Abstract
Misexpression av vekstfaktorer, særlig de som er knyttet til stamcelleliknende fenotype, er ofte observert i flere krefttyper. Det har blitt funnet å påvirke parametere av progresjon av sykdommen som celleproliferasjon, differensiering, vedlikehold av udifferensierte fenotype og modulering av immunsystemet. GDF3 er et TGFB familiemedlem forbundet med pluripotency og differensiering under embryonal utvikling som tidligere er blitt rapportert å bli re-uttrykkes i en rekke krefttyper. Imidlertid har sin rolle i tumorutvikling og progresjon ikke avklart ennå. I denne studien tyde vi rollen som GDF3 i en
in vitro
modell av kreft stamceller, NCCIT celler. Ved klassisk metode for å studere protein funksjon kombinert med high-throughput teknikk for transcriptome analyse og differensieringsanalyser vi undersøkt GDF3 som et potensielt terapeutisk mål. Vi observerte at GDF3 robust induserer et panel av gener knyttet til differensiering, inkludert flere potente kreftdempere, uten at det påvirker den proliferative kapasitet. Videre rapporterer vi for første gang den beskyttende effekten av GDF3 mot retinsyre-indusert apoptose i celler med stamcelle-lignende egenskaper. Vår studie antyder at blokkering av GDF3 kombinert med retinsyre-behandling av faste kreftformer er en overbevisende retning for videre undersøkelser, noe som kan føre til re-design av kreft differensiering terapier
Citation. Tykwinska K, Lauster R, Knaus P, Rosowski M (2013) Vekst og differensiering Factor 3 induserer uttrykket av gener relatert til differensiering i en modell av kreftstamceller og beskytter dem fra retinsyre apoptose. PLoS ONE åtte (8): e70612. doi: 10,1371 /journal.pone.0070612
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 28 februar 2013; Godkjent: 20 juni 2013; Publisert: 12. august 2013
Copyright: © 2013 Tykwinska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne vil gjerne si at dette arbeidet ble finansiert av Technische Universität Berlin og ved DFG gjennom Berlin-Brandenburg School for Regenerative Therapies GSC 203. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskript
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft stilk-lignende celler (CSC) utgjør en liten bestand av tumor-initiering. celler, med utstrakt selvfornyelse evne, kapasitet til å generere ikke-tumorigent end celler og multidifferentiation potensial. Cscs antas å være hovedårsaken til kjemoterapi motstand og sykdom tilbakefall. I henhold til den hypotese CSC, kontroll over denne sterkt proliferativ celledelen definerer det optimale kur for kreft [1] – [3]
Det har vært pågående studier for å definere CSC markører
in vivo
. , men ingen pålitelig og universell kombinasjon har vist seg så langt. Men Ben-Porath [4] og andre [5], [6] viste at en felles trekk ved histologisk dårlig differensierte svulster – som generelt utviser de verste prognosene – er ES-lignende signatur, inkludert uttrykk for Nanog, OCT4, SOX2 og deres mål [7], [8]. Avvikende uttrykk for stamcelle faktorer i svulster opprett aggressive fenotype og øker sannsynligheten for progresjon og metastase [9].
Blant den enorme mengden av kreftcellelinjer tilgjengelig for å studere kreft biologi
in vitro
, embryonal karsinom cellelinjer vise ES-lignende signatur, herunder uttrykk for hoved pluripotency-nettverk knyttet transkripsjonsfaktorer, og er ikke bare i stand til å skille
in vitro
, men er også svært tumorigent
in vivo
. Derfor embryonal karsinom (EF) cellelinjer, er forventet å være en egnet modell for CSC [10], [11].
vekst- og differensieringsfaktor 3 (GDF3) er allment akseptert som pluripotency markør, som det er et direkte mål transkripsjonen av Nanog [12]. Det ble rapportert å regulere begge viktige kjennetegn ved embryonale stamceller, vedlikehold av udifferensierte fenotype og av differensieringen potensialet [13].
