Abstract
Iron-svovel klynge biogenesis er utført av forskjellige protein monteringssystemer. Pattedyr har to systemer, mitokondrie Fe-S klynge sammenstilling system (ISC) og cytosoliske sammenstillingen system (CIA), som er forbundet med en ukjent mekanisme. De menneskelige medlemmer av NEET familien 2FE-2S proteiner, næringsmangel autofagi factor-1 (NAF-1) og mitoNEET (MNT), ligger i skjæringspunktet mellom mitokondrier og cytosol. Disse proteiner har blitt implisert i kreft-celleformering, og de kan overføre sine 2FE-2S klynger til en standard apo-akseptor-protein. Her rapporterer vi den første fysiologiske 2FE-2S klynge akseptor for både neet proteiner som humant Anamorsin (også kjent som cytokin indusert apoptose inhibitor-1; CIAPIN-1). Anamorsin er et elektronoverføringsprotein inneholdende to jern-svovel-cluster-bindingsseter som er nødvendig for cytosol-Fe-S-klynge enheten. Vi viser, ved hjelp av UV-Vis-spektroskopi, som både NAF-en og MNT kan overføre sine 2FE-2S klynger til Apo-Anamorsin med andre ordens hastighetskonstanter som ligner på andre kjente menneskelige 2FE-2S overførings proteiner. En direkte protein-protein interaksjon av neet proteiner med apo-Anamorsin ble oppdaget ved hjelp biolag interferometri. Videre viser elektrospray massespektrometri av holo-Anamorsin stilles ved å klynge overføring som den mottar begge sine 2FE-2S klynger fra NEETs. Vi foreslår at MNT og NAF-en kan gi parallelle ruter kobler mitokondrie ISC system og CIA. 2FE-2S klynger samlet i mitokondriene blir mottatt av neet proteiner og ved behov overføres til Anamorsin, aktivering av CIA
Citation. Lipper CH, Paddock ML, Onuchic JN, Mittler R, Nechushtai R, Jennings PA ( 2015) kreft-relaterte neet Proteiner Overfør 2FE-2S Clusters til Anamorsin, et protein kreves for cytosolic Iron-Svovel Cluster biogenesis. PLoS ONE 10 (10): e0139699. doi: 10,1371 /journal.pone.0139699
Redaktør: Yaakov Koby Levy, Weizmann Institute of Science, Israel
mottatt: May 14, 2015; Godkjent: 15 september 2015; Publisert: 08.10.2015
Copyright: © 2015 Lipper et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av NIH GM101467 tildelt PAJ, Israel Science Foundation – ISF 865/13 tildelt RN, og midler fra University of North Texas. College of Arts and Sciences tildelt RM. Arbeid ved Senter for teoretisk Biological Physics ble sponset av National Science Foundation (Grants PHY-1427654 og MCB-1214457) og ved Cancer Prevention and Research Institute of Texas. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Iron-svovel (Fe-S) klyngene er gamle kofaktorer som finnes i proteiner fra alle riker i livet. Proteiner som inneholder jern svovel klynger utføre en rekke kritiske funksjoner, inkludert overføring av elektroner i oksidativ metabolisme, fotosyntese, nucleotide metabolisme, syntese av protein kofaktorer, og er avgjørende for DNA replikasjon og DNA-reparasjon [1, 2]. Biosyntesen av Fe-S klynger skjer ved komplekse proteinmonteringssystemer som inkluderer stillas proteiner, anstand, elektron overføring proteiner og cystein desulfurases [3]. Hos pattedyr er det to forskjellige sett med Fe-S klynge montering maskiner: mitokondrie jern svovel klynge enheten (ISC) system og cytosoliske jern svovel klynge enheten (CIA) system. CIA leverer Fe-S klynger for cytosoliske og nukleære proteiner, inkludert de som er involvert i DNA replikasjon og reparasjon [4]. Den mitokondrielle ISC-systemet har blitt rapportert å være nødvendig for aktivering av cytosolisk system [5, 6]. Men det nøyaktige innholdet i koblingen mellom de to systemene er fortsatt ukjent. Det er flere menneskelige sykdommer forbundet med defekter i Fe-S biogenesis, inkludert Friedreichs ataksi, oblastanemi, multiple mitokondriell dysfunksjon syndrom og kreft [3, 7].
