødsfall til tilfelle forholdet mellom alle gynekologiske kreftformer. De fattige overlevelse er et resultat av sent stadium diagnoser. De fleste pasienter er asymptomatiske før sykdommen har metastasert [2]. Spredning av eggstokkreft har vært ansett å oppstå i hovedsak i peritoneum [3]. Men obduksjon og imaging studier [4], så vel som bevis for tilstedeværelse av mikrometastaser i bein aspirates av tidlig stadium ovarian kreftpasienter [5] antyder at hematogenous metastaser er mer vanlig enn tidligere antatt.
Under hematogenous spredning, er evnen av sirkulerende tumorceller til å interagere med blodplater antas å fremme deres overlevelse i sirkulasjonen og muliggjør dermed metastasering. Pre-kliniske dyreeksperimenter har vist at farmakologisk [6] eller genetisk [7] indusert trombocytopeni, samt defekter i platefunksjon [7] – [10] er forbundet med redusert metastase. Interaksjonen av kreftceller med blodplater er antatt å gi en rekke fordeler som fremmer vellykket metastase, herunder beskyttelse mot immunologisk angrep og omgåelse av immunovervåkning [11], [12], frigjøring av vekst, angiogene og vaskulær permeabilitet faktorer i løpet aktivering og degranulering [13]
Trombose og trombocytose er hyppige komplikasjoner av eggstokkreft og er assosiert med dårlig prognose [14] -. [16], fremhever viktigheten av blodplater i patologi eggstokkreft. Men samspillet mellom blodplater og eggstokkreft celler har ikke blitt godt undersøkt. I denne studien ønsket vi å karakterisere interaksjonen av blodplater med ovarie-celler, ved hjelp av en normal ovarie cellelinje [HIO-80] og eggstokk-kreft cellelinjer med forskjellige biologiske egenskaper og metastatiske potensialer [59M, SK-OV-3, A2780, og A2780cis].
Først studerte vi platelet vedheft til eggstokkreft celler under statiske betingelser for å avgjøre om det finnes en selvklebende samhandling mellom blodplater og eggstokkreft celler. Dernest vurderes vi muligheten for eggstokkreft celler for å indusere plateaktivering og degranulation [P-selektinuttrykk]. Etter å etablere at blodplater følge eggstokkreft celler, og eggstokkreft celler er i stand til å indusere plateaktivering og degranulation, vi neste vurderes genuttrykk endringer på transkriptomet nivå i eggstokkreft celler behandlet med blodplater eller blodplate releasate. Våre resultater viser differensial interaksjoner mellom blodplater og eggstokkreft cellelinjer, ikke bare i form av blodplater heft og aktivisering, men også i genuttrykk endringer i kreftceller behandlet med vaskede blodplater eller blodplate releasate. Flere interaksjoner oppstår mellom blodplater og eggstokkreft celler involverer faktorer frigjort av blodplater og kreftceller, så vel som direkte blodplate-ovarie-celle-interaksjoner. Denne interaksjonen resulterer i en pro-overlevelse, pro-angiogene signal for eggstokkreft cellen.
Metoder
Etikk uttalelse
Blood kolleksjon for denne studien ble godkjent av Det Kongelige College of Surgeons i Irland etisk komité og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle givere før blodprøvetaking.
reagenser
alle reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich [St Louis, MO, USA] med mindre ikke annet er angitt. Kollagen [løselig kalveskinn], adenosin-5′-difosfat, Adrenalin, og arakidonsyre ble hentet fra biodata [Horsham, PA, USA]. Alexa Fluor-488-merket Phalloidin, Calcein AM, og fibrinogen ble oppnådd fra Invitrogen [Carlsbad, CA, USA]. Fykoerytrin [PE] -merket anti human P-selektin [mus IgG], PE-merket muse-IgG isotype kontroll, og PE-merket anti-humant CD42a [mus IgG]-antistoffer ble innkjøpt fra BD Pharmingen [San Diego, CA, USA].