Sammen med andre embryoniske stamcellemarkører, ble GDF3 vist å bli uttrykt i flere kreft typer som brystkreft [14], [15], melanom [16], seminom [15] og testikkelkreft bakterie celle svulster [17]. Mens Nanog, OCT4 og SOX2 ble identifisert som stemness fremmende transkripsjonsfaktorer, forblir rolle GDF3 dårlig forstått. Resultater utgitt av andre til dags dato, om den antatte rolle dette molekylet i kreft biologi er motstridende. Det ble demonstrert at GDF3 hemmer proliferasjonen av bryst karsinom cellelinje MCF7 [14], men forsterker proliferasjon av B16 myelom og kan fremme neuronal differensiering av PC12-celler [18].
GDF3 representerer potent vekstfaktor familie av transformerende vekstfaktor β (TGFB). Medlemmer av TGFB familie, inkludert Benmorfogenetiske proteiner (BMPs), vekst og differensiering faktorer (GDFs) og TGFB, vise forskjellige, noen ganger motstridende effekter på målceller, avhengig av mobilnettet sammenheng, andre ligander til stede, dosering og identitet cytokin [ ,,,0],19]
GDF3 ble rapportert å være involvert i begge kanoniske trasé utløst av TGFB familiemedlemmer. (1) ekstracellulære hemming av BMP [13] og (2) induksjon av SMAD2 /3 fosforylering grunn av binding til activin A-reseptorer type IB eller IC (ACVRIB, ACVRIC) og aktivin-reseptorer skriver IIA eller IIB (ACVRIIA, ACVRIIB) i samarbeid med obligatorisk ko-reseptor teratocarcinom-avledet vekstfaktor 1 (TDGF1) [20], [21].
Den nye rollen SMAD2 /3 signalkaskade er allerede vist i bukspyttkjertelen, bryst, mage, eggstokk, hud og mange andre krefttyper. Imidlertid kan begge, aktivering og blokkering av SMAD2 /3 pathway ha positive effekter på sykdomsutbruddet [22] – [24]. Derfor har virkningen av hver ligand utløser denne veien til å bli nøye undersøkt og vurdert.
Oppmuntret av disse fakta, omfavnet vi utfordringen til omfattende undersøke effektene av GDF3 signal i en modell av CSC linje transkriptom profilering og differensieringsanalyser og for å evaluere dens potensial som et terapeutisk mål. Vi fant at GDF3 regulerer ekspresjon av gener som er involvert i differensiering, men påvirker ikke den proliferative kapasiteten til udifferensierte CSC. Videre viser vi at GDF3 beskytter CSC fra apoptose indusert av retinsyre, det eneste klinisk godkjent CYTO-differensierende, anti-cancer middel.
Materialer og metoder
Cellekultur og differensiering
NCCIT og HEK293T celler (American Type Cell Collection) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 4,5 g /l glukose (PAA Laboratories, Østerrike) som inneholdt 10% FBS (PAA Laboratories, Østerrike) og Penicillin-streptomycin (PAA Laboratories , Østerrike).
for å generere GDF3 knockdown cellelinjer, shRNA oligonukleotider for å målrette GDF3 ble syntetisert av TibMolBiol (TibMolBiol, Tyskland) og klonet inn lentiviral vektor pLL3.7 (Addgene, USA). Alle konstruksjoner ble sekvensert (GATC, Tyskland) før påføring. I kombinasjon med to emballasje plasmider PAX2 og VSVG viruset ble produsert av kalsiumfosfat transfeksjon av 293T celler. Mediet inneholdende virus ble oppsamlet, 20 x konsentrert i SPIN® FX® UF Concentrator (Corning, Tyskland) og blandet med NCCIT celler med tilsetning av 10 ug /ml polybrene (Sigma, Tyskland). Mediet ble endret til vanlig medium neste dag.