Den menneskelige neet proteiner er en nylig oppdaget ny klasse av 2FE-2S proteiner. De er de eneste kjente jern-svovel-proteiner lokalisert ved eller nær den ytre mitokondriemembranen som ligger i grenselandet mellom de mitokondrier og cytosol. Det beste kjennetegnet av disse er mitoNEET (MNT, CISD1) og næringsmangel autofagi factor-1 (NAF-en, miner1, ERIS, CISD2) (anmeldt i [8]). MNT er plassert på den ytre-mitokondriemembranen (OMM) og NAF-1 på det endoplasmatiske retikulum (ER) og den mitokondrielle-tilknyttede membran (MAM) av ER [9-11]. NAF-en i MAM er nært koblet til OMM via sin kompleks med IP
3R, som er direkte bundet til OMM pore protein VDAC av grp75 [9, 12]. Disse neet proteiner er involvert i en rekke humane sykdommer, inkludert kreft, diabetes, cystisk fibrose, Wolfram syndrom 2, neurodegenerering og muskelatrofi [8, 13-18]. Krystallstrukturer viser at både MNT og NAF-en er homodimerer med hver protomer koordinere en 2FE-2S klynge med en uvanlig 3Cys: 1His koordinering [19, 20]. Den uvanlige Fe-S klynge koordinering av tre Cys-ligander og en ikke-Cys ligand er funnet i Fe-S-klynge overføringsproteiner [21]. Vi demonstrerte evne neet proteiner for å overføre sine 2FE-2S klynger til apo-ferredoxin, gullstandard protein som brukes for Fe-S klaseoverføringsforsøk [22, 23].
subcellulære lokaliseringen av NEET proteiner på grenseflaten av cytosol og mitokondriene, så vel som deres klynge overføringsfunksjonen, førte oss til å undersøke hvorvidt de kobler den mitokondrielle ISC systemet til CIA systemet. Cytosoliske 2FE-2S-protein Anamorsin (også kjent som cytokin indusert apoptose inhibitor-1; CIAPIN-1) er et elektronoverførings protein som er nødvendig for et tidlig trinn av Fe-S klynge montering av CIA system [24-26]. I denne studien identifiserer vi Anamorsin som den første kjente direkte fysiologisk 2FE-2S klynge akseptor for både MNT og NAF-en. I likhet med våre tidligere funn med ferredoxin skjer overføring bare når klyngen er i oksidert [2FE-2S]
2+ staten og hemmes av mutasjon av Hans ligand til Cys. Satsen for klyngen overføring til Anamorsin fra MNT eller NAF-en er sammenlignbare med de av andre kjente menneskelige 2FE-2S klyngen overførings proteiner. Vi viser, ved hjelp av biolag interferometri, at begge NEETs danner en direkte protein-protein interaksjon med Anamorsin. Videre rapporterer vi at neet proteiner direkte overføre 2FE-2S klynger både Anamorsin cluster-bindingsseter som åpner for fullstendig oppløsning av holo-Anamorsin. Fordi holo-Anamorsin er nødvendig for biosyntesen av Fe-S-klynger av CIA-systemet, for å 2FE-2S klynge overføring apo-Anamorsin antyder at neet proteiner har en viktig rolle i reguleringen /aktivering av klynge montering av CIA systemet.
eksperimentelle prosedyrer
uttrykk og rensing av proteiner
De løselige domener av NAF-en (rester 57-135) og mNT (rester 33-108) ble uttrykt og renset som tidligere beskrevet [19, 23]. De rensede neet proteiner inneholder ≥ 98% klynge belegg. Det humane cDNA som koder for Anamorsin plasmid (Abgent) ble amplifisert ved PCR og subklonet inn i en pET28-en (+) vektoren (Novagen) mellom Ndel og Xhol-restriksjonsseter. Vektoren tilfører en 6x His-tag og en trombin-spaltningssete til den N-terminale enden av genet. BL-21 Kodon Plus (DE3) ril-celler (Stratagene) ble transformert med den pET28-en (+) – Anamorsin konstruere. Kulturer ble dyrket i LB-medium inneholdende som tidligere beskrevet [27]. 750 uM FeCl ^
3 ble tilsatt til kulturen i 30 minutter før induksjon med IPTG. Celler ble pelletert ved sentrifugering og resuspendert i 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM NaCl, 5 mM imidazol. Resuspenderte celler ble lysert ved hjelp av en EmulsiFlex-C5 homogenisator (Avestin) og sentrifugeres. Supernatanten inneholdende his-tagged Anamorsin var bundet til Ni-NTA-agarose (Qiagen) harpiks, vasket med resuspendering buffer og eluert med den samme buffer med 300 mM imidazol. Eluerte Anamorsin ble fortynnet i 25 mM Tris-HCl, pH 7,1 som inneholdt 5 mM DTT og videre renset ved hjelp av en HiTrap Q HP 5 ml anion-byttekolonne (GE Healthcare). Proteinet ble eluert ved en 150-500 mM NaCl-gradient i 25 mM Tris-HCl pH 7,1 og 5 mM DTT. For apo-Anamorsin ble 2FE-2S klynge fjernes ved fremgangsmåten beskrevet av Kennedy og Beinert [28]. Singelen klynge språk mutanter av Anamorsin (C1 og C2) ble utviklet ved å erstatte hver av de 4Cys klase ligander med Ser ved seterettet mutagenese.