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Et utvalg av eggstokkene cellelinjer av epitelial opprinnelse ble valgt for inkludering i denne studien som epiteliale eggstokkreft er den vanligste histologiske type. HIO-80 [en gave fra Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA] representerer en ikke-tumorigen normal menneskelig eggstokkreft epitelial cellelinje, som har blitt udødeliggjort ved transfeksjon med et plasmid som koder for SV40 store T-genet. De HIO-80-celler ble holdt i en 01:01 blanding av medium 199 og MCDB-105 supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 0,2 IU /ml av rekombinant humant insulin som anbefalt av Fox Chase. 59M [European samling av cellekulturer (ECACC), Salisbury, UK] representerer tumorigent menneskelig eggstokkreft epitelial karsinom endometrioid type med tydelige cellekomponenter, opprinnelig isolert fra ascites av en 65 år gammel pasient med metastatisk kreft i eggstokkene. 59m-celler ble opprettholdt i DMEM, 1 g glukose /l, supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin som anbefalt av ECACC. SK-OV-3 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA] representerer en tumorigen human ovarian epitelial adenokarsinom, opprinnelig isolert fra ascites av en 64 år gammel pasient med metastatisk kreft i eggstokkene. SK-OV-3 ble dyrket med McCoy 5A medium, supplert med 10% føtalt bovint serum [Invitrogen, Nederland], 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin som anbefalt av ATCC. A2780 [ECACC, Salisbury, UK] er avledet fra en ovarial serøs epitelial tumorvevet i en ubehandlet pasient. Den cisplatin-resistente cellelinje A2780cis ble utviklet av kronisk eksponering av den overordnede cisplatin følsomme A2780 cellelinje til økende konsentrasjoner av cisplatin. Begge cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin som anbefalt av ECACC. Alle cellelinjer ble dyrket i standardbetingelser i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C.
Blodplate fremstilling
Blod ble erholdt fra friske givere som ikke hadde tatt medikamenter kjent for å påvirke blodplatefunksjonen i minst 10 dager. Blod ble oppsamlet ved venepunksjon gjennom en 19-gauge nål sommerfugl uten en tilstrammende, for å unngå blodplateaktivering. Blodplater ble fremstilt som tidligere beskrevet [17]. I korte trekk, for fremstilling av blodplaterikt plasma [PRP], ble blod samlet opp i en sprøyte inneholdende 3,2% trinatriumcitrat som antikoagulasjonsmiddel [10% vol /vol, deretter sentrifugert ved 170 g i 10 minutter ved romtemperatur. For fremstilling av vaskede blodplater ble blod oppsamlet i syre-citrat-dekstrose [ACD: 38 mM sitronsyre, 75 mM natriumcitrat, 124 mM D-glukose] som antikoagulant [15% vol /vol]. Blod ble sentrifugert ved 170 g i 10 minutter ved romtemperatur. PRP ble surgjort til pH 6,5 med ACD, og PGE
1 [1 uM] ble tilsatt for å unngå blodplateaktivering i løpet av sentrifugeringen. Blodplater ble pelletert ved sentrifugering ved 720 g i 10 minutter. Supernatanten ble fjernet, og blodplate-pellet ble resuspendert i JNL-buffer [130 mM NaCl, 10 mM natriumcitrat, 9 mM NaHCO
3, 6 mM D-glukose, og 0,9 mM MgCl
2, 0,81 mM KH
2PO
4, og 10 mM Tris, pH 7,4] til en konsentrasjon på 2,5 x 10
8 /ml og supplert med 1,8 mM CaCl
2.