For å indusere differensiering, ble NCCIT celler behandlet med 10 mikrometer all-trans retinsyre (Sigma, Tyskland) i 14 dager.
Microarray analyse
for transkriptomet analyse menneskelige genom CGH Microarray 44K (Agilent Technologies, USA) ble benyttet i henhold til produserer protokollen. I korte trekk ble isolert RNA merket av lav RNA Input Fluorescent Linear Amplification kit (Agilent Technologies, USA), fragmentert, blandet med kontroll mål og hybridisert over natten. Platene ble deretter vasket og skannet med fem mikrometer oppløsning ved hjelp av DNA microarray scanner (Agilent Technologies, USA). Funksjoner ble ekstrahert med bildeanalyseverktøyet A 6.1.1. (Agilent Technologies, USA) ved hjelp av standardinnstillingene. Dataanalyse ble utført med Rosetta informatikk Platform resolverkort Inne 4.0.
Den overrepresentasjon Analysen ble foretatt ved å laste opp gensettene med p-value≤0.05 og brett change≥1.5 til Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID ) v6.7 [25] og utføre Gene Onthology analyse ved hjelp av inngangs Panther_BP_ALL.
Microarray data (sjonsnummer GSE44670) har blitt sendt til NCBI GEO database. Datasettet består av 3 forhold (A-C, nærmere beskrevet i GEO-databasen og i resultater delen) med en biologisk replikat hver. Den ubehandlede kontroll i A og B er representert ved en annen prøve.
Varmen kartet ble generert av CIMminer, et freeware utviklet av Genomics og bioinformatikk Group, Laboratory of Molecular Pharmacology, Senter for Cancer Research, National Cancer Institute . Bare prober med p≤0.05 og fold change ≥1.5 enten microarray A eller B ble valgt. Hvis p 0,05, brett endringen ble standard satt til 1 (satt til svart farge på kartet varmen)
Isolering av nukleinsyrer, cDNA syntese og qPCR
Isolering av RNA ble utført ved hjelp. NucleoSpin® RNA II kit (MACHEREY-NAGEL, Tyskland), å følge instruksjonene.
revers transkripsjon av mRNA ble utført ved hjelp TaqMan® Reverse Transcription Reagenser cDNA kit (Applied Biosystems, USA), som per produsentens instruksjoner.
real time PCR ble utført ved hjelp av en mikroliter cDNA med en ul primer mix og SensiFAST ™ SYBR No-ROX kit (Bioline, Tyskland), i 96-brønners PCR-plater (Biozym Scientific, Tyskland), og ble lest med Stratagene MX 3005P ™ Multiplex Kvantitativ PCR System (Agilent Technologies, USA). Primere ble bestilt fra TIBMolBiol (Tyskland).
primer liste kan finnes i tabell 1.
