Abstract
Tidligere studier fra vår gruppe har vist at uttrykket nivåer av Orc6 ble sterkt forhøyet i kolorektal kreft pasientprøver og induksjon av Orc6 var assosiert med 5-fluorouracil (5-FU) behandling. Målet med denne studien var å undersøke molekylære og cellulære virkningene av Orc6 i tykktarmskreft. I denne studien bruker vi HCT116 (wt-p53) og HCT116 (null-p53) tykktarmskreft cellelinjer som modellsystem for å undersøke effekten av Orc6 på celleproliferasjon, kjemosensitivitet og stier involvert med Orc6. Vi demonstrerte at nedregulering av Orc6 sensitizes tykktarmskreftceller til både 5-FU og cisplatin (cis-pt) behandling. Redusert Orc6 uttrykk i HCT-116 (wt-p53) celler ved RNA interferens utløst cellesyklus arrest i G1 fasen. Langvarig inhibering av ekspresjon Orc6 resulterte i flerkjernede celler i HCT-116 (vill-type p53) cellelinje. Western immunoblot-analyse viste at nedregulering av Orc6 indusert p21-ekspresjon i HCT-116 (vill-type p53) celler. Induksjon av p21 ble mediert ved forhøyet nivå av fosforylert p53 i ser-15. I motsetning til dette, er det ingen forhøyet ekspresjon av p21 i HCT-116 (null-p53) celler. Orc6 nedregulering også økt ekspresjon av DNA-skade reparasjon protein GADD45β og redusert ekspresjonsnivået av JNK1. Orc6 kan være en potensiell ny mål for fremtiden anti kreft terapeutisk utvikling i tykktarmskreft
Citation. Gavin EJ, Song B, Wang Y, Xi Y, Ju J (2008) Reduksjon av Orc6 Expression sensitizes Menneskelig Colon Cancer celler til 5-fluorouracil og cisplatin. PLoS ONE 3 (12): E4054. doi: 10,1371 /journal.pone.0004054
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 26 november 2008; Godkjent: 01.12.2008; Publisert: 29.12.2008
Copyright: © 2008 Gavin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Mitchell Cancer Institute kreft genomikk laboratorium oppstart fond til (J. Ju) og NIH CA114043 (J. Ju). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Orc6 er en av de seks opprinnelse anerkjennelse sammensatt protein i humane celler. Det fungerer som det første monteringsplattform som er nødvendig for DNA-replikasjon. Rollene til Orc6 i DNA replikasjon er blitt undersøkt i stor utstrekning i både gjær og Drosophila [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Men det er begrenset informasjon om kreft hos mennesker [7], [8]. Det har blitt rapportert at i tillegg til sin funksjon som en DNA-replikasjon initiator protein, spiller det også en nøkkelrolle i transcriptional gene taushet heterochromatin formasjon [8]. Det er imidlertid ikke klart om initieringskomplekset sammenstillingen ved hvilket trinn det Orc6 deltar [9]. Det har blitt demonstrert elegant ved Prasanth
et al.
Dynamikken i Orc6 lokalisering under hele cellesyklus, inkludert DNA-replikasjon, kromosom regregation, og cytokinese. De foreslår også Orc6 kan fungere i aliserte til cellesykluskontroll [8]. Vår interesse i Orc6 stammet fra våre tidligere studier med en omfattende genomanalyse viste at Orc6 er forbundet med 5-FU forbundet motstand i humane tykktarmskreft cellelinjer [10]. Vår oppfølging studie med kolorektal pasientprøver ytterligere bekreftet at uttrykket av Orc6 er sterkt forhøyet i humane kolorektale svulstvevet i forhold til sammenkoblede normale prøver [11]. Disse resultatene bekrefter den kliniske relevansen av Orc6 fører til vår hypotese om at Orc6 kan være en sentral aktør som er involvert i tykk- og endetarmskreft. Dens forhøyet nivå kan også være en viktig bidragsyter til chemoresistance. p53 er en av de mest hyppig endrede tumor-suppressorer i kolorektal cancer, og på grunn av sin kritiske funksjon i syklusregulering [12], [13]. I denne studien bruker vi et par av tykktarmskreft cellelinjer med enten villtype p53 eller null p53 som vår modell system.