blodplateadhesjon assay
blodplateadhesjon-analysen ble utført som tidligere beskrevet [18]. I korte trekk, ble ovarie-celler sådd ut i en 96-brønners plate [Nunc, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Tyskland] ved en konsentrasjon på 5 x 10
4 /ml og dyrket til konfluens. Vaskede blodplater [1,5 × 10
8 /ml] forhåndslastet med Calcein AM [2 mikrogram /ml] fikk lov til å følge de cellene i 45 minutter ved 37 ° C. Den totale fluorescens [485/535 nm] per brønn ble målt ved anvendelse av en Wallac 1420 Victor2 ™ multilabel telleren [Perkin Eimer, Waltham, MA., USA] plateleser. Platen ble vasket tre ganger, 100 ml JNL ble tilsatt til hver brønn på platen, og den gjenværende fluorescens ble avlest. % Av blodplater adhesjon ble beregnet som [værende fluorescens – blank] /[total fluorescens – blank] × 100. Blodplate vedheft til eggstokkreft celler ble fotografert av fluorescens mikroskopi. Når konfluente, cellene ble løsnet med 7 mM EDTA i Dulbeccos PBS, vasket to ganger og resuspendert i JNL supplert med 1,8 mM CaCl
2. Celler [1 x 10
5 /ml] ble inkubert på en BSA belagte poly-L-lysin lysbilde i 45 minutter ved 37 ° C. Etter vedheft, vasket blodplater [50 × 10
6 /ul] ble lagt til lysbildet og inkubert i 45 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble fiksert med 3,7% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur og permeabilised med 0,1% Triton X-100. Blodplater og eggstokkreft celler ble farget med Alexa Fluor-488 Phalloidin [41.25 nM] i 15 minutter ved romtemperatur. Blodplater ble spesifikt farget med fykoerytrin-merket anti-humant antistoff CD42a [1,25 ug /ml] i 2 timer ved 37 ° C. Platene ble montert og avbildes ved fluorescens mikroskopi.
plateaktivering
Evnen til eggstokkreft celler for å indusere plateaktivering (P-selectin uttrykk) ble vurdert av en flowcytometri basert analysen endret fra Nylander et al [19]. I et totalt reaksjonsvolum på 100 pl, ble 10 ul PRP ble inkubert med eggstokkreft celler [0 til 1,5 x 10
6 /ml,] i nærvær av et PE-merket anti-humant P-selectin antistoff [1,25 ug /ml] eller et passende isotype kontroll [1,25 ug /ml]. Alle inkubasjoner ble utført ved romtemperatur i 15 minutter. Reaksjonen ble deretter avsluttet med 1 ml av JNL buffer før analyse ved strømningscytometri. Prøvene ble analysert ved hjelp av en BD FACS Calibur [Becton Dickinson, Palo Alto, CA, USA] innen 1 time. Instrumentet ble satt til å måle størrelsen [fremover scatter, FSC], detalj [side scatter, SSC] og celle fluorescens. Ved hjelp av en logg FSC versus logge SSC prikkplott, ble en todimensjonal analyse gate tegnes rundt plate befolkningen, og en fluorescens histogram [log FL2 vs. count] ble oppnådd for 10.000 plate hendelser for hver prøve. Data ble analysert ved anvendelse av Cellquest Pro-programvare og uttrykt som prosent av blodplater som var P-selektin positiv i forhold til isotype kontroll.
Isolering av blodplate releasate
Vaskede blodplater [2,5 x 10
8 /ml] ble stimulert med begge TRAP [Trombin-reseptor-aktiverende peptid, 20 uM] og kollagen [190 pg /ml] og omrøres i en biodata PAP-4 lysgjennomgang aggregometer [Horsham, PA, USA] ved 37 ° C i 15 minutter. Blodplate-aggregat ble sentrifugert ved 720 g i 10 minutter. Supernatanten ble deretter aspirert og filtrert gjennom et sprøytefilter med et 0,22 um PVDF-membran for å fjerne blodplate-mikropartiklene.