Luciferase assay
BMP-responsive konstruere BRE-Luc [26] og SMAD bindende element konstruere SBE-Luc var snill gaver fra Prof. P. Ten Dijke (Leiden University Medical Center). CagA-Luc var en slags gave fra professor P. Knaus (Freie Universität Berlin). Cellene ble sådd, transfektert med TurboFect (Thermo Scientific, Tyskland, fremgangsmåten i henhold til produsentens protokoll) og 24 timer senere sultet i tre timer i serumfritt medium og deretter stimulert i minst 20 timer med liganden av interesse (rhGDF3, rhNodal og rhBMP2 ble kjøpt fra R B, tabell 3), er det motsatte mønsteret vises som et resultat av GDF3 knockdown (microarray C, Tabell 3)
GDF3 handlinger i. en doseavhengig måte
for å møte den biologiske rollen GDF3, ble genene regulert på grunn GDF3 stimulering og knockdown (tabell 3) kategorisert på grunnlag av deres biologiske funksjon. For dette formål regulert gener med offisielle genet navn ble trukket ut fra hver microarray og en overrepresentasjon analyse ble utført av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) v6.7 [25]. Denne fremgangsmåten gjør det mulig å vurdere om et bestemt funksjonelt definert gruppe av gener som er representert mer enn antatt tilfeldig innenfor et gen liste [32]. Gener som reguleres av GDF3 ble klassifisert til hovedkategorier som utviklingsprosesser, mesoderm og ektoderm utvikling, nevrogenese og signaltransduksjon (tabell S1 og tabell 4). Mellom 15,3% og 18,2% av genene regulert på mikromatriser A og C, henholdsvis, var assosiert med utviklingsmessige prosesser. Regulering av gener med funksjon i ektoderm utvikling og nevrogenesen ble notert på mikromatriser A (6,5% og 6,5%) og C (6,5% og 5,8%), men ikke B. Videre, blant gener som reguleres av GDF3 knockdown 5,3% var forbundet med mesoderm utvikling. Ca. 25% av gener på alle mikromatriser ble klassifisert til signaltransduksjon. Overrepresetation analyse viste også at en liten, men betydelig antall (p≤0.05) av gener relatert til angiogenese på microarray C (0,9%) (tabell S1) er regulert av SMAD2 /3 signalering.
stimulering av NCCIT celler med ulike konsentrasjoner av GDF3 og GDF3 knockdown ulikt berørt SMAD2 /3 signaliserer styrke (figur 1E). For ytterligere å sammenligne disse effektene, analyserte vi den kvantitative overlapping av transkripsjonelle forandringer i stimulerte celler, så vel som undergrupper av genene utelukkende reguleres av hver eksperimentell tilstand (figur 3). De ekstraherte genet listene ble deretter underkastet den overrepresentasjon analyse. 48 gener ble oftest regulert i alle tre forholdene. Det er imidlertid bare ni av disse var betydelig anriket i henhold til deres biologiske funksjon til den kategori av celleoverflate-reseptor-mediert signaltransduksjon. Av de 2075 og 421 gener differensielt regulert av GDF3 knockdown eller høy konsentrasjon av GDF3, henholdsvis (A og C), ble 129 transkripter reguleres i begge tilstander. Disse ble hovedsakelig beriket i kategorier knyttet til utvikling og avstamning engasjement: utviklingsprosesser, ektoderm utvikling og neurogenesis. Men når vanligvis regulert gener ble ekskludert fra gener og bare gener reguleres utelukkende av økt (microarray A) eller forstyrret (microarray C) SMAD2 /3 signale ble analysert, ble det observert store forskjeller i effekt på flere biologiske prosesser. Mens den høye dosen av GDF3 påvirket bare prosesser knyttet til signalering (celleoverflaten reseptor mediert signaltransduksjon, cellekommunikasjon, ligand-mediert signalering, signaltransduksjon) og neurogenesis, de GDF3 knockdown påvirket ytterligere sett med gener som er tildelt ikke bare å signal, utviklingsprosesser og ektoderm utvikling, men også mesoderm utvikling og hematopoiesis.
Venn-diagram som illustrerer overlapping mellom mikromatriser A, B og C. Bare sonder på microarrays med p-verdi ≤0.05 og brett endring ≥1.5 ble brukt i denne analyse. Undergrupper av gener som er angitt i overskriftene på de fargekodede boksene ble utsatt for genet ontologi representasjonen analyse og et utvalg av overveiende beriket biologiske prosesser er oppført (fullstendig liste kan finnes i tabell S1). De biologiske prosessene er oppført også i Tabell 4 er skrevet med fet skrift. A – stimulering med 300 ng /mL rhGDF3, B – stimulering med 100 ng /mL rhGDF3, C -. GDF3 knockdown
En lignende prosedyre ble benyttet for å analysere funksjonen av gener moduleres ved høye og lave doser av GDF3 (figur 4A). 89 gener ble regulert i begge forholdene, men vurderingen av genet ontologi attributter innenfor denne gruppen leverte ingen statistisk signifikante (p≤0.05) resultater. Vi merket klare forskjeller i biologiske prosesser er regulert av ulike konsentrasjoner av GDF3. Høy konsentrasjon GDF3 påvirket transkripsjon av flere gener assosiert med ektoderm utvikling, nevrogenesen og signaltransduksjon, mens 100 ng /ml av GDF3 modulert bare fremgangs signaltransduksjon. Varmen kartet fold endringer fremhever flere grupper av gener potensielt regulert forskjellig (figur 4B) av høy og lav konsentrasjon av GDF3.