I denne studien gir vi eksperimentelle bevis for at avtagende Orc6 uttrykk av RNA interferens kan sensitiv kolon kreft cellelinjer til to av de store kjemoterapeutika 5-FU og cisplatin behandling. Avtagende Orc6 uttrykk av siRNA knock-down utløst cellesyklus arrest og redusert cellulær proliferasjon i HCT-116 (wt-p53) celler. I motsetning til dette ble denne virkning betydelig svekket i HCT-116 (null-p53) celler. Endring av cellesykluskontroll ved redusert Orc6 ekspresjon var på grunn av induksjon av p21, en større cellesykluskontroll genet. Induksjon av p21 var på grunn av det økte nivået av phosphorylatd av p53 ved Ser-15 utløses av knock-down av Orc6 uttrykk. Orc6 kan være en potensiell ny mål for nye anti tumor terapeutisk utvikling.
Diskusjon
Avtagende Orc6 uttrykk i HCT-116 (wt-p53) celler hemmer celledeling
Resultater og
de økte nivåer av Orc6 i humane tarmkreft prøver ledet oss til å undersøke rollene til Orc6 i cellesykluskontroll og narkotika følsomhet. Ved hjelp av en siRNA knock-down tilnærming, først fikk vi bekreftet at protein nivåer av Orc6 ble redusert ved bruk av Western immunoblot analyse i både HCT (wt-p53) celler (Figur 1A, kjørefelt 1, uspesifikk kontroll siRNA, felt 2, siRNA mot Orc6) og HCT-116 (null-p53) celler (Figur 1A, kjørefelt tre, ikke-spesifikk kontroll siRNA; kjørefelt 4, siRNA mot Orc6). Ekspresjon av Orc6 protein ble redusert med mer enn fem ganger i HCT (vill-type p53) celler, og HCT-116 (null-p53) celler.
α-tubulin ble anvendt som kontroll (A). Økt multinucleation ved å stanse all Orc6 i HCT-116 (wt-p53) celler ved siRNA. Venstre panel, lys image; Høyre panel, DAPI nukleær farging (B).
Det har blitt vist tidligere at knock-down Orc6 i Hela celler indusert polypoidy [8]. Våre resultater bekrefter dette i tykktarm kreft celler, etter gjentatte transfeksjon hver 3. dag, ble HCT-116 (wt-p53) celler med redusert Orc6 uttrykk multinucleated (figur 1B). Denne populasjonen øker med tiden. Chromatin ble farget med 4 «, 6»-diamidino-to-phenylindole (DAPI) for å vise multinucleated celler etter vedvarende Orc6 knockdown av siRNA (venstre panel, lysspredning celle bilde, høyre panel, DAPI nukleær farging bilde i figur 1B). Celleproliferasjon ble redusert med over 50% (åpen bar) med Orc6 knock-down (figur 2). Men reduksjon av Orc6 ekspresjon i HCT-116 (null-p53) celler redusert i celleformering med bare 23% (stiplet strek). For å undersøke effekten av redusert Orc6 i cellesykluskontroll, ble HCT-116 (wt-p53) og HCT-116 (null-p53) celler først transfektert med 100 nM Orc6 siRNA. Transfekterte celler ble eksponert for 10 uM 5-FU i 12 timer. Det ble observert at 12 timer senere, begge styre HCT-116 (vill-type p53) celler og celler med nedsatt Orc6 uttrykkende celler var i stand til å forbli hovedsakelig i G1 fase uten cellesyklus gjeninnføring (figur 3A). I motsetning til dette, HCT-116 (null-p53) kontrollcellene og Orc6 reduserte celler ble på nytt inn i S-fasen av cellesyklusen til tross for den DNA-skade ved 5-FU og Orc6 reduksjon (figur 3B). Disse resultatene tyder på at cellesykluskontroll etter DNA-skade er avhengig av tilstedeværelsen av villtype p53.
