Abstract
Bakgrunn
Protein kinaser er viktige regulatorer av celleprosesser (for eksempel spredning, apoptose og invasjon) som ofte deregulerte i kreft hos mennesker. Følgelig har kinase gener vært den første til å bli systematisk analysert i humane svulster som fører til oppdagelsen at mange onkogener tilsvarer muterte kinaser. I de fleste tilfeller de genetiske endringer sette konstitutivt aktive kinase proteiner, som er mottagelig for terapeutisk målretting. Svulster i bukspyttkjertelen er aggressive svulster som det ikke effektiv terapeutisk strategi er tilgjengelig for øyeblikket.
Metodikk /hovedfunnene
Vi har utført en DNA-sekvensanalyse av et valgt sett av 35 kinase gener i en panel av 52 bukspyttkjertelen eksokrine svulster, inkludert 36 pancreatic ductal adenokarsinom, og 16 ampulla av Vater kreft. Blant andre endringer fant vi somatiske mutasjoner i
ATM
,
EGFR, EPHA3, EPHB2
, og
KIT
, noe som ble beskrevet tidligere i kreft.
Konklusjoner /betydning
Selv om endringene er identifisert behov for ytterligere eksperimentell evaluering, lokalisering innenfor definerte proteindomener indikerer funksjonell relevans for de fleste av dem. Noen av de muterte gener, inkludert de tyrosin kinaser
EPHA3 Hotell og
EPHB2
, er klart mottagelig for farmakologisk intervensjon og kunne representere nye terapeutiske mål for disse uhelbredelige kreft.
Citation : Corbo V, Ritelli R, Barbi S, Funel N, Campani D, Bardelli A, et al. (2010) mutasjons Profilering av kinaser i Human Svulster av bukspyttkjertelen Origin Identifiserer Kandidat kreftgener i Ductal og ampulla av Vater karsinomer. PLoS ONE 5 (9): e12653. doi: 10,1371 /journal.pone.0012653
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: Mai 20, 2010; Godkjent: 12 august 2010; Publisert: 08.09.2010
Copyright: © 2010 Corbo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC, https://www.airc.it/), Fondazione CariParo (www.fondazionecariparo.it), Fondazione Monte dei Paschi di Siena (https://www.fondazionemps.it /); Italian Ministry of Health, Roma, Italia (https://www.salute.gov.it/); EU FP VI Program Grant PL018771 (MolDiagPaca, https://www.moldiagpaca.eu/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Protein kinaser er viktige regulatorer av forskjellig og komplekse cellulære prosesser som cellesyklusprogresjon, differensiering, apoptose og invasjon [1] – [4]. Proteinkinasen komplement (definert som «kinome») representerer en betydelig andel av det humane genom, og nylig Manning
et al
. organisert den inn i en dendogram inneholder ni brede grupper av gener [5]. Endringer i en kinase-gen, kan føre til en avvikende proteinaktivitet, som kan ha en rolle i kreft initiering og progresjon [6], [7]. Disse endringene, inkludert punktmutasjoner og slettinger i konserverte domener, ofte resultere i konstitutivt aktiverte kinaser, som er potensielle terapeutiske mål for kreftbehandling. Faktisk er det flere små molekyl hemmere i bruk eller blir vurdert i kliniske studier [8] – [10]. Mutasjoner i en kinase-genet, kan også resultere i dets inaktivering, som for gener som er involvert i opprettholdelse av genomstabilitet [11], [12] eller kontrollere celle-celle-kommunikasjon [13]. I de senere år har omfattende sekvensanalyse av tumor genomer og særlig av kinase-genfamilien er utført i forskjellige epiteliale tumorer som fører til identifisering av forskjellige somatiske mutasjoner [14] – [22]. Disse arbeidene peker til en undergruppe av kinase gener med kjent eller potensielt forhold med solid tumor utvikling, som de viser en relativt høy frekvens av mutasjoner.