UV-Vis absorpsjon spektroskopi overføre kinetikk
Absorpsjon spektra ble registrert 300-800 nm på et Cary 50 spektrofotometer (Varian) med en temperaturstyringsenhet innstilt på 37 ° C ved anvendelse av en 1 cm banelengde kyvette. Spektra ble oppnådd under aerobe betingelser, med mindre annet er angitt. Forholdet mellom absorbans ved 423 nm (karakteristisk for 2FE-2S klynge (e) av Anamorsin) til 458 nm (NEET 2FE-2S klynge signatur peak) ble overvåket som klynge overføring progresjon. Omfanget av klyngen overføringsreaksjonen blir bestemt og plottet er beskrevet tidligere [23] med ligningen: Overfør Progress (%) = (R
obs-R
initial) /(R
finale R
initial) x100%, hvor R
første er 423/458 nm absorbans forhold ved tid 0, R
obs er 423/458 nm forholdet på et gitt tidspunkt, og R
endelige er IS den 423/458 nm forholdet for fullstendig overføring. R
innledende for overføring fra NAF-en og MNT er 0,78. R
startverdier for overføring fra NAF-en H114C mutant og MNT H87C mutant er henholdsvis 0,93 og 0,90. Den 423/458 nm ekstinksjonsforhold på renset holo-Anamorsin, C1 mutant og C2 mutant (1,04, 1,03, henholdsvis 0,99) ble anvendt som verdiene for fullstendig overføring (R
final). For overføringsreaksjoner, apo-Anamorsin ble pre-inkubert med 2,5 mM DTT i 60 minutter for å sikre reduksjon av dets cystein tiolgrupper. Kinetiske målinger ble utført ved hjelp av ekvimolare konsentrasjoner av NAF-en eller MNT til apo-Anamorsin (en NEET med to 2FE-2S klynge per Anamorsin) i 50 mM Bis-Tris pH 7,0, 100 mM NaCl, 2,5 mM DTT mindre annet er oppgitt er oppgitt. Apo-Anamorsin og DTT ble preinkubert i 60 minutter før tilsetningen av NEET protein.
Biolag interferometri
Kinetics av apo-Anamorsin interaksjon med NAF-1 eller mnt ble målt på en oktett Red96 instrument (ForteBio). Apo-Anamorsin ble biotinylert ved inkubering i 30 minutter med EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin (Thermo Scientific) ved et 2: 1 molart forhold av biotinylering reagens og protein så bufferbyttet ved hjelp av en PD10 avsaltende søyle (GE Healthcare) i 50 mM bis-tris, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 0,5 mg /ml BSA, 5 mM DTT, pH 7,0. 3,5 mikrometer biotinylert Anamorsin ble immobilisert til streptavidin biosensorer (ForteBio). De fylte biosensorer ble ekvilibrert i den samme buffer uten DTT. Foreningen ble målt over 900 sekunder. Foreningen bestemmes av bølgelengdeforskyvning (nm). Etter forening, ble dissosiasjon bestemt ved overføring av biosensoren spissen for å bufre uten NEET protein i en periode på 1800 sekunder. Kontroller for ikke-spesifikk binding for hver NEET konsentrasjon ble kjørt uten lasting til biosensoren og subtrahert fra de tilsvarende bindingsdata. Data ble passer til en 1: 1 modellen for binding til apo-Anamorsin og en 2: 1 heterogene ligand-modell for binding til holo-Anamorsin ved hjelp av Oktett programvare. Dataene ble plottet ved hjelp Kaleidagraph (Synergy Software).