Effekt av Orc6 på kjemosensitivitet til 5-FU og cis-pt
for å undersøke den potensielle effekten av Orc6 på kjemosensitivitet til noen av de første linjen kjemoterapeutiske forbindelser som 5-FU og cis-pt i kolorektal kreft, ble HCT-116 (wt-p53) celler brukt som vår modell system ved hjelp av celler transfektert med oligofectamine alene, ikke-spesifikk siRNA, og Orc6 spesifikk siRNA. Celler ble deretter behandlet med 5-FU eller cisplatin med seriell fortynning. Etter 72 timer ble celleformering kvantifisert ved WST-1-assay. Figur 4A viser at HCT-116 (vill-type p53) celler med redusert Orc6 ekspresjon var 5 ganger mer følsom for 5-FU-behandling sammenlignet med kontrollceller basert på IC
50 verdi. HCT-116 (vill-type p53) celler med redusert Orc6 ekspresjon var også mer følsomme overfor cisplatin behandling sammenlignet med kontrollceller (figur 4B). Denne effekten ble i stor grad mangler fra HCT116 (null-p53) celler (data ikke vist).
Down stream signalveier berørt av Orc6
For å begynne å forstå den ned stream signalveier potensielt er involvert med Orc6, ble en høy gjennomstrømning genekspresjon analyse benyttes for å kvantifisere genekspresjon endringer mellom HCT-116 (vill-type p53) celler transfektert med Orc6 spesifikk siRNA og ikke-spesifikk siRNA kontroll. Ekspresjon og GeneOntology analyse viste at en rekke gener ble påvirket av Orc6 inhibering (Data, S1). Basert på våre resultater, ble en rekke kjente cellesyklus kontroll gener bekreftet ved hjelp av Western immunoblot analyse. Våre resultater viste at ekspresjon av p21 var signifikant indusert i HCT-116 (vill-type p53) celler etter Orc6 knock-down (figur 5, felt 1, ikke-spesifikk oligo kontroll, felt 2, siRNA av Orc6). Vi har videre bekreftet at ekspresjon av DNA-skade reparasjon protein Gadd45β ble også indusert ved å redusere Orc6 ekspresjon i HCT-116 (vill-type p53)-celler (figur 5, felt 1, ikke-spesifikk siRNA kontroll, felt 2, Orc6 spesifikk siRNA). Det er godt dokumentert at Gadd45β spiller en viktig rolle i cellesyklus-stans, DNA-reparasjon, medfødt immunitet, vedlikehold av genomstabilitet og apoptose [7], [14], [15], [16]. Funksjonen til Gadd45β formidles gjennom interaksjon med andre proteiner som cdc2 ved å forstyrre samspillet mellom ccd2 og cyclin B1 i utløser G2 /M cellesyklus arrest etter gentoksisk spenning [17], [18]. Våre resultater viste at Gadd45β er i det minste delvis, ansvarlig for DNA-replikasjonsdefekt utløses ved redusert Orc6 ekspresjon i tykktarmskreftceller. Ekspresjon av JNK1 nivået ble nedsatt med redusert Orc6 uttrykket (figur 5). Det er blitt vist at rollene som JNK1 var ganske komplisert på grunn av sin rolle på grunn både apoptotiske og overlevelsessignalveier [19], [20]. Fibroblaster med JNK knockouts er mer følsomme for TNF-indusert apoptose [21]. Muse embryo fibroblaster som mangler MKK7 (oppstrøms aktivator av JNK) gjennomgå mobilnettet senescence og G2 /M vekst arrest, ytterligere støtte vårt funn at redusert uttrykk for JNK1 kan være en av de medvirkende faktorer for G2 /M arrest forårsaket av knock-down av Orc6 uttrykk [22]. Disse endringene var stort sett fraværende fra HCT-116 (null-p53) celler (data ikke vist). Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterte studier som p53 spiller avgjørende rolle i cellesykluskontroll i respons til DNA-skade. Med induksjon av p21-ekspresjon, forventer vi at den etterfølgende ekspresjon av p53 kan økes fordi p21 er en kjent cellesyklus kontrollpunkt kontroll gen mediert av p53. Det totale cellulære nivået av p53-protein ble ikke endret ved knock-down av p53-ekspresjon (figur 6A, felt 1 og 2). Induksjon av p21 var fraværende i HCT-116 (null-p53) celler med Orc6 knock-down (Figur 6A, spor 3, kontroll, felt 4, siRNA av Orc6). Dette indikerer at induksjon av p21 uttrykket må være p53 avhengig tross for fraværet av i det p53-ekspresjon nivå. Selv om den totale p53 nivå ikke økte i HCT-116 (vill-type p53) celler, spekulere vi at nivået av p53 i den nukleære fraksjonen kan økes på grunn av kjente p53 trans event. Ved å skille kjerner og cytoplasma, demonstrerte vi at nivået av total p53-protein i kjernen ikke ble høyere hos HCT-116 (vill-type p53) celler med redusert Orc6 ekspresjon behandlet ved Orc6 spesifikk siRNA (figur 6A). I stedet, ble nivået av fosforylert p53 i ser-15 økte i atomfraksjonen av HCT-116 (vill-type p53) celler med redusert Orc6 uttrykket (figur 6B). Dette er meget forenlig med et godt dokumentert mekanisme av p53 som respons på DNA-skade (14). Fosforylerte p53 i ser-15 rest kan redusere dets interaksjon med negativ regulator, oncoproteinet MDM2.
(A) Western immunoblotanalyse av p53 og p21 ekspresjon etter Orc6 knockdown etter siRNA både i HCT-116 (vill-type p53)-celler (kolonne 1, ikke-spesifikt kontroll, felt 2, spesifikk siRNA for Orc6) og HCT-116 (null-p53)-celler (kolonne 3, ikke-spesifikt kontroll, felt 4, spesifikk siRNA for Orc6) . (B) Western immunoblotanalyse av fosforylert p53-ekspresjon ved Ser-15 i både cytoplasmisk og atomfraksjonen i kontroll HCT-116 (vill-type p53)-celler (kolonne 1, cytoplasmatisk, felt 2, atom) og HCT-116 (vill-type p53 ) celler behandlet med siRNA mot Orc6 (kolonne 3, cytoplasma, kjørefelt 4, kjernekraft). Total p53 protein ekspresjonsnivåer ble anvendt som kontroll protein i atomfraksjoner og α-tubulin ble anvendt som kontroll for cytoplasmiske fraksjoner.
Det synes at DNA-skade reaksjon forårsaket av en redusert Orc6 nivå er mediert gjennom p53 avhengige cellesykluskontroll veien. Vi spekulerer i at høyt nivå av Orc6 i kolorektal kreft kan bidra til genom instabilitet og kanskje med akkumulert miss-avfyring av DNA replikasjon med p53 slettinger /mutasjoner i over 50% av kolorektal tumorer. Tap av p53 i tykktarmssvulster bidrar ytterligere til genom instabilitet og akkumulerte mutasjoner. Fremtidige studier vil være nødvendig for å fullt ut forstå den molekylære og cellulære mekanismen for Orc6 i tykk- og endetarmskreft. Til tross for sin avgjørende rolle i den innledende monteringsplattform som er nødvendig for DNA-replikasjon, kan Orc6 ha et potensial som et nytt mål for kreft terapeutisk utvikling. Situasjonen kanskje lik 26S proteasomet som et mål for antistoffet medikament bortezomib. Opprinnelig var det tenkt at målretting 26S proteasomet er ikke en god strategi på grunn av sin allestedsnærværende rolle i protein degradering [23]. Siste rapporten fra Chen
et al.