For å bestemme tilstedeværelsen av mutasjoner potensielt relevante som terapeutiske mål, gjennomførte vi en DNA-sekvensanalyse av et valgt sett av kinase-gener i et panel av to forskjellige pankreatiske neoplasmer, inkludert pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC), og ampullen av Vater kreft (AVC). For disse tumortyper ingen effektive terapeutiske midler for tiden er tilgjengelige [23], [24]. For eksempel, er PDAC meget aggressiv og motstandsdyktig mot konvensjonelle og målrettede terapeutiske midler, noe som resulterer i en sturen 5 års overlevelse på 3% til 5% [24]. Her presenterer vi mutasjons profilen til 35 gener som tilhører kinase genet familier i PDAC og AVC. Spesielt fant vi ikke synonyme mutasjoner i følgende gener:
ATM, BRAF, EGFR, EPHA3, EPHB2, erbB2, FGFR2, KIT
, og
PIK3CA
. Blant disse endringene, det var både godt karakterisert mutasjoner og mutasjoner som påvirker aminosyre som ikke tidligere er funnet å være mutert i humane kreftformer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
All forskning omfatter mennesker deltakere ble godkjent av universitet og sykehus stiftelsens Institutional styret. Informert samtykke ble innhentet skriftlig fra levende pasienter eller pårørende for alle vev som brukes i denne studien.
Prøver
Panelet av 52 kreft i bukspyttkjertelen prøver ble innhentet fra svulsten banken opprettholdes ved Institutt for patologi, Seksjon for Anatomisk patologi, Universitetet i Verona (Verona, Italia), med unntak av seks av pankreas adenokarsinom prøver som er levert av Dr. Daniela Campani (Universitetet i Pisa). Prøvene ble samlet i henhold til de etiske krav og reguleringer av gjennomgang styrene i både University of Verona (Verona, Italia) og Universitetet i Pisa (Pisa, Italia). Dette panelet inkluderte 36 PDAC og 16 AVC (se utfyllende tabell S1 for detaljert klinisk informasjon til kreftprøver). De 23 PDAC tumorer ble dyrket in vitro som cellelinjer eller i naken mus som xenografter for å fjerne kontaminerende ikke-neoplastiske celler [25]. Cellelinjer ble høstet etter maksimalt seks
in vitro
passasjer for nukleinsyre forberedelser. Tretten PDAC prøvene ble tidligere beskrevet menneskelige bukspyttkjertelen tumor cellelinjer [26] (se utfyllende tabell S2 for detaljer). Vevsprøver beregnet til å inneholde mer enn 80% av tumorcellene ble anvendt. Genomisk DNA ble isolert ved anvendelse av Dneasy blod og vev kit (Qiagen, Milano, Italia). Matchet normal DNA ble brukt til å bestemme om de identifiserte mutasjoner var somatisk eller germline. Ingen matchet normal prøve var tilgjengelig for de 13 etablerte cellelinjer som er inkludert i studien. Genomisk DNA ble ytterligere isolert etter cryostat berikelse fra frosne vev av primær PDAC å bekrefte mutasjonene til slutt identifisert i de tilsvarende xenopodet svulster.
Genes, PCR og sekvense
Trettifem gener som hører til proteinkinase genfamilien ble valgt på bakgrunn av deres høye frekvensen av mutasjoner i andre enn pankreatisk kreft hos mennesker som målt i tidligere arbeider [14] – [22]. Disse genene var:
akt2, ATM, ATR, AURKC, BRAF, BRD2, DDR1, DYRK2, EGFR, EPHA3, EPHA5, EPHB6, EPHB2, erbB2, ErbB4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT1, FLT3, FRAP1 , KDR, KIT, MAP2K4, MET, NTRK2, NTRK3, PAK4, PDGFRA, PDPK1, PI3KCA, RPS6KC1, STK11, TGFBR2
. Primere for forsterkning og sekvensering av DNA ble utformet med Primer3 program (https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) og refererer til Nasjonalt senter for Bioteknologi Information (NCBI, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov) referansesekvens filer med Gene og transkripsjon ID (RefSeq) gitt i supplerende tabell S3. PCR-primere ble utformet for å forsterke de valgte eksonene og de flankerende sekvensene intronic, inkludert spleising donor og akseptor regioner. PCR-produktene ble ~400 bp i lengde, med flere overlappende amplimers for større eksoner. PCR-forhold, rensing, og direkte sekvensering har tidligere blitt beskrevet [14].