A. Venn-diagram som illustrerer cross-analyse av vanlig regulerte gener grunn til 300 ng /ml rhGDF3 (microarray A) og 100 ng /ml rhGDF3 (Microarray B) stimulering av NCCIT celler. Bare gener med p-verdi ≤0.05 og brett endring ≥1.5 ble inkludert. B. Varme kart over brette forandringer av gener regulert av høy og lav dose av GDF3 (Microarray A og B). Gener med gangers endring ≥1.5 og p-verdi ≤0.05 på i det minste en av de mikromatriser ble inkludert. Svarte striper indikerer ganger endring 1,5 eller p-verdi 0,05. Flippen endringen er fargekodet fra grønt til rødt (se skala bar).
De tre betingelser som er brukt til å dissekere virkningen av GDF3 på NCCIT celler som omfatter (A) høy dose GDF3 til maksimalt aktivere SMAD2 /3-vei, (B) lav dose av GDF3 for moderat SMAD2 /3 signalering og (C) avbrytelse av signalerings GDF3 ved GDF3 knockdown genererte forskjellige nivåer av signalering GDF3 styrke. Våre resultater tyder på at modulering av SMAD2 /3 signalering ved GDF3 stimulering eller avbrudd av GDF3 signalveien påvirker flere biologiske prosesser som utviklingsmessige prosesser, ektoderm utvikling, nevrogenesen og signaltransduksjon på transkripsjonsnivået. I tillegg er stabil GDF3 knockdown førte til induksjon av gener assosiert med mesoderm utvikling og hematopoiesis i NCCIT celler. Videre GDF3 modulert den transkriptomet av NCCIT-celler på en doseavhengig måte. Selv en lav dose av GDF3 (microarray B) vesentlig endret transkriptomet av målcellene. Men i motsetning til en høy dose av GDF3, en lav dose ikke har noen innvirkning på regulering av gener assosiert med utvikling.
GDF3 induserer ekspresjon av ulike gener assosiert med signaloverføring og utvikling
for å bekrefte microarray resultater, valgte vi flere gener knyttet til signaloverføring og utviklingsprosesser og validert sitt uttrykk på GDF3 stimulering av qPCR. Sammenstilling av microarray og qPCR resultatene er presentert i tabell 5, oppsummerer valideringen av microarray eksperiment.
Velge kandidater til GDF3 målgener vi hatt hovedfokus på medlemmer av TGFB familien og transkripsjonsfaktorer, som kan fungere som hovedbrytere i celle skjebne beslutninger.
uttrykk for
LEFTY2
, en kjent SMAD2 /3 mål i embryonale stamceller [33], ble sterkt oppregulert ved lav og høy dose GDF3 (figur 5A) og tjente som en positiv kontroll for stimulering.
A-G. Effekt av stimulering med ulike GDF3 konsentrasjoner på transkripsjon av flere gener reguleres på mikromatriser A B. n = 5. H. Effekt av GDF3 knockdown på transkripsjon av flere gener som reguleres på den mikromatrise E. n = 3. ekspresjon ble målt ved qPCR, er resultatene presentert som
GAPDH
forhold og normalisert til ustimulerte celler (A-G) eller celler transdusert med egge-vektor (H). P-verdier som er mindre enn eller lik 0,05 ble betraktet som signifikant. (*) Viser p≤0.05 og (**) p≤0.01.