MTT-analysen
å optimalisere konsentrasjonen av blodplate releasate for tumorcelle-eksponering, med en serie av MTT celleproliferasjonsprosesser analyser [Roche Diagnostics Ltd, Storbritannia] ble utført i henhold til produsentens instruksjoner for å bestemme den maksimale konsentrasjonen som kunne brukes på celler uten negativt påvirket på cellevekst eller overlevelse. Celler ble sådd ut i 96-brønners cellekulturplater ved 2 x 10
4 celler /brønn og dyrket i 24 timer for å tillate cellefesting. En gang er festet til platene, Dyrkningsmediet ble aspirert og cellene ble kort vasket med 200 ul pre varme PBS. Cellene ble deretter eksponert for seriefortynninger av blodplate-releasate fra 01:10 til 1:10,000 i sin helhet media, serumfritt medium eller JNL buffer for å tillate optimalisering av konsentrasjonen som skal anvendes i etterfølgende genekspresjon baserte undersøkelser.
Vasket blodplate /blodplate-releasate eksponering for genekspresjon analyse
Den optimale konsentrasjonen av blodplate releasate [bestemt ved MTT] ble påført på cellelinjer og nivåene av apoptose ble sammenlignet mot celler dyrket i fullstendig media bare ved hjelp av en Roche Apodirect TUNEL /propidiumjodid kit. Som 1:1000 fortynning av blodplate releasate i fullstendig vekstmedium ble observert å være den høyeste konsentrasjonen av blodplate releasate i sin helhet medier som ikke har innvirkning på cellevekst /levedyktighet for alle cellelinjer og ble senere vist å resultere i ingen signifikant forskjell i apoptose sammenlignet med celler dyrket i fullstendig media alene ble det fastslått at det var egnet for å gå videre med denne konsentrasjon. Gitt at plate releasate ble fremstilt fra identiske vaskede blodplatepreparater, den 1:1000 fortynning av blodplate releasate opplyser direkte bruk av en 1:1000 fortynning av vaskede blodplater for sammenlignende studie. Optimale konsentrasjoner av blodplate releasate og vaskede blodplater [1:1000] ble suspendert i hele kultur media og brukes på dyrkede celler i 75 cm
2 kolber i tre eksemplarer. Celler ble utsatt for releasate eller vasket blodplater i 6 timer, hvorefter total RNA ble ekstrahert fra cellene. Transkriptomet analyse ble utført ved hjelp av Affymetrix menneske Exon Arrays.
RNA ekstraksjon
Celler ble vasket kort i PBS, trypsinisert og sentrifugert for å fjerne supernatanten. RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy mini kit [Qiagen Ltd., West Sussex, UK] i henhold til produsentens protokoll. RNA mengden ble vurdert ved hjelp av en Nano-Drop ND-1000 spektrofotometer [Wilmington, USA] og kvalitet av en Agilent Bioanalyser 2100 og RNA 6000 Nano microfluidic chip-analysen [Santa Clara, USA]. RNA ble lagret ved -80 ° C.
Affymetrix matrise
100 ng total-RNA ekstrahert fra kontrollceller og celler eksponert for vaskede blodplater /blodplate releasate ble merket ved hjelp av Ambion WT Expression kit [ ,,,0],ambion /Life Technologies, Austin, TX, USA] inkludert merking kontroller fra Affymetrix Gene Chip Poly-A RNA kontrollsett. Som foreslått av Affymetrix /Ambion, på hvert trinn i prøveopparbeidelse protokollen, ble fremgang overvåkes ved hjelp av både Agilent 2100 Bioanalyzer og Nanodrop spektrofotometer. Kvalitetskontroll [QC] kreves vurdering etter den første syklusen RNA opprydding etter den andre syklusen single-cDNA opprydding og følge ssDNA fragmentering. Forberedt fragmentert ssDNA ble hybridisert til Affymetrix Menneskelig Exon 1,0 ST Array ved 45 ° C i 16 timer etter Affymetrix protokoller for deres Genechip WT Terminal merking, Genechip Hybridisering Kontroll og Genechip Hybridisering, Wash, og Flekke kits [Affymetrix, Santa Clara, USA] . Etter hybridisering ble flisen vasket og farget med Affymetrix Genechip lufthåndtering Station med passende 64 format analyseprotokollen. Etter farging og vasking trinn på Affymetrix Genechip Scanner 3000 og Affymetrix Genechip kjøreprogramvare ble brukt for forvaltning og foredling av uttrykket data. Dataene fra 45 ekson arrays var underlagt rekke kvalitetskontroll utføres ved hjelp av Affymetrix Expression Console. Alle kontroller var innenfor de rammer som foreslått av Affymetrix. Etter vellykket kvalitetskontroll standarder vurdering, ble chip data deretter analysert i dybden ved hjelp Biotique Systems XRAY analyse programvare. Hver cellelinje ble undersøkt under tre forskjellige betingelser; hvilende celler, celler eksponert for blodplate releasate og celler eksponert for vaskede blodplater. Hver cellelinje og tilstand ble testet i tre eksemplarer. Programvaren ble brukt til å sammenligne de to eksponerings kohorter mot hvile kontroll og gener som utviser en positiv eller negativ ganger endring på mer enn 1,5 og en betydning p≤0.05 undersøkt.