Dataanalyse
Sequence forskjeller til NCBI referansesekvensen ble identifisert via manuell inspeksjon av innrettede electropherograms assistert av Mutation Surveyor programvarepakke (SoftGenetics, State College, PA). Den genetiske endringer identifisert ble kryss-referert til variant informasjon fra NCBI SNP database, Ensemble Genome Browser (https://www.ensembl.org), The Swiss-Prot (https://ca.expasy.org) og genbanken databaser https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank), den kosmiske database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), og litteratur. I tillegg til ikke synonymt genetiske forandringer, vi har oppdaget mange tause sekvensvariasjoner som ble analysert ved hjelp av ASSP (https://www.es.embnet.org/~mwang/assp.html) sekvensanalyse verktøy for å utelukke at kryptiske skjøter sider kan aktiveres. Disse tause mutasjoner er ikke presentert og videre analysert her. All ny sekvens data har blitt deponert i GenBank.
Resultater og Diskusjon
Vi utførte en mutasjons profilering av 35 kinase gener i et panel av 36 PDAC, og 16 AVC, inkludert primære svulster, xenografter og cellelinjer. For hvert gen ble alle eksoner i hvilken somatisk mutasjon var blitt tidligere identifisert analysert. Ekson-spesifikke primere ble konstruert for å amplifisere og sekvens det kodende område, og minst 15 intronic baser på både 5 «og 3» ender, inklusive skjøt donor og akseptorseter. Totalt 8,321 PCR-produkter, som strekker seg over 3 Mb for tumor genomisk DNA, ble samlet og utsatt for direkte sekvensering. Av de 147 exonene ekstraherte, 92% innredet god sekvens traser (dvs. mer enn 90% av baser i målområdet hadde en Phred poengsum (definert som -10 [log
10 (rå per-basisfeil)]) av minst 20 i minst tre fjerdedeler av de analyserte prøvene), og derfor ble analysert søker etter spesifikke mutasjoner. Endringer tidligere beskrevne som enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs), ble utelukket fra videre analyse. For å sikre at det til slutt observerte mutasjoner ble ikke PCR-sekvensering eller gjenstander, amplikonene ble uavhengig gjen forsterkes og re-sekvensert i de tilsvarende tumorer. Alle verifiserte endringer ble resequenced parallelt med den samsvarende normal DNA, for å skille mellom somatiske mutasjoner og SNP’er ikke tidligere er beskrevet.
Denne tilnærmingen førte til identifisering av i alt 10 forskjellige ikke-synonyme mutasjoner (tabell 1) . Blant disse mutasjonene, ni var missense; en var en liten innføring, mens ingen mutasjoner ble funnet i spleiseseter eller UTR regioner (Tabell 1).
Med hensyn til PDAC vi analysert totalt 36 prøver, 13 av disse ble etablert celle linjer. I alt 7 ulike missense mutasjoner som påvirker disse genene ble funnet:
BRAF, EGFR, EPHA3, EPHB2, FGFR2, KIT, PIK3CA plakater (tabell 1). Av disse mutasjonene
FGFR2
P582L Hotell og
PIK3CA
H1047R ble identifisert i adenokarsinom cellelinjer (PT45 og GER, henholdsvis) som ingen matchet normal prøven var tilgjengelig. Derfor somatisk status for disse mutasjonene ikke kunne fastslås.
PIK3CA
H1047R mutasjon har tidligere blitt knyttet til kreft og omfattende karakterisert [27] – [30]. Selv om mutasjoner av
FGFR2
har tidligere blitt funnet i kreft hos mennesker [16], [31], [32], er det ikke mutasjoner i dette genet er rapportert å være assosiert med bukspyttkjertel kreft til dags dato. Vår karakterisering av etablerte pankreatiske tumorcellelinjer med hensyn til genetiske endringer i denne potensielt kreft målfamilien gir endelig egnede cellesystemer for data tolking, validering mål, samt prekliniske modeller for utvikling av nye målrettet kreftlegemidler.