Forberedelse av post-cluster overføring Anamorsin for massespektrometri og biolag interferometri
25 pm apo-Anamorsin i 50 mM Bis-Tris pH 7,0 og 100 mM NaCl ble pre-inkubert med 2,5 mM DTT i 60 minutter. 27,5 uM NAF-1 ble deretter tilsatt og reaksjonsblandingen ble inkubert i en orbital ristemaskin ved 37 ° C i 3,5 timer. Etter at reaksjonen holo-Anamorsin ble renset fra NAF-en ved hjelp av en HiTrap Q HP 1 ml anion-utvekslingskolonne. Proteinet ble eluert ved en 150-500 mM NaCl-gradient i 25 mM Tris-HCl pH 7,5. Prøver for massespektrometri var buffer byttet inn 10 mM ammoniumacetat pH 7,5 buffer ved hjelp av Hurtig Spin Protein kolonner (Roche).
Elektro ionisering massespektrometri
Anamorsin prøver i 10 mM ammoniumacetat pH 7,5 med en konsentrasjon av ~ 1 mg /ml ble fortynnet 100 ganger i 50% metanol med 0,5% eddiksyre og injisert i et Quattro Ultima trippel kvadrupol-system (Waters). Spectra ble kjøpt i positiv ion modus med en m /z rekke 500-2000. Mass deconvolution ble utført ved hjelp av MassEnt1 verktøy i Mass MassLynx programvarepakken.
Resultater
NAF-en eller MNT kan overføre sine oksidert 2FE-2S klynger til apo-Anamorsin
Anamorsin har to 2FE-2S bindingsseter, hver med en ferredoxin lignende 4-Cys klynge ligation som skiller seg fra de NEETs (3Cys: 1His). Denne forskjellen i ligeringen gir det en UV-Vis-absorbans spektrum som er forskjellig fra de neet proteiner, hovedsakelig i 400-500 nm området. I denne regionen Anamorsin har absorpsjonstopper ved 423 og 458 nm, mens både NAF-en og MNT har bare en topp på 458 nm (Fig 1). Vi har fastslått den molare ekstinksjonskoeffisient av den Anamorsin 2FE-2S klynge topp ved 458 nm for å være 5800 M
-1cm
-1 per klynge, mens det av de NEETs er 5000 M
-1cm
-1 per klynge [29]. Vi bruker forholdet mellom 423 nm til 458 nm for å overvåke overføringen av 2FE-2S klynger fra MNT eller NAF-1 til apo-Anamorsin. Som overføringen skjer forventer vi at 423 nm toppen å stige, og dermed en økning i 423/458 ratio. I motsetning til dette tap av gruppen til løsningen ville resultere i fullstendig tap av synlig absorbans i 400-800 nm området [19] i. For å fremstille proteinet for 2FE-2S klynge overføringsstudier blir de frie cysteinene av apo-Anamorsin reduseres ved pre-inkubering med DTT i 60 minutter for å sikre at de er klare for klynge ligering. Den første skanning ved initieringen av overføringen viser en oksydert NEET spektrum, noe som indikerer at det meste av DTT er oksidert. Redusert DTT vil redusere neet klynger [30], som hemmer overføring [23]. Deretter NAF-1 eller mnt ble tilsatt til pre-redusert apo-Anamorsin og klyngen overføring Reaksjonen ble overvåket ved UV-Vis-spektrofotometri. Støkiometri NAF-en eller MNT til apo-Anamorsin ble valgt for å gi en 2FE-2S klynge per Anamorsin som det ble tidligere rapportert at både cluster bindingsseter kan ikke samtidig rekonstituert [24, 27]. Under oksidasjons vilkår overføre inntektene fra både NAF-en og MNT uten tap av klynger til løsning og data er godt skikket til en enkelt eksponentiell fase (fig 2). NAF-en overføring satte til ferdigstillelse, mens MNT overført ~ 80% av sine klynger som viser effektiv overføring fra enten NEET protein til Anamorsin. Skanner på utvalgte tidspunkter kan sees i S1 fig. Redusert DTT har vist seg i noen tilfeller å formidle klynge overføring [31]. For å teste om dette var tilfelle for NEET-Anamorsin ble DTT fjernet fra apo-Anamorsin følgende 60 min inkubasjon med denne agenten. Den DTT gratis apo-Anamorsin er lett i stand til å motta neet klynger (S2 Fig). Dette indikerer at NEET-Anamorsin klynge overføring er en utelukkende protein-mediert hendelse.