Fluidigm validering
genekspresjon ble validert ved hjelp Fluidigm høy gjennomstrømming qPCR 48.48 dynamisk array system. Gener som viser de mest betydelige fold endringer i tillegg til gener som er involvert i biologisk relevante trasé ble valgt for validering. TaqMan® real-time PCR uttrykk analyser ble brukt i forbindelse med Fluidigm sin microfluidic Biomark system. Prøver ble analysert i triplikat og resultatene ble sammenlignet med Affymetrix ekspresjonsdata. RNA ble revers transkribert til enkelttrådet cDNA ved hjelp av en High Capacity cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] i 100 pl reaksjoner. Reaksjoner inneholdt 10 ul buffer [10 ×], 4 pl deoksynukleotidtrifosfat [25 ×], 10 mL av tilfeldige primere [10 ×], 5 pl multiscribe RT enzym [50 U /ul], 21 mL av nukleasefritt vann og 50 pl ble ekstrahert totalt RNA [20 ng /mL]. Før Fluidigm, høy gjennomstrømming qPCR, en pre-forsterkning skritt ble utført følgende Fluidigm protokoller; 1 ml av TaqMan assay for hver av de gener som er av interesse identifisert ved XRAY analyse og endogene kontroller ble slått sammen og gjort til et sluttvolum på 100 ml i en x TE-buffer, pH 8,0. 1,25 ml av hver prøve ble tilsatt til 2,5 ml forforsterker Master Mix [AB] og 1,25 ml samlede analyseblanding for å gi en 5 ml reaksjonsvolum. Denne blandingen ble deretter utsatt for 14 forsterknings sykluser med 95 ° C, 15 sekunder og 60 ° C, 4 minutter før den ble fortynnet 1:05 med DNAse og RNase fri H
20 for å gi et sluttvolum på 25 ml pre- forsterket cDNA. Fluidigm data ble analysert ved hjelp Fluidigm Real-Time PCR-analyse programvare [ver3.02] for å gi relative kvantiteringsstandarder verdier kalibrert til normale [HIO-80] celler. Brett endringer returnert fra Affymetrix analyse ble plottet mot de som beregnes fra Fluidigm data og korrelasjonen mellom verdiene ble beregnet ved hjelp av grafen Pad Prism [ver 5.02].