BRAF
G464V har tidligere blitt knyttet til kreft og karakterisert [33]. Funnet av en
BRAF
mutasjon i PDAC er liksom forventet siden dens tilhørende veien er endret i nesten alle bukspyttkjertelen adenokarsinomer [34], selv om enkelte
BRAF
mutasjoner er ganske sjeldent i denne typen kreft og vanligvis forekommer i tumorer som mangler
KRAS
mutasjoner [35], [36]. Det er interessant at mutasjonen har vi funnet var i homozygot tilstand (figur 1 B), som ikke er forventet for et protein som virker på en dominerende måte. De samme missense somatiske mutasjoner av
EPHB2 plakater (D283H) ble funnet i to forskjellige PDAC prøver (Figur 1a), hvorav den ene også vist en missense mutasjon i
EPHA3 plakater (K207N). De identifiserte mutasjoner i
BRAF Hotell og
EPHB2
ble re-analysert i de tilsvarende primære svulster (Supplementary figur S1) for ytterligere å bekrefte tilstedeværelse av mutasjoner og dermed utelukke at de genetiske endringer kan være konsekvensen av graftet i nakne mus. Spesielt, i den sekvensanalyse av det primære kreft-xenograft tilsvarende 377 (tabell 1) også bekreftet homozygot tilstand av mutasjonen identifisert i
BRAF
genet. EPH reseptorene representerer den største familien av trans-membran tyrosin-kinase-reseptorer og er primært involvert i prosessen med celle adhesjon og migrering under utvikling, homeostase og sykdommer [13], [37]. I denne studien rapporterer vi mutasjons profilen til fire medlemmer av denne familien (
EPHA3
,
EPHA7
,
EPHB2
, og
EPHB6
), som har blitt funnet hyppig mutert eller forstummet i forrige undersøkelse på kreft hos mennesker [13]. For eksempel har mutasjoner av EPHB2 som antagelig føre til tap av aktivitet er funnet i tykk- og prostatakreft [38], [39], mens mutasjoner i
EPHA3
har blitt beskrevet i melanom, lunge og tykktarmskreft [14] – [16], [19]. Så langt, ingen mutasjoner av
EPHB2
har blitt rapportert å være assosiert med kreft i bukspyttkjertelen. Ellers en veldig siste som dypt analysert proteinkodende gener i bukspyttkjertelen adenokarsinomer rapportert forekomst av en intronic punkt mutasjon av
EPHA3 product: [34]. Mutasjonene i
EPHB2
og
EPHA3
vi fant i denne studien lokalisert i evolusjons konserverte Cys-rike ekstracellulære domene som er antatt å være involvert i å bestemme bindingsaffiniteten til deres ligander så vel som den tetramerization av aktiverte reseptorer [40]. Faktisk kan disse aminosyre-endringer (D283H og K207N) påvirker bindingen av reseptorene til deres ligander og derfor muligens forstyrre den normale signalkaskade. Videre er økende bevis tyder på en rolle Efrin reseptor /Efrin system i invasivitet i kreft, så vel som dens potensial relevans for terapeutisk målretting [41]. Mutasjoner av EGFR (L815F) som påvirker den kinase-domenet ble det inneholdes i bare ett av de PDAC prøvene i henhold til den lave forekomst av EGFR somatiske endringer ble funnet i bukspyttkjertelkreft av andre, [42], [43]. Til slutt, rapporterer vi for første gang en somatisk mutasjon i kinase domene KIT (R740K) i PDAC kreft.
KIT
, også betegnet som
CD117
, ofte påvirket av aktive mutasjoner i mage-tarm stromal tumor [44], [45], og dermed representerer en logisk terapeutisk mål for malignitet [46 ]. Selv om flere studier antyder en involvering av KIT i bukspyttkjertelen kreftutvikling, har ingen somatiske mutasjoner er tidligere funnet [47] – [49]
Bottom
, kromatogram av sekvensen av en tumorprøve.;
toppen
, kromatogram av den matchet normal. Pilene viser plasseringen av missense mutasjon. Antall ovenfor sekvens spor er en del av programvaren utgang. Nukleotid-nummerering bruker A av ATG-translasjons-initierings-startsetet som nukleotid 1, basert på referansesekvenser er gitt i tabell Tilsetnings S3. A, mutasjon i PDAC; B, mutasjon i PDAC; C, mutasjon i AVC.
Forkortelser:.
G, genomisk sekvens; p., protein sekvens.