A. (Til toppen) Crystal strukturer av MNT (PDB kode: 2QH7,), NAF-en (PDB kode: 3FNV); (Midt) NEET 2FE-2S klynge med tre-Cys: 1His koordinering; (Bottom) Absorpsjon spektra av 25 mikrometer MNT og NAF-en. B. (toppen) Krystallstruktur av det N-terminale domenet av Anamorsin (PDB-kode: 2YUI) med en ekstra skjematisk riss av den ustrukturerte 2FE-2S klynge bindende domene; (Midt) Representant Anamorsin 2FE-2S klynge med 4-Cys samordning (fra ferredoxin, PDB kode: 1RFK); (Bottom) Absorpsjon spekteret av 43 mikrometer Anamorsin isolert fra
E
.
coli
.
2F-2S klynge overføring reaksjonen ble overvåket av UV-Vis absorpsjon spektroskopi. Forløpet av overføringen ble plottet mot tid. Cluster overføring fra NAF-1 (A) og MNT (B) til apo-Anamorsin oppstår bare når 2FE-2S klyngen er oksidert og ikke når redusert med 10 mm natriumditionitt. Utskifting av koordinerende Hans rest med Cys (H114C for NAF-en og H87C for MNT) hemmer, men ikke avskaffe overføring. Alle spor viste oppnådd med 25 uM NAF-1 eller mnt (50 uM 2FE-2S klynger) og 50 uM apo-Anamorsin i 50 mM bis-tris, 100 mM NaCl, 2,5 mM DTT, pH 7.0 ved 37 ° C.
Vi testet videre om 2FE-2S klynge overføring fra neet proteiner til apo-Anamorsin var avhengig av oksidasjonstilstanden til klyngen som vi fant i tidligere studier med klynge overføring til apo-ferredoxin [22, 23]. Den reduserte NEET spekteret har to tydelige topper (S3 Fig), i motsetning til særpreg spekteret av redusert Anamorsin [27]. Når NEET 2FE-2S klynge er pre-redusert med natriumditionitt noen overføring til apo-Anamorsin ble observert (figur 2). Dette funnet viser at NEET klynge overføring til Anamorsin krever oksydert 2FE-2S klynger som vi tidligere funnet for overføring fra neet proteiner til apo-ferredoxin, så vel som observeres for overføring fra jern-svovel sammenstilling protein ISCU til apo-Fd [32] .
Vi har i tillegg testet betydningen av singelen hans ligand av mNT og NAF-en for effektiv klynge overføring. Utskifting av de koordinerende His-restene med Cys i NAF-1 (H114C) og i MNT (H87C) hemmet overføring til apo-ferredoxin [22, 23, 33, 34]. Spektrene til NAF-1 H114C mutant og MNT H87C mutant kan sees i S4 fig. Tilsvarende finner vi at klyngen overføring til apo-Anamorsin ble også hemmet av mer enn 10 ganger i disse mutantene (fig 2).
overføringshastigheter på neet proteiner er lik de kjente menneskelige cluster-overføring proteiner
overføring av 2FE-2S klynger til apo-akseptor proteiner har blitt beskrevet som andre orden [32, 35]. Vi testet derfor klynge overføring fra MNT eller NAF-1 til apo-Anamorsin ved forskjellige konsentrasjoner av de neet dimer-donorer (3,13 uM, 6,25 uM, 12,5 uM og 25 uM). Den observerte hastighet for hver konsentrasjon (k
obs) var lineært avhengig av proteinkonsentrasjonen NEET (figur 3). Den tilsynelatende andreordens hastighetskonstant (
k
2) for hvert ble bestemt ut fra den lineære passer til k
obs verdier.
k
2 verdiene som er beregnet for NAF-en og MNT er 600 ± 90 M
-1 min
-1 og 460 ± 60 M
-1 min
-1 respektivt, som er tilsvarende for å gi konstanter som er målt for den humane 2FE-2S klynge overføringsproteiner ISCA og ISCU [32, 35] (tabell 1). Overføringshastigheter på noen 2FE-2S overførings proteiner blir forsterket av ATP-avhengige anstand. IscU fra
Azotobacter vinelandii
i nærvær av det HscA /HscB cochaperone system og nødvendige kofaktorer overføringer med en rapportert hastighetskonstant som bare er litt større enn for de neet proteinene [36] (tabell 1). En ytterligere likhet mellom NEETs og ISCU er kravet for oksydasjon av 2FE-2S klynge for overføring [32]. Tatt sammen, NEETs overføringen så effektivt som ISCU og kan forventes å fungere på en tilsvarende måte.