Tyder på at Orc6 er unnværlig i DNA-bindende aktivitet av orkene i gjær. Dette støtter ytterligere vår forestilling om at målgruppe Orc6 i kolorektal kreft er en mulig strategi for fremtidig terapeutisk utvikling [24].
I konklusjonen, vi demonstrert i denne studien, at nedregulering av Orc6 i tykktarm kreft celler bevisstceller til 5-FU og cisplatin behandling. Sammen med våre tidligere studier som Orc6 ble svært overuttrykt i pasienter med kolorektal kreft, tror vi at Orc6 kan ha potensial som en roman kreft mål for fremtiden anti-tumor terapeutisk utvikling.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den menneskelige tykktarmskreftcellelinjer, HCT-116 (wt-p53) og HCT-116 (null-p53) celler var en gave fra professor Bert Vogel (The Johns Hopkins University, Baltimore, MD) , og ble opprettholdt i McCoys 5A medium (Gibco Laboratories). 5-FU og cisplatin ble kjøpt fra Sigma.
siRNA Transfeksjon
HCT-116 (wt-p53) og HCT-116 (null-p53) ble sådd i 6-brønns brett på en × 10
5cells /brønn og transfektert med oligofectamine, uspesifikke kontroll siRNA eller siRNA mot Orc6 på 100 nM konsentrasjon basert på produsentens protokoll (Invitrogen Inc.)
RNA Isolation
Total RNA ble isolert fra cellelinjer ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner på 24 timer etter transfeksjon med siRNA.
Western immunoblot analyse
Celler ble skrapt og lysert i RIPA-buffer (Sigma). Like mengder av proteinprøver (50 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE på 12% geler ved metoden til Laemmli, og overført til membraner polyvinylidenfluorid (PVDF) (Bio-Rad Laboratories). Membranene ble deretter blokkert med 5% fettfri melk i TBS-T (Tris-bufret saltvann og 0,5% Tween-20) ved romtemperatur i 1 time. Proteiner ble analysert med rotte anti-orc6 monoklonalt antistoff (1:1000 fortynning, Upstate Technology), mus anti-α-tubulin (1:1000 fortynning, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Ca), mus anti-p53 (1:1000 , Santa Cruz) etterfulgt av inkubasjon med et pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:1,000 fortynning, Bio-Rad, Hercules, CA). Proteinene ble visualisert med en chemiluminescence deteksjonssystem med Super Signal substrat (Pierce, Rockford, IL)
Sanntids QRT-PCR-analyse
cDNA syntesen ble utført med høy kapasitet cDNA syntese kit (Applied Biosystems) under anvendelse av 1 pg av total RNA som templat. PCR masterblanding som inneholder TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix (No Amperase UNG), 10 x TaqMan-analyse og RT-produkter i 25 ul volum ble behandlet som følger: 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 35 sek (n = 3). Signal ble samlet ved endepunktet for hver syklus. De genuttrykk verdier av Orc6 fra hver prøve ble beregnet ved å normal med internkontroll GAPDH og relative kvantiteringsstandarder verdier ble plottet.
Cell syklus analyse av flowcytometri
HCT-116 (wt-p53) og HCT-116 (null-p53) ble sådd i 6-brønns brett på
5cells 1 × 10 /brønn og transfektert med oligofectamine, uspesifikke kontroll siRNA eller Orc6 genet bestemt siRNA på 100 nM konsentrasjon. Celler ble behandlet med 5-FU (10 uM) i 12 timer og cellene ble høstet ved trypsin, vasket og merket med propidiumjodid, vasket og resuspendert i Krisham modifiserte buffer og filtrert for strømningscytometri-analyse (FACS BD Kaliber).
Hjelpemiddel Informasjon
data S1.
GeneOntology. Gene Expression og GeneOntology analyse av forskjellig uttrykt gener i kontroll og Orc6 knock-down HCT116 (wt-p53) celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004054.s001 plakater (2,77 MB TIF)