Når det gjelder AVC vi analysert totalt 16 prøver, inkludert 15 primærsvulster og en cellelinje. Vi fant til sammen fire ulike somatiske mutasjoner, hvorav tre var missense og en var en liten innføring, påvirker følgende gener (tabell 1):
ATM, EGFR, EPHA3
, og
erbB2
. Den somatisk mutasjon
ErbB2
V777L er tidligere funnet i kreft hos mennesker [50], [51]. Videre er en grundig analyse av
ErbB2
sekvens elektroferogrammet viste at topp tilsvarende mutasjonen var mindre sammenlignet med dens motstykke villtype (figur 1C). Dette tyder på at forekomsten av denne varianten bare i en subpopulasjon av tumorceller av prøvene. En av de mest interessante forandringer fant vi var innføringen skjer i exon 22 av EGFR som fører til et for tidlig stoppkodon i aminosyre 896 innenfor det katalytiske domenet av proteinet. Denne mutasjonen trenger imidlertid ytterligere evaluering for å avgjøre sin funksjonelle betydning. Interessant,
EPHA3
K207N mutasjon har også blitt påvist i en PDAC prøve. Dette muligens antyder en delvis overlappende spektrum av genetisk forandring underliggende disse ulike kreft i bukspyttkjertelen undergrupper med mindre disse er mutasjoner som oppstår ved en tilfeldighet.
I konklusjonen i denne studien identifiserte vi 10 forskjellige mutasjoner som påvirker 9 kinase gener i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom og ampulla av Vater kreft. Ingen bestemt mønster av somatiske mutasjoner ble identifisert for hver krefttyper og bare en endring (
EPHA3
K207N) viste overlapping mellom tumortyper analysert. I overensstemmelse med resultatene fra tidligere studier observerte vi en lav frekvens av spesifikke somatiske mutasjoner i kinase gener [15], [16], [18] – [22], [34]. Med unntak av
FGFR2 Hotell og
PIK3CA
mutasjoner som påvirket humane tumorcellelinjer, de resterende 8 mutasjoner ble funnet i prøver fra primærsvulster og var somatiske opprinnelse som vurdert av sekvensering av matchet normal DNA (data ikke vist). Med hensyn til PDAC nylig Jones
et al.
Utførte en omfattende genetisk analyse som fører til identifisering av et definert sett med delvis overlappende signalveier som ble endret, til tross for det faktum at forandringer som påvirker den individuelle komponenten varieres innen vide grenser mellom enkelte svulster [34]. Faktisk ingen av de somatiske mutasjoner beskrevet av Jones
et al
ble funnet i våre analyser og omvendt. Våre tidligere og resultatene tyder således på at en lav genetisk analyse for hvert gen kan utføres i en stor serie av pankreas ductal adenokarsinom prøver å løse bidraget av et spesifikt gen i bukspyttkjertelen tumorgenese.
Endelig ingen av endringer vi fant i primære svulster ble beskrevet tidligere i kreft. Disse endringene krever videre eksperimentell evaluering for å bestemme deres funksjonelle relevans og i noen tilfeller kan vise seg å representere passasjer i stedet driver mutasjoner. På den annen side, for lokalisering innenfor definerte proteindomener indikerer funksjonell relevans av de fleste av de genetiske endringer som er identifisert. Videre mutasjonene påvirker gener som er potensielt relevante som mål for farmakologisk intervensjon for disse typer kreft. Det er tilfellet for de mest lovende endringer vi funnet at det påvirker
EPHA3 Hotell og
EPHB2
gener i bukspyttkjertelen adenokarsinom og AVC prøver, tatt i betraktning deres nye rolle som attraktiv terapeutisk mål i kreft [41].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Eksempler på somatiske mutasjoner identifisert i primær PDAC prøver. Kromatogrammene refererer til sekvensen av tumorprøver. A, homozygot mutasjon i BRAF (g.143148 G T, p.G464V). B, heterozygot mutasjon i EPHB2 (g.152108 G C, p.D283H). Pilene viser plasseringen av missense mutasjon. Tall over sekvens spor er en del av programvaren utgang. Den nukleotid nummerering bruker A i ATG oversettelse initiering start nettsted som nucleotide en, basert på referansesekvenser gitt i Utfyllende tabell S3
doi:. 10.1371 /journal.pone.0012653.s001 plakater (1,35 MB TIF)
Tabell S1.
klinisk informasjon om pankreastumorer inkludert i studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0012653.s002 plakater (0,06 MB DOC)
Tabell S2.
Bukspyttkjertelen tumorcellelinjer inkludert i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0012653.s003 plakater (0,03 MB DOC)
tabell S3.
Protein kinase gener og primere som brukes for PCR forsterkning og sekvense
doi:. 10,1371 /journal.pone.0012653.s004 plakater (0,24 MB DOC)