NAF-1 (A) og MNT (B) overføring til apo-Anamorsin ble overvåket ved UV-Vis-absorpsjonsspektroskopi for en serie av neet konsentrasjoner. For hver NEET konsentrasjon forholdet 1 NEET dimer per 2 apo-anamorisn ble opprettholdt. Hastighetskonstanten, k
obs, bestemmes ut fra tilpasning av dataene til en eksponentiell stigning, og blir plottet mot konsentrasjonen til NAF-1 (C) eller mnt (D). Helningen av linjen beste tilpasning ble anvendt for å bestemme tilsynelatende andre ordens hastighetskonstanter (
k
2) for NAF-1 og MNT, som er 600 ± 90 M
-1 min
-1 og 460 ± 60 M
-1 min
-1 hhv.
Her viser vi at 2FE-2S klynger overføres til Anamorsin fra neet proteiner. For å møte muligheten for at NEETs er rett og slett leverandører av jern og sulfid via en utgivelse og fangst mekanisme, utførte vi transfer i nærvær av EDTA (en jernbindende som sequesters fritt jern og dermed hemmer klynge montasje). Mens fritt jern og sulfid kan spontant danne klynger på Anamorsin [24, 27], opphever EDTA forsamlingen. Imidlertid overføre fra hver av de NEETs til Apo-Anamorsin foregår effektivt i nærvær av EDTA (S5 Fig). Derfor NEETs rolle i denne prosessen er mer enn bare å levere jern og sulfid og direkte interaksjon er nødvendig for effektiv overføring.
NAF-en eller MNT bind direkte til apo-Anamorsin
For å undersøke potensialet for protein-protein interaksjon mellom neet proteiner og Anamorsin vi ansatt biolag interferometri (BLI). Både NAF-en og MNT bundet direkte til immobilisert apo-Anamorsin. Foreningen og dissosiasjon kurvene er vist i figur 4. On (
k
på) og off-priser (
k
av) målt for hver interaksjon er vist i Tabell 2. On-priser for NAF-en og mNT variere med en faktor på to, mens off-rate på NAF-en er ~ 18 ganger raskere enn for mnt. Vi analyserte også bindingen av holo-NEETs til holo-Anamorsin (S6 Fig).
Sensorgrams for binding av holo-NAF-1 (A) og holo-MNT (B) til biotinylert apo-Anamorsin immobilisert til streptavidin-belagte biosensorer vises. Foreningen ble fulgt i 900 sekunder (stigende signal) etterfulgt av 1800 sekunder av dissosiasjon (råtnende signal). Dataene var egnet til en en-til-en modell (svarte kurver). On-og off-priser ble bestemt ut fra de passer for hver NEET-Anamorsin konsentrasjon (vist i tabell 2).
NEET proteiner kan overføre til hver av de Anamorsin cluster-bindingsseter
Anamorsin har to 2FE-2S klasebindingsseter og
in vitro
kjemisk oppløsning viste at hver klynge nettstedet kan rekonstitueres men klynge binding var gjensidig utelukkende [27]. Vi viser til det første området som C1 og andre som C2 (fig 5A). Anamorsin mutanter som inneholder bare en enkelt klynge-bindingssetet ble produsert der alle fire cysteinrester fra det andre området ble erstattet med seriner å teste for mulig fortrinnsrett overføring fra MNT eller NAF-en til apo-Anamorsin. Absorpsjonsspekteret av hver mutant kan sees i S7 fig. Som vist i figur 5, hvert Anamorsin mutant mottatte klynger fra hver donor NEET protein som viser liten preferanse for overføring til enten C1 eller C2 akseptorseter
Anamorsin mutanter inneholdende en enkelt klynge-bindingssete er vist.; den andre gruppen området ble avbrutt ved å erstatte alle de Cys-rester med Ser. (A) Skjematisk av Anamorsin-C1 (grønn) og Anamorsin-C2 (magenta) er vist. 2FE-2S klynge overføring fra NAF-1 (B) eller mnt (C) til hver enkelt klynge binding apo-Anamorsin mutant ble overvåket ved UV-Vis-absorpsjonsspektroskopi. Spor ble oppnådd med 25 mikrometer NAF-en eller MNT (50 pm 2FE-2S klynger) og 50 mikrometer apo-Anamorsin.