Epitelial mesenchymale overgang [EMT] uttrykk analyse i plate maskert /releasate behandlede celler
prosessen med EMT er kritisk i metastatisk kaskade, ved å tilrettelegge oppføring av celler inn i karsystemet. RNA ble revers transkribert til enkelttrådet cDNA ved hjelp av en High Capacity cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] i 100 ul reaksjoner som ovenfor. En kombinasjon av de primære aktørene i EMT prosessen [20] og ytterligere gener er identifisert i vårt laboratorium som en integrert del av EMT prosessen [data ikke vist] ble undersøkt som en del av profilering for EMT i eggstokkreft celler: Akt-1, ALDH1 A1, CDH1, PIK3CA, SNAIL1, brev 2, TWIST 1, vimentin, ZEB1, ZEB 2, TLR 4, MyD88 bruker TaqMan primer og sonder [Life Technologies /Applied Biosystems: genuttrykk analyser] i henhold til produsentens instruksjoner. Expression ble undersøkt i blodplate og plate releasate behandlede celler og sammenlignet med hvile eggstokkreft celler for alle cellelinjer [HIO-80, 59M, SK-OV-3, A2780 og A2780cis]. Resultatene ble plottet som en vulkan tomt på p-verdi versus ganger endring. De tiltredelse analysetall for de genene som ble undersøkt er vist nedenfor:
GAPDH – Hs99999905_m1
akt1 – Hs00178289_m1
ALDH1A1 – Hs00167445_m1
PIK3CA – Hs00180679_m1
SNAIL1 – Hs00195591_m1
SNAIL2 – Hs00950344_m1
ZEB1 – Hs01566407_m1
ZEB2 – Hs00207691_m1
TWIST – Hs00361186_m1
vimentin – Hs00958116_m1
CDH1 – Hs01023895_m1
MyD88 – Hs00182082_m1
TLR4 – Hs00152939_m1
statistikker
data ble analysert ved hjelp av GraphPad Prism 5.0-programvare [GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA]. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet.
Resultater
Adhesjon av blodplater til eggstokkreft celler under statiske forhold
Blodplate vedheft til eggstokkreft cellelinjer under statiske betingelser ble kvantifisert basert på det fluorescerende påvisning av merkede blodplater [Figur 1A]. Blodplateadhesjon til A2780 [2,4 ± 0,2%, n = 8], A2780cis [3,0 ± 0,2%, n = 8] og 59M [3,4 ± 0,3%, n = 8] celler var signifikant sammenlignet med den negative kontroll BSA [1,0 ± 0,1%, n = 8]. Blodplateadhesjon til HIO-80 [1,8 ± 0,2%, n = 8] og SK-OV-3 [1,3 ± 0,2%, n = 8]-celler var ikke signifikant sammenlignet med BSA. Adhesjon til alle 5 eggstokkreft celler var lavere enn for den positive kontroll fibrinogen [5,9 ± 0,4%, n = 8]. Fluorescens mikroskopi bilder viser tydelig platelet vedheft til eggstokkreft cellelinjer A2780 og 59M [Figur 1B og C]. I samsvar med den blodplateadhesjon analysen, figur S1 viser den minimale blodplateadhesjon til den HIO-80-cellelinjen.
[A] blodplateadhesjon til eggstokkreft celler ble kvantifisert basert på fluorescens påvisning av merkede blodplater. Blodplate vedheft til fibrinogen og BSA ble brukt som ± kontroller [n = 8 + SEM, * = p 0,05 vs. BSA]. Fluorescens mikroskopi bilder av blodplater fester seg til A2780 [B] og 59M [C] celler under statiske betingelser [representant for n = 3]. Eggstokkreft celler og blodplater ble farget for aktin [green], ble blodplater farget spesielt for CD42a [rød /gul].