NAF-1 homodimerer kan levere både 2FE-2S klynger til Anamorsin
Gitt de ovennevnte resultatene, bestemte vi oss for å teste om enten en enkelt NEET homodimer kunne levere 2FE-2S klynger både C1 og C2 akseptorseter av en enkelt apo-Anamorsin. Cluster overføringen ble målt for NAF-en med støkiometrisk donor klynge for å akseptorseter (50 M NAF-en dimer og 50 pm apo-Anamorsin) (figur 6a). Vi fokuserte på NAF-en fordi bare NAF-en viste fullstendig overføring med overflødig apo-Anamorsin (fig 2). Overføring av ~ 1,5 2FE-2S klynger pr Anamorsin ble overraskende funnet viser at minst halvparten av de Anamorsin proteinene aksepterte to grupper etter inkubasjon med NAF-1. Vi observerte ingen tap av klyngen til løsning (spektrale amplitude). Ettersom data er vel skikket til en enkelt eksponentiell fase, er begge grupper overføres i kinetisk utvisket trinn. Den enkleste forklaringen er at begge grupper overføres i en enkelt bindende arrangement, selv om de kan ha litt forskjellige priser på grunn av forskjellig aminosyresammensetning rundt de to Anamorsin cluster-bindingsseter. Den ufullstendig overføring kan skyldes dannelse av intramolekylære disulfidbindinger i apo-Anamorsin eller muligens på grunn av modifiserte cystein-sidekjeder i apo-Anamorsin. Den tidligere ble foreslått tidligere for ufullstendig overføring fra ISCU til apo-ferredoxin [32]. For å bekrefte dannelsen av fullt opptatt holo-Anamorsin følgende overføring fra NAF-en vi brukte electrospray ionisering massespektrometri (ESI-MS). Holo-Anamorsin dannet ved en overføringsreaksjon med NAF-1 ble renset fra NAF-en ved hjelp av anionbytterkromatografi. Den resulterende holo-Anamorsin ble analysert ved ESI-MS. I tillegg kjøpte vi ESI-MS spektra for apo-Anamorsin og Anamorsin som det ble renset fra
E
.
coli
. De resulterende spektra er vist i figur 6B. Den forventede masse for apo-Anamorsin konstruere er 35614 Da og forventet masse av en 2FE-2S klyngen er 176 Da. Vi finner at Anamorsin renset fra
E
.
coli
er overveiende inneholder en enkelt klynge, mens hovedandelen av post-overføring Anamorsin inneholder to 2FE-2S klynger; tidligere kjemisk oppløsning rapportert klynge belegg for å være gjensidig utelukkende [27]. Dette resultatet viser nødvendigheten av direkte overføring for å aktivere Anamorsin.
(A) 2FE-2S overføring fra 50 mikrometer dimere NAF-1 til 50 pm Apo-Anamorsin (to 2FE-2S klynger per Anamorsin) (vist i rød) blir sammenlignet med 25 uM NAF-1 til 50 uM apo-Anamorsin (en 2FE-2S klynge per Anamorsin) (vist i blått). Transfer er nær komplett for en 2FE-2S klynge per Anamorsin prøven og er ca 75% ferdig for to 2FE-2S klynge per Anamorsin prøve. Det siste resultat viser at minst halvparten av Anamorsin er i stand til å motta to 2FE-2S klynger fra en enkelt NAF-en homodimer. (B) Anamorsin etter en overføringsreaksjon med NAF-1 ble renset og analysert ved ESI-MS (vist i rødt). Massespektra av apo-Anamorsin (heltrukket svart linje) sammenlignes med den hovedtopp for post-transfer Anamorsin (fast rød linje) som viser en økning i massen som svarer til innlemmelse av to 2FE-2S klynger. Det er også en mindre topp ved 35 856 Da som sannsynligvis tilsvarer Anamorsin med en enkelt 2FE-2S klynge og en jern ion bundet som kan være en rest av en klynge som nedbrytes i løpet av prøveprepareringsprosessen.
E
.
coli
-purified Anamorsin er vist for sammenligning (stiplet linje) som viser Anamorsin inneholder en enkelt 2FE-2S klynge.
Diskusjoner
I denne studien har vi identifisert Anamorsin som det første mennesket 2FE-2S klynge akseptor protein for både OMM kreft relatert mNT og NAF-1 proteiner. Nylig Ferecatu
et al
. [37] bestemt at MNT kjøper sine 2FE-2S klynger fra mitokondrie ISC system. Våre resultater viser at når innhentet, MNT (og NAF-1) kan overføre sine 2FE-2S klynger til Anamorsin og gir dermed en veldefinert sti fra ISC til CIA via den ytre membran tethered MNT (Fig 7).
mNT på OMM og NAF-en på MAM motta 2FE-2S klynger som produseres inne i mitokondriene av ISC system. Både MNT og NAF-en overføring disse 2FE-2S klynger til Anamorsin. Anamorsin mottar elektroner fra diflavin reduktase NDOR1 og leverer dem til CIA systemet som et tidlig trinn nødvendig for produksjonen av 4Fe-4S klynger. Dette trinnet krever holo form av Anamorsin. Både MNT og NAF-en kan gi parallelle ruter knytte CIA til ISC. CIA produsert klynger er målrettet mot proteiner i cytosol og kjernen og er viktig for celle metabolisme, vedlikehold og spredning.
Anamorsin, som er en viktig del av CIA, havner to Fe-S klynge -binding nettsteder, og vi fant ut at mNT eller NAF-en kan overføre 2FE-2S klynger både klase-bindingssteder. De neet proteiner kan levere alle nødvendige klynger for aktivering Anamorsin for sin elektronoverføringsfunksjon. Dette knytter nå nødvendigheten av mitokondrie Fe-S klynge montasje med funksjonen av cytosoliske CIA [37, 38].
NEET beliggenhet ved OMM /MAM og deres klynge transferfunksjon likheter med ISCU tyder på at de kan være en del av en vei som forbinder mitokondrie 2FE-2S enheten til CIA-systemet. Mens Ferecatu
et al
. viste at knockdown av MNT ikke har en betydelig innvirkning på modningen av CIA-avhengige Fe-S proteiner [37], viser vi at NAF-en er mer effektiv ved å overføre til apo-Anamorsin og kan være en parallell rute til CIA .
egenskapene til neet proteiner tyder på at i tillegg til mitokondrie 2FE-2S transport, de fungerer som reservoarer slik 2FE-2S klynger som skal monteres under gunstige forhold inne i mitokondriene og lagres for raskere tilgjengelighet når cytosolic 2FE -2S klynger er nødvendig. Dette vil gi raskere respons på umiddelbare behov enn det som ville være mulig hvis mitokondrie montering og transport gjennom to membraner til cytosoliske proteiner. Til støtte for denne funksjonen, ble MNT nylig funnet å montere /reparere 4Fe-4S klynge av cytosolisk jern regulatorisk protein 1 (IRP1; cytosolic aconitasen) etter oksidativ skade [37]. Dermed NEETs kan fungere i transport av 2FE-2S klynger av mitokondriene, så vel som et reservoar av lett tilgjengelige 2FE-2S klynger.
NAF-1, mnt og Anamorsin har hver blitt implisert i kreft [15 , 39-41]. Begge neet proteiner er over-uttrykt i epitelceller brystkreftceller, og redusere deres uttrykk via shRNA knockdowns resulterer i redusert kreftcelle spredning og redusert tumorvekst. Som Fe-S-proteiner er viktig for DNA-replikasjon og cellevekst, behovet for rask tilførsel av Fe-S-grupper praktisk forbinder neet proteinene til kreftcelle proliferasjon. Videre er gjær homolog av Anamorsin (Dre2) som er nødvendig for montering av de diferric-tyrosyl radikal kofaktor av ribonukleotid-reduktase [42], som er nødvendig for produksjonen av deoksynukleotider. En begrenset tilgjengelighet av deoksynukleotider vil også inhibere DNA-replikasjon og således kreftcelle-proliferasjon. Rettet mot neet proteiner kan være en praktisk måte å kontrollere mange prosesser som er nødvendige for akselerert spredning av kreftceller med mulighet for å modulere bruker lite molekyl målretting av neet proteiner [43].
I denne studien, vi gir en veldefinert kobling mellom ISC og CIA systemer via mNT og NAF-en, som er de eneste kjente 2FE-2S proteiner assosiert med OMM. Vi viser at neet proteiner kan overføre begge sine 2FE-2S klynger via en direkte protein-protein interaksjon for å aktivere den essensielle CIA protein, Anamorsin.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig.