eggstokkreft celler induserer blodplateaktivering på en doseavhengig måte
muligheten av eggstokkreft celler for å indusere blodplateaktivering ble kvantifisert ved strømningscytometri. Økende konsentrasjoner av eggstokkreft celler [0 til 1,5 × 10
6 celler /ml] ble lagt til PRP og plateaktivering ble vurdert basert på P-selectin uttrykk. Eggstokkreft celler induserte en doseavhengig økning i blodplateaktivering [Figur 2]. De to metastatisk eggstokkreft cellelinjer; SK-OV-3 [1,5 × 10
6 celler /ml, 47 ± 10,2% av blodplater P-selektin positivitet, n = 3] og 59M [1,5 × 10
6 celler /ml, 51 ± 18% P-selektin positivitet n = 6] indusert den mest betydningsfulle blodplateaktivering. Det laveste blodplateaktivering ble observert i respons til den ikke-metastatisk kreft i eggstokkene cellelinje A2780 [1,5 x 10
6 celler /ml, 16,1 ± 5,2% P-selektin positivitet, n = 6]. A2780cis [a cisplatin motstandsdyktig datter-cellelinje for å A2780] demonstrert høyere blodplateaktivering enn modercellelinjen [1,5 x 10
6 celler /ml, 28,1 ± 12,2% P-selektin positivitet, n = 3]. De udødeliggjort normale eggstokkreft epitelceller linje HIO-80 også indusert blodplateaktivering [1,5 × 10
6 celler /ml, 32,5 ± 7,8% av blodplater P-selektin positivitet, n = 3], men i mindre grad enn 59M og SK-OV-3-celler.
blodplateaktivering [P-selektin ekspresjon] indusert av en rekke ovarie cellelinjer over et stort konsentrasjonsområde [0,1 til 1,5 x 10
6 /ml] ble målt ved hjelp flowcytometri, basert på blodplate P-selektin overflate-ekspresjon. Den mest betydningsfulle blodplateaktivering ble sett på som reaksjon på de metastatiske ovarian cancer-cellelinjer SK-OV-3 og 59M.
P2Y12 /P2Y1 reseptoren og ADP /ATP-antagonister inhiberer blodplateaktivering indusert av 59M eggstokkreft cellene
Siden 59m celler forårsaket den mest signifikante plateaktivering, ble de brukt for å teste effekten av en rekke blodplatehemmere for ovarial cancer cell indusert blodplateaktivering. 59m eggstokkreft celler [1,5 x 10
6 celler /ml, respons normalisert til 100% aktivering] ble tilsatt til PRP forbehandlet med inhibitorer og blodplateaktivering ble målt ved flowcytometri [P-selektin ekspresjon]. Konsentrasjonene av inhibitorene ble valgt basert på foreløpige flow-cytometri og blodplate aggregometry resultater som viste seg å være antagonistiske (data ikke vist). Antagonister mot Trombin [hirudin], integrin αIIbβ3 [ReoPro og RGDS-peptidet], Cox-1 [aspirin], og kalsium [EDTA], hadde ingen effekt på celle 59M indusert blodplateaktivering [Figur 3]. Etter behandling med den P2Y12 antagonist [cangrelor, 1 uM], den P2Y1 antagonist [MRS2179, 10 uM] eller ADP /ATPase (apyrase, 10 enheter /ml), blodplateaktivering i nærvær av 59m eggstokkreft celler ble betydelig svekket [ ,,,0],1fiM Cangrelor – 92,4 ± 0,64% hemming, p 0,001; 10 mm MRS2179 – 71,4 ± 10,52% hemming, p = 0,01; 10 enheter /ml apyrase, 91,8 ± 3,7% hemming, p 0,001]. Dette tyder på en ADP avhengige mekanismen for plateaktivering ved 59m celler, potensielt mediert av utgivelsen av ADP av cellene i deres supernatant [Figur 3].
Dette antyder en mekanisme av plateaktivering avhengig av blodplatereseptorer P2Y12 og P2Y1, og ADP utgitt av 59m celler inn i deres supernatant. Andre plate antagonister som hirudin, EDTA, abciximab, RGDS, og aspirin hadde ingen effekt på 59M celle indusert blodplateaktivering.
eggstokkreft celler potensere TRAP [trombin reseptor aktivering peptid], PAR 4 agonist, og arakidonsyre indusert blodplateaktivering på en doseavhengig måte
Siden trombose er en kompleks prosess som involverer flere agonister
in vivo
, vi neste spurte om eggstokkreft celler modulert agonist [TRAP, PAR 4 agonist, arakidonsyre, ADP, epinefrin, kollagen og] indusert blodplateaktivering. For å finne ut dette, vi vurdert aktivering i blodplater co-inkubert med lave eggstokkreft cellekonsentrasjoner og lave agonist konsentrasjoner. Plate agonist konsentrasjonene som ga ≤20% plateaktivering [P-selektinuttrykk] ble brukt. Ved lave cellulære konsentrasjoner [0,5-1 x 10
5 celler /ml], 59m eggstokkreft kreftcellene forsterkes PAR-en [TRAP], PAR-4 [PAR4 agonist] og TxA2 reseptor [arakidonsyre] mediert blodplateaktivering [P -selectin uttrykk], men hadde ingen virkning på ADP, epinefrin, kollagen eller indusert aktivering [Figur 4]. For eksempel, som respons på en pM TRAP og 1 x 10
5 59M celler /ml, blodplateaktivering ble 44 ± 12,16% P-selektin positivitet [n = 3, figur 3] i forhold til 4,4 ± 1,6% P-selektin positivitet [1 × 10
5 59m celler /ml alene, n = 3] og 5,1 ± 1,3% P-selektin positivitet [1 mikrometer TRAP alene, n = 3]. Omvendt, i respons til en pM ADP og 1 x 10
5 59M celler /ml, blodplateaktivering var 17,3 ± 6,2% P-selektin positivitet [n = 3, figur 4] sammenlignet med 2,4 ± 1,4% [1 x 10
5 59m celler /ml alene, n = 3] og 14,73 ± 5,3% [1 uM ADP alene, n = 3]. Lignende resultater er også sett i respons til A2780-celler [1 – 5 x 10
5 celler /ml], men høyere A2780 cellekonsentrasjoner som var nødvendige for å indusere en tilsvarende effekt til 59m-celler [data ikke vist]. Dataene tyder på en synergistisk forhold mellom PAR-1, PAR4, og TXA2-receptor-mediert blodplateaktivering og A2780 /59M indusert blodplateaktivering. Denne synergistiske interaksjonen blir også hemmet av P2Y12 antagonisten cangrelor [data ikke vist].
Aktivering finner sted på en doseavhengig måte [n = 3, + SEM]. Ved lave konsentrasjoner, 59M [0,5-1 x 10
5 /ml], celler vesentlig forsterkes TRAP, PAR4 agonist, og Arakidonsyre indusert blodplateaktivering [P-selektinuttrykk]. Dette tyder på en synergistisk forhold mellom PAR-1, PAR-4, og TXA2-receptor-mediert blodplateaktivering og 59M indusert blodplateaktivering. Lignende resultater er sett for A2780 celler [1-5 × 10
5 celler /ml, data ikke vist]
Expression rekke analyse av eggstokkreft celler behandlet med vaskede blodplater eller blodplate releasate bruker Affymetrix ekson arrays
Alle matriser gått QC hjelp Affymetrix QC programvare. Biotiques X-Ray software plug-in for Microsoft Excel ble brukt til å avhøre genuttrykk endringer mellom behandlinger og celletyper [Fold endring 1,5 og p 0,05]. Analytisk stringens var avslappet å kaste endringer i 1,5 for å imøtekomme subtile, men meningsfull biologisk variasjon [p 0,05] som var betinget av behandling. Tabell 1, 2, 3, 4 skildre genuttrykket variasjoner observert i celler behandlet med blodplate releasate /vasket blodplater.
I HiO-80 celler, etter behandling med vaskede blodplater eller blodplate releasate, sju gener var signifikant oppregulert, med størst forskjell sett i respons til vaskede blodplater. De oppregulert genene koder for proteiner assosiert med eggstokkreft metastase [SERPINB2 /PAI2], metabolske aktiviteter [IDI1, PMM2] og genuttrykk /transkripsjon [PCGF6, ZNF267].
59m celler også utstilt genuttrykk endringer etter behandling med plate releasate og vaskede blodplater. De biologiske prosessene påvirket involvert anti-autofagi, anti-apoptotiske og pro-angiogene signalveier [TRAF2, CCL2, TNFAIP2, PDGFb].
